薛喜娟，王 亮，羅莉?qū)帲鞃槑V，尚立宏

（甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046）

多殺性巴氏桿菌可引起牦牛出血性敗血癥，簡(jiǎn)稱(chēng)“牛出敗”，其臨床特征主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒顫、流涎、咳嗽、呼吸困難、食欲廢絕等，慢性經(jīng)過(guò)表現(xiàn)為皮下組織、關(guān)節(jié)及各臟器化膿性炎癥[1-3]。該病多呈散發(fā)性或地方流行性特點(diǎn)，主要發(fā)生在牦牛飼養(yǎng)集中的高寒缺氧地區(qū)，一年四季均可發(fā)生，但秋冬季節(jié)發(fā)病較多[4-7]。通過(guò)調(diào)查2018—2021年甘肅省甘南州牦牛巴氏桿菌病發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)該地牦牛多殺性巴氏桿菌病危害依然嚴(yán)重，4年間累計(jì)發(fā)生牦牛多殺性巴氏桿菌病29起，易感動(dòng)物共2 100頭，發(fā)病260頭，病死62頭，病死率達(dá)23.85%，其中碌曲縣發(fā)病達(dá)14起，發(fā)病動(dòng)物199頭，病死47頭，病死率達(dá)23.62%（表1）。本文通過(guò)對(duì)2020年9月甘南州碌曲縣某村發(fā)病牦牛進(jìn)行疾病診斷及治療，發(fā)現(xiàn)抗生素耐藥已經(jīng)在牧區(qū)廣泛存在，必須以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，合理規(guī)范用藥，同時(shí)交叉用藥，防止耐藥性產(chǎn)生[3]。

表1 2018—2021年甘南州牦牛巴氏桿菌病發(fā)病情況

1 發(fā)病情況

2020年9月下旬，甘南州碌曲縣某散養(yǎng)戶(hù)養(yǎng)殖的部分牦牛出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱、咳嗽和腹瀉等癥狀，多為中等偏下膘情母牛發(fā)病。3 d內(nèi)死亡4頭，用青、鏈霉素和磺胺類(lèi)藥物治療效果差，病情反復(fù)。為查明病原，更好地治療和預(yù)防該病，采集死亡牦牛的病料進(jìn)行分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。

2 臨床癥狀及剖檢病變

發(fā)病牦牛大多精神不振、被毛粗亂、鼻鏡干燥，采食下降或不食，反芻減弱。有的出現(xiàn)咳嗽、腹瀉、頭頸腫大、呼吸困難等癥狀。多呈急性經(jīng)過(guò)，體溫持續(xù)升高，可達(dá)41～42 ℃。3 d內(nèi)死亡4頭，其中1頭未見(jiàn)明顯癥狀，突然死亡；其余3頭呼吸高度困難，反芻停止，皮膚及可視黏膜發(fā)紺，眼角膜潮紅，伴有較多分泌物，鼻流帶血泡沫或膿性分泌物，舌伸出齒外，呈暗紅色。聽(tīng)診有支氣管呼吸音及啰音。剖檢可見(jiàn)病牛頸部、咽部及胸前皮下組織漿液性浸潤(rùn)伴有出血點(diǎn)，氣管內(nèi)點(diǎn)狀出血，淋巴結(jié)水腫出血，胸腔積液有纖維素性沉著，肺腫大，心包積液較為嚴(yán)重。

3 細(xì)菌分離鑒定及動(dòng)物接種試驗(yàn)

3.1 試驗(yàn)材料

3.1.1主要試劑 普瓊培養(yǎng)基、血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、瑞氏染色液、藥敏紙片、微量生化管，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

3.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18～22 g健康小鼠，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

3.2 試驗(yàn)方法及結(jié)果

3.2.1病料涂片鏡檢 無(wú)菌采集死亡牦牛肝、肺、脾病料制作觸片，革蘭氏染色可見(jiàn)大量革蘭氏陰性菌；瑞氏染色可見(jiàn)兩級(jí)濃染的橢圓形有莢膜的球桿菌。

3.2.2細(xì)菌分離培養(yǎng) 將病料接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，可見(jiàn)露滴樣灰白色小菌落，半透明、不溶血、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)。挑選典型的單個(gè)可疑菌落進(jìn)行純化，純化后分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。菌落在麥康凱瓊脂平板上未生長(zhǎng)。將營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物革蘭氏染色后鏡檢，可見(jiàn)大量紅色球狀小桿菌。

3.2.3生化試驗(yàn) 將純培養(yǎng)物分別接種于蔗糖、乳糖等9種微量生化管中，37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察結(jié)果可見(jiàn)（表2），蔗糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、硫化氫陽(yáng)性，乳糖、麥芽糖、鼠李糖、山梨醇均為陰性。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.2.4動(dòng)物接種試驗(yàn) 取健康小鼠10只，平均分為5組，碾磨病料至糊狀，0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1∶10稀釋?zhuān)骨蛔⑸淝?組小鼠（0.5 ml/只）。第5組設(shè)為對(duì)照組。接種18～24 h后，第1～4組小鼠全部死亡，對(duì)照組未見(jiàn)死亡。剖檢死亡小鼠，可見(jiàn)皮下結(jié)締組織膠樣浸潤(rùn)，肝、脾腫大，淤血，有出血點(diǎn)。胸腔含有大量黃色漿液纖維素性滲出物[3]。無(wú)菌采取死亡小鼠心血及肝脾作涂片鏡檢和分離培養(yǎng)。組織觸片和血涂片革蘭氏染色及瑞氏染色鏡檢結(jié)果與發(fā)病牦牛鏡檢結(jié)果一致，為紅色小桿菌，瑞氏染色可見(jiàn)兩端濃染。接種血瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，長(zhǎng)出半透明、不溶血、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的露滴樣灰白色小菌落，與攻菌病料培養(yǎng)特性相同。

