李 梁 李春霖 王貞紅 劉振東 聶 晶 張永志 袁玉偉,*

(1 西藏農牧學院食品科學學院/西藏特色農牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏 林芝 860000；2 浙江省農業(yè)科學院農產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所/農業(yè)農村部農產(chǎn)品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021；3 西藏農牧學院資源與環(huán)境學院，西藏 林芝 860000)

我國西藏人民飲茶歷史悠久，茶葉對于藏區(qū)人民的日常飲食起著重要作用[1]。過去西藏茶葉產(chǎn)量較低，主要依賴從四川等地運輸。近年來，西藏高度重視茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展，把茶產(chǎn)業(yè)作為促進經(jīng)濟發(fā)展和助推脫貧攻堅的重要產(chǎn)業(yè)之一[2]。西藏茶葉主產(chǎn)于林芝市，2019年林芝市茶園種植面積為4.5萬畝，2020年春季干毛茶產(chǎn)量約1.55萬公斤，帶動1 400余人人均增收3 445元，茶產(chǎn)業(yè)已成為西藏人民致富的“金葉子”[3]。西藏主要生產(chǎn)紅茶、綠茶和黑茶類產(chǎn)品，由于高海拔和獨特的地理環(huán)境，西藏茶葉品質較優(yōu)，香氣豐富，滋味醇厚，具有高原特色。然而，西藏茶葉的產(chǎn)地特征尚不清楚，市場中可能出現(xiàn)的假冒標識問題，對西藏茶葉的貿易公平和品牌保護產(chǎn)生不利影響。因此，挖掘西藏茶葉的產(chǎn)地特征，開展溯源機理研究對西藏茶葉質量監(jiān)管和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

植物穩(wěn)定同位素值(δ13C、δ15N、δ2H和δ18O)與栽培地的氣候環(huán)境和栽培方式等因素密切相關[4-5]。已有研究表明，茶葉中穩(wěn)定同位素存在一定的地域差異，具有特征指示性。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，浙江和山東茶葉中穩(wěn)定同位素比率有明顯差異，結合多元素和化學計量學方法，能夠對產(chǎn)地進行有效判別。Jin等[7]分析了福建安溪和武夷山茶葉中穩(wěn)定同位素比率，發(fā)現(xiàn)兩地樣品差異顯著。植物穩(wěn)定同位素在不同地域表現(xiàn)的差異主要是由環(huán)境和氣候因子的變化導致的，這些因子通過調控植物生理過程從而引起同位素特征發(fā)生改變[8]。目前已有相關研究探索農產(chǎn)品中穩(wěn)定同位素與環(huán)境因子的關聯(lián)性。如Camin等[9]測定了意大利葡萄酒樣本的穩(wěn)定同位素比率和環(huán)境氣候因子，發(fā)現(xiàn)δ18O值與氣候和地理位置信息相關性最強；Akamatsu等[10]統(tǒng)計分析了日本水稻中δ13C和δ18O值與環(huán)境因子之間的關系，結果表明灌漿期的日最低氣溫是影響大米同位素的主要因素；Wang等[11]研究了氣候、地形和土壤等生長環(huán)境對香蕉同位素組成的影響，發(fā)現(xiàn)降水和氣溫對δ18O值影響較大。已有研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中穩(wěn)定同位素受到環(huán)境溫度和光照強度的影響[12]，δ2H值與氣溫、光照和降水量呈現(xiàn)顯著相關性[13]。上述研究對探索茶葉同位素特征與環(huán)境因子關系具有一定的借鑒意義。

西藏茶葉作為我國特色農產(chǎn)品，其產(chǎn)地同位素特征和環(huán)境影響因素尚不明確。本研究通過分析西藏不同海拔地區(qū)茶葉的同位素特征，研究西藏茶葉與我國四大主產(chǎn)區(qū)(江北茶區(qū)、江南茶區(qū)、華南茶區(qū)、西南茶區(qū))茶葉的同位素差異，挖掘環(huán)境因子對茶葉中同位素的影響，旨在為西藏茶葉品牌保護提供技術支撐和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗材料為93份茶葉樣品，收集于2017年4月，來自全國12個省，包括27個地市及自治州，覆蓋我國江北(山東、陜西)、江南(安徽、浙江)、華南(福建、廣東、海南)和西南(貴州、四川、云南、重慶)四大茶區(qū)，其中江北茶區(qū)樣品9個、江南茶區(qū)樣品21個、華南茶區(qū)樣品15個、西南茶區(qū)樣品30個。西藏自治區(qū)樣品18個，取自林芝市不同海拔的3個取樣點，其中低海拔(750 m)樣品5個、中海拔(1 250 m)樣品8個、高海拔(2 120 m)樣品5個。所有樣品均于2017年春季按照綠茶工藝加工制成。樣品分布情況見圖1。