3.3 分析

死亡牦牛臨床癥狀符合多殺性巴氏桿菌引起的發(fā)熱、寒顫、流涎、咳嗽、呼吸困難、食欲廢絕等主要癥狀；病理剖檢病變符合多殺性巴氏桿菌剖檢病變。

病料細(xì)菌分離鏡檢可見(jiàn)革蘭氏陰性菌，瑞氏染色符合兩級(jí)濃染的特性；菌落形態(tài)可見(jiàn)露滴樣灰白色小菌落，半透明、不溶血、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)。生化試驗(yàn)符合巴氏桿菌特性。以上特征符合多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)特性及生化指標(biāo)。

攻毒試驗(yàn)致小鼠死亡，死亡小鼠剖檢病變及鏡檢結(jié)果符合目的菌特征。

綜合以上結(jié)果判斷，臨床癥狀、剖檢病變以及病原菌分離培養(yǎng)特性等均符合多殺性巴氏桿菌特征，確診該病為多殺性巴氏桿菌引起的牦牛出血性敗血癥。

4 藥敏試驗(yàn)

參照WS/T 639-2018《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求》，采用藥敏紙片擴(kuò)散法，測(cè)定此次分離的巴氏桿菌藥物敏感性。結(jié)果表明：此次分離的巴氏桿菌對(duì)氨芐青霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星和強(qiáng)力霉素高敏，對(duì)慶大霉素和卡那霉素中敏，對(duì)青霉素G、鏈霉素和復(fù)方新諾明低敏。

5 治療

隔離病牛，對(duì)其余健康牛群緊急免疫。對(duì)發(fā)病牛群肌肉注射頭孢噻肟、氨芐青霉素和恩諾沙星等高敏感性抗菌藥物，1～2次/d，必要時(shí)兩種抗菌藥一起用以加強(qiáng)療效。治療過(guò)程中給予清潔飲水和易消化的飼料，同時(shí)口服電解多維。5～7 d后，大部分病?？祻?fù)，無(wú)新增死亡病例，疫情得到控制。

6 討論

牦牛多殺性巴氏桿菌病感染率較高，已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國(guó)牦牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。巴氏桿菌屬于條件性致病菌，在健康牦牛呼吸道內(nèi)長(zhǎng)期存在，通常由內(nèi)源性感染引發(fā)[8]，如氣候劇變、長(zhǎng)途運(yùn)輸、營(yíng)養(yǎng)不良、換料、疲勞、寄生蟲(chóng)感染等應(yīng)激因素容易導(dǎo)致該病發(fā)生[9-10]。也可通過(guò)直接接觸患牛排泄物、分泌物等污染的草場(chǎng)、飼料、用具等發(fā)生感染[11]。此次疫情發(fā)生時(shí)間在9月下旬，正處于高原氣候季節(jié)性變化時(shí)間，因此建議養(yǎng)殖場(chǎng)（戶(hù)）在氣候多變季節(jié)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意補(bǔ)充精料、微量元素和維生素，減少擠奶頻次，降低牦牛應(yīng)激。發(fā)生此類(lèi)疫病最有效的治療方法是抗生素治療，但隨著抗生素的濫用導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌耐藥問(wèn)題日漸凸顯[12]。因此建議治療以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，合理規(guī)范用藥，同時(shí)交叉用藥，避免耐藥性產(chǎn)生。由于巴氏桿菌可感染人，飼養(yǎng)人員和獸醫(yī)還需做好自身防護(hù)，避免感染。

除了治療外，應(yīng)采取綜合防控措施。要堅(jiān)持預(yù)防為主的原則，定期開(kāi)展疫苗免疫接種。免疫接種注意區(qū)分不同體重牦牛免疫接種劑量，盡可能確保接種效果[13]。要開(kāi)展劃區(qū)輪牧，結(jié)合牧民放牧習(xí)慣和疫病防控需要，將放牧牦牛群劃分為“兩大四小”牧場(chǎng)輪牧。兩個(gè)大區(qū)即夏秋、春冬牧場(chǎng)，四個(gè)小區(qū)即在兩個(gè)大區(qū)中按每年春、夏、秋、冬四季劃分。要充分利用高原紫外線殺菌、牦牛排泄物發(fā)酵殺菌等自然途徑預(yù)防本病，夏秋季節(jié)還應(yīng)注意避開(kāi)過(guò)度陰濕草場(chǎng)放牧。對(duì)已經(jīng)發(fā)生疫情的圈舍及時(shí)開(kāi)展圈灘場(chǎng)地消毒工作，并及時(shí)開(kāi)展病死牦牛尸體、排泄物、乳、乳制品無(wú)害化處理工作[14]。