圖1 樣品分布及氣象信息收集圖Fig.1 Collection map of tea samples and climate information

穩(wěn)定同位素標準物質：IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB= -10.45‰±0.03‰)、IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.30‰±0.20‰)，購于國際原子能機構(international atomic energy agency, IAEA，奧地利)；B2155(酪蛋白，δ13CV-PDB=-26.98‰±0.13‰，δ15Nair=5.94‰±0.08‰)，購于英國Elemental Microanalysis公司；USGS64(甘氨酸，δ13CV-PDB=-40.81‰±0.04‰)、USGS40(δ15Nair=-4.52‰±0.06‰)、USGS54(加拿大松，δ2HV-SMOW=-150.40‰±1.10‰，δ18OV-SMOW=17.79‰±0.15‰)、USGS56(南非紅象牙木，δ2HV-SMOW=-44.0‰±1.8‰，δ18OV-SMOW=27.23‰±0.03‰)，購于美國地質勘探局Reston同位素實驗室。

1.2 儀器與設備

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Vario PYRO cube、Vario Isotope cube型元素分析儀，Isoprime 100型、Biovision穩(wěn)定同位素比率質譜儀，德國Elementar公司；HR2864粉碎機，中國飛利浦電子公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 茶葉樣品烘干至含水量不變，經(jīng)粉碎機粉碎處理，過80目網(wǎng)篩，避光常溫保存，待測。

1.3.2 碳、氮穩(wěn)定同位素檢測 稱取茶葉樣品3.0～4.0 mg，放入錫箔舟中包樣，按順序放入元素分析儀固體樣品自動進樣盤。樣品中的碳、氮元素經(jīng)燃燒還原后分別轉化為純凈的CO2和N2氣體，進入同位素比率質譜儀進行檢測。元素分析儀的燃燒管主要填料為WO3,溫度保持1 150℃，還原管填料為Cu，溫度保持850℃，載氣為高純氦氣(He, 99.999%)，流量為250 mL·min-1，參考氣體為CO2和N2。元素分析儀和熱導檢測器(thermal conductivity detector, TCD)檢測流速分別為230 mL·min-1和40～50 mL·min-1。氧氣流量為40 mL·min-1，注氧時間70 s。C模式質譜參數(shù)：加速電壓為3 964 V，捕集電流為200 μA，磁場強度為4 000 mA；N模式質譜參數(shù)：加速電壓為4 162 V，捕集電流為400 μA，磁場強度為3 000 mA。樣品檢測前進行氣密性檢測、離子源真空度和穩(wěn)定性測試，CO2參考氣壓力為12 psi，N2參考氣壓力為5 psi。檢測方法參照文獻[6]和[13]。

1.3.3 氫、氧穩(wěn)定同位素檢測 稱取茶葉樣品0.5 mg，放入銀舟中包樣，按順序放入元素分析儀固體樣品自動進樣盤。樣品中的氫、氧元素經(jīng)高溫裂解后分別轉化為H2和CO氣體，進入同位素比率質譜儀進行檢測。元素分析儀裂解爐溫度保持1 450℃，氦氣吹掃流量為150 mL·min-1，參考氣體為CO和H2。H模式質譜參數(shù)：加速電壓為4 497 V，捕集電流為600 μA，磁場強度為890 mA；O模式質譜參數(shù)：加速電壓為 4 191 V， 捕集電流為200 μA，磁場強度為3 000 mA。樣品檢測前進行氣密性檢測、離子源真空度和穩(wěn)定性測試，H2參考氣壓力為20 psi，CO參考氣壓力為25 psi。檢測方法參照文獻[6]和[13]。

1.3.4 穩(wěn)定同位素比率計算

(1)

式中，R樣品為檢測樣品中重同位素與輕同位素豐度之比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O；R標準為國際標準品中重同位素與輕同位素豐度比[14]。測試數(shù)據(jù)均采用兩點法進行校正。

1.4 氣象信息采集

在試驗樣品采集點中，選取16個采樣點(圖1)進行氣象信息采集，涵蓋了西藏和我國茶葉主產(chǎn)區(qū)，收集當?shù)丨h(huán)境氣象信息，包括平均相對濕度、最小相對濕度、日降雨量、日照時間、平均氣溫、最高氣溫、最低氣溫，每個環(huán)境因子均包括采樣當月(2017年4月)和采樣前3個月(2017年1月至4月)的2組平均數(shù)據(jù)，共計14項環(huán)境數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析中的Duncan法對不同海拔樣品的同位素比率進行差異顯著性分析，采用Tamhane’s T2方法對不同產(chǎn)區(qū)樣品的同位素比率進行差異顯著性分析，在IBM SPSS Statistics 21軟件中進行。

通過偏最小二乘法(partial least squares，PLS)分別建立4種同位素比率與環(huán)境因子之間的關聯(lián)性模型，以樣品14項環(huán)境因子數(shù)據(jù)為自變量，穩(wěn)定同位素比率為因變量，建立定量預測模型。模型共包含16個樣本，隨機選取其中14個樣本為訓練集，2個樣本為預測集。模型結果根據(jù)所有樣品的決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(root mean square error，RMSE)和相對預測偏差(relative prediction deviation，RPD)表示，計算方法見公式(2)～(4)[15-16]。結合連續(xù)變量投影法進行變量重要性分析(variable importance for projection，VIP)，并計算自變量的標準化相關系數(shù)。PLS和VIP在XLSTAT 2019軟件中進行。

(2)

(3)

(4)

式中，N為樣品數(shù)量,ypred為同位素預測值,yref為同位素檢測值,yref為同位素檢測值的平均數(shù)，SD為同位素檢測值的標準差。

2 結果與分析

2.1 西藏不同海拔地區(qū)茶葉穩(wěn)定同位素特征

本研究共采集西藏茶葉樣品18份，穩(wěn)定同位素比率分析結果見表1。由于西藏海拔差異較大，樣品取自3個不同海拔的取樣點，不同海拔的樣品穩(wěn)定同位素比率差異整體顯著。δ13C隨海拔變化最為明顯，茶葉樣品中δ13C值隨海拔高度的升高而減小。低海拔地區(qū)(750 m)樣品δ13C值介于-28.8‰ ～ -27.8‰ 之間，平均值為-28.3‰；中海拔地區(qū)(1 250 m) 樣品δ13C值介于-30.1‰ ～ -28.9‰之間，平均值為-29.6‰；高海拔地區(qū)(2 120 m)樣品δ13C值介于-31.9‰ ～ -30.9‰之間，平均值為-31.2‰。δ15N 值在低海拔地區(qū)樣品中最高，平均值為3.0‰，顯著高于中海拔(0.9‰)和高海拔地區(qū)(0.0‰)的樣品。δ2H和δ18O隨海拔變化趨勢一致，均為低海拔樣品最高，分別為-48.8‰和27.3‰，中海拔樣品最低，分別為-100.9‰和23.4‰。

2.2 西藏茶葉與四大主產(chǎn)區(qū)茶葉穩(wěn)定同位素分布差異

西藏由于其獨特的地理位置，與我國茶葉主產(chǎn)區(qū)在環(huán)境氣候條件上差異明顯，穩(wěn)定同位素比率也呈現(xiàn)一定的特征差異。將西藏樣品分別與江北、江南、華南、西南(除西藏)四大主產(chǎn)區(qū)代表性樣品進行差異顯著性分析，結果見圖2。西藏樣品中δ13C值特征最為明顯，介于-31.9‰ ～ -27.8‰之間，平均值為-29.7‰，顯著低于其他主產(chǎn)區(qū)樣品。δ15N值介于-2.2‰ ～ 5.0‰之間，平均值為1.2‰，與其他產(chǎn)區(qū)樣品無顯著差異。δ2H值介于-111.5‰ ～ -40.5‰ 之間，平均值為-83.3‰，顯著低于西南、江南和江北產(chǎn)區(qū)樣品，與華南產(chǎn)區(qū)樣品無顯著差異。δ18O值介于22.2‰ ～ 27.6‰之間，平均值為25.3‰，顯著高于華南產(chǎn)區(qū)樣品，與其他產(chǎn)區(qū)樣品均無顯著差異。

注：**代表P<0.01，*代表P<0.05，ns代表P>0.05。Note: **represent P<0.01, * represent P<0.05, ns represent P>0.05.圖2 西藏與四大主產(chǎn)區(qū)茶葉中穩(wěn)定同位素箱線圖Fig.2 Boxplot of stable isotopes in tea samples from Tibet and four main producing area

2.3 茶葉穩(wěn)定同位素與環(huán)境因子關系模型

為探索西藏茶葉同位素特征形成的氣候環(huán)境影響，本研究選取西藏和我國茶葉主產(chǎn)區(qū)范圍內16個取樣點進行環(huán)境因子數(shù)據(jù)采集和茶葉同位素比率檢測，分別將δ13C、δ15N、δ2H、δ18O與14項環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行PLS分析，定量預測模型結果見表2。其中R2和RPD越高，RMSE越低，模型效果越優(yōu)[15-16]。4個模型的R2均高于0.55，RMSE均低于5.09，RPD介于1.51～3.08之間。δ2H模型預測效果最優(yōu)，R2和RPD均最高，分別為0.90和3.08，表明δ2H與14項環(huán)境因子關聯(lián)性更強。由于δ2H絕對值較其他同位素比率偏大，而RMSE受自變量絕對值影響，導致δ2H模型RMSE最高，為5.09。其次為δ13C模型，R2為0.84，RPD為2.63，RMSE最低，為0.48。δ18O模型R2為0.75，RMSE為0.64，RPD為2.13。δ15N模型預測效果最差，R2和RPD均最低，分別為0.55和1.51，RMSE為1.20，表明δ15N與14項氣候環(huán)境因子關聯(lián)性較弱。

表1 西藏不同海拔茶葉樣品穩(wěn)定同位素分布表Table 1 Distribution of stable isotopes in tea samples from Tibet with different altitudes /‰

對模型進一步進行變量重要性分析和標準化相關系數(shù)分析，VIP值大于1的環(huán)境因子對同位素比率影響較大[17]，結果見圖3。δ13C主要受日照和氣溫影響，重要性最高的3個因子為4月(采樣當月)日照時數(shù)、平均氣溫和最低氣溫，3個變量因子的標準化相關系數(shù)均為正值，表明這3個因子與δ13C成正相關。在δ15N預測模型中，4月日照時數(shù)、1-4月(采樣前3個月)日照時數(shù)和1-4月平均相對濕度影響較大。δ2H模型顯示，日照、氣溫和相對濕度均會對δ2H影響較大，VIP大于1的因子以相對濕度為主，VIP最高的3個因子分別為4月日照時數(shù)、1-4月最高氣溫和1-4月最小相對濕度。δ18O則主要受氣溫影響，VIP大于1的因子主要包括1-4月和4月的最高氣溫、平均氣溫和最低氣溫，6個因子的標準化相關系數(shù)均為負值，表明這6個因子與δ18O成負相關。

表2 偏最小二乘模型結果Table 2 Results of partial least squares models

圖3 基于偏最小二乘的變量重要性分析與標準化相關系數(shù)Fig.3 Variable importance for projection and standardized coefficients based on partial least squares

3 討論

3.1 環(huán)境因子對碳、氮穩(wěn)定同位素的影響

本研究結果發(fā)現(xiàn)，相較于其他同位素比率，西藏茶葉中δ13C值隨海拔變化規(guī)律最明顯，茶葉中δ13C值隨海拔升高而降低。經(jīng)PLS-VIP分析表明，δ13C值主要受采樣當月日照和氣溫影響，且δ13C值與日照時數(shù)和平均氣溫成正相關。而氣溫隨海拔的升高而降低，因此茶葉中δ13C值隨海拔的升高而降低。在西藏與四大主產(chǎn)區(qū)茶葉同位素比率比較研究中發(fā)現(xiàn)，西藏茶葉δ13C值顯著低于四大主產(chǎn)區(qū)茶葉。而西藏林芝市4月平均氣溫僅10℃，較其他主產(chǎn)區(qū)偏低。該結果與PLS分析中δ13C值與氣溫成正相關的結果一致。已有研究分析了廬山不同海拔茶樹光合響應的差異，結果表明茶樹在低海拔處的光合作用和光系統(tǒng)Ⅱ活性顯著低于高海拔處[18]。此外，氣溫和CO2濃度升高能夠明顯提高茶樹葉片的光合效率[19]，而光合作用與植物13C穩(wěn)定同位素分餾密切相關[20-21]，進一步解釋了茶葉δ13C值隨海拔升高而降低的原因。

經(jīng)單因素方差分析，西藏不同海拔樣品中δ15N值差異不如δ13C值明顯，而西藏與不同產(chǎn)區(qū)茶葉樣品中δ15N值差異不顯著，并且在PLS分析中δ15N值與環(huán)境氣象因子關聯(lián)性較弱。這說明相較其他同位素比率，δ15N值受氣候影響較小。已有研究表明，植物中δ15N值與栽培和土壤關系更為密切，主要受到栽培方式[22]、土壤類型[23]、根系情況[24]等多方面影響。本研究有待進一步收集西藏茶葉種植環(huán)境樣品，探究土壤背景、栽培方式以及肥料種類對茶葉同位素的影響。

3.2 環(huán)境因子對氫、氧穩(wěn)定同位素的影響

不同海拔茶葉樣品中δ2H和δ18O值分布規(guī)律較為一致，但西藏茶葉與主產(chǎn)區(qū)茶葉同位素比較中，δ2H和δ18O值分布規(guī)律有較大差異，推測與環(huán)境影響因素有關。已有研究表明，δ2H值與降雨、氣孔開合等密切相關，具有顯著的緯度效應、海拔效應和內陸效應[25]。本研究PLS結果表明，δ2H與環(huán)境氣象因子關聯(lián)性最強，利用14項環(huán)境因子能對δ2H進行定量預測。VIP結果顯示，光照、氣溫、濕度多種環(huán)境因素均會影響茶葉中δ2H值，VIP大于1的變量中以相對濕度為主。該結果與已有研究結果較為一致，如Deng等[13]利用同位素和多元素技術對我國綠茶進行產(chǎn)地溯源，探究了不同產(chǎn)地綠茶的同位素特征及其與氣候環(huán)境的相關性，發(fā)現(xiàn)茶葉中δ2H值與氣溫、光照和降水量相關性顯著；Liu等[26]研究了不同產(chǎn)地綠茶的穩(wěn)定同位素比率，發(fā)現(xiàn)湖北的綠茶樣品中δ2H和δ18O值顯著高于貴州和廣東省樣品，推測與環(huán)境相對濕度和蒸騰速率等因素有關。本研究PLS-VIP分析結果表明，氣溫是茶葉中δ18O值的主要影響因素，影響δ18O值的氣溫包括了采樣當月和采樣前3個月的平均氣溫、最低氣溫和最高氣溫。此外，除了氣溫對δ18O值的影響外，也已有研究表明植物纖維素中δ18O值與羰基和水之間的平衡同位素效應等因素相關[27]。

4 結論

本研究結果表明，西藏茶葉中穩(wěn)定同位素比率具有一定的海拔規(guī)律和區(qū)域特征，其中δ13C值特征最為明顯，隨海拔升高而降低，顯著低于其他主產(chǎn)區(qū)樣品。茶葉穩(wěn)定同位素比率均受到環(huán)境因子影響，其中δ2H值與氣象環(huán)境關聯(lián)性最強，主要與相對濕度等因素相關。在同位素特征分析的基礎上，后續(xù)研究可結合代謝組學、光譜學、質譜學等技術，進一步挖掘西藏茶葉品質特征，助力西藏茶葉品牌建設與推廣，推動西藏茶產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。