陳莉敏 李達(dá)旭,* 白史且 張 玉 毛德才 廖興勇 楊曉玲

(1 四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731；2 四川省林業(yè)和草原局，四川 成都 610081；3 成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611134；4 成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院，四川 成都 610100)

金花菜(MedicagopolymorphaL., bur clover)，又稱草頭[1]、南苜蓿[2]、肥田草等，屬豆科(Leguminosae)苜蓿屬(Midicago)一年生或越年生植物[3]，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，廣泛分布于歐洲、亞洲和非洲北部，在我國主要生長在長江流域以南，常為栽培或半野生狀態(tài)，適應(yīng)性良好[4]。金花菜生長迅速、營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量可達(dá)25%以上[5]，氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、微量元素豐富[6]，具有菜用、飼用、藥用、綠肥、邊坡綠化等多種用途。國外金花菜品種有Santiago、Serena、Scimitar、Cavalier、Armadillo[3]和Anglona[7]等，但均未引入國內(nèi)；我國現(xiàn)有淮揚(yáng)金花菜[8]、楚雄南苜蓿[9]、川南金花菜[3]3個(gè)品種，均為菜用和飼用品種。農(nóng)民可選擇的品種不多，藥用或具有抗逆特性的新品種研發(fā)進(jìn)展緩慢，育種途徑較為單一，種質(zhì)資源的匱乏限制了金花菜的育種及利用。利用現(xiàn)代育種技術(shù)開展金花菜育種研究，創(chuàng)制具有優(yōu)良性狀或抗逆特性的新材料，對豐富金花菜種質(zhì)資源多樣性，滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求具有積極的作用。

輻射育種是核技術(shù)農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重要領(lǐng)域。利用放射性同位素放出的射線(如α射線、γ射線)照射農(nóng)作物種子、植株或其他器官，使種子或植株發(fā)生遺傳變異，再經(jīng)過人工選種和培育，得到新的優(yōu)良品種[10]。目前，輻射誘變育種在植物突變品種培育和新資源創(chuàng)制等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[11]。60Co-γ射線輻射是植物誘變育種的常用方法，具有控制輻射條件便利、試驗(yàn)重演性好、育種效果良好等特點(diǎn)[12]，但仍鮮見有關(guān)金花菜輻射育種的相關(guān)研究。鑒于此，本研究以川南金花菜種子為材料，利用不同劑量的60Co-γ射線輻射金花菜種子，旨在了解60Co-γ射線對金花菜種子萌發(fā)和植株生長的影響，確定60Co-γ射線輻射金花菜的適宜劑量，為金花菜輻射育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為精選川南金花菜干種子，由四川省草原科學(xué)研究院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子輻射 2019年9月，將金花菜干種子送至四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻射場進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量為0(對照)、400、600、800、1 000、1 200 Gy，劑量率為2 Gy·min-1，每個(gè)處理共300粒，重復(fù)3次。

1.2.2 種子萌發(fā)效應(yīng) 將輻射處理的種子進(jìn)行表面消毒，采用培養(yǎng)皿濾紙發(fā)芽法，將種子均勻平鋪于帶有3層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，每皿50粒，重復(fù)3次，放置于恒溫培養(yǎng)箱中25±2℃培養(yǎng)，觀察種子14 d內(nèi)發(fā)芽情況。

1.2.3 植株生長效應(yīng) 將種子播種于育苗盤(540 mm×280 mm，32孔，每孔110 mL)中，每個(gè)處理播種96孔，每孔1粒，放置于四川省草原科學(xué)研究院成都市大邑縣韓場鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行田間培養(yǎng)，每天澆水1次，觀察植株出苗和生長情況。幼苗生長2個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。生長第3個(gè)月進(jìn)入分枝期，每個(gè)處理隨機(jī)選擇5株，測定株高和分枝數(shù)。2020年3月6日—4月18日植株進(jìn)入花期和結(jié)莢期，每個(gè)處理固定選擇5株，每周記錄株高、開花數(shù)量、結(jié)莢數(shù)量。4月19日—20日采收莢果。

1.2.4 輻射半致死劑量的確定 參考已有研究方法[13-14]，以金花菜種子在不同輻射劑量下幼苗的存活率為縱坐標(biāo)(y)，輻射劑量為橫坐標(biāo)(x)，擬合直線回歸方程y=a+bx，計(jì)算存活率為50%時(shí)對應(yīng)的輻射劑量，得到金花菜種子輻射的半致死劑量(the semi-lethal dose, LD50)。

1.3 分析方法

采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 22.0分析試驗(yàn)結(jié)果，對金花菜種子萌發(fā)率和植株生長指標(biāo)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，對金花菜開花和結(jié)莢數(shù)量采用重復(fù)測量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對金花菜種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，金花菜在發(fā)芽7 d內(nèi)發(fā)芽迅速，在10～14 d發(fā)芽速度變慢，經(jīng)60Co-γ射線輻射的種子發(fā)芽速度和發(fā)芽率均高于對照組(0 Gy)。在發(fā)芽第14天，5個(gè)處理組(400～1 200 Gy)的種子發(fā)芽率分別為89.58%、76.56%、73.96%、70.83%和64.06%，均高于對照組(62.5%)。400 Gy處理組的發(fā)芽率顯著高于對照組和1 000、1 200 Gy處理組(P<0.05)，發(fā)芽率隨著輻射劑量從400 Gy增加到1 200 Gy而逐漸降低。

2.2 60Co-γ射線輻射對金花菜幼苗生長的影響及半致死劑量(LD50)的確定

幼苗經(jīng)過2個(gè)月的生長，不同輻射劑量的幼苗生長情況不同(圖2)。觀察發(fā)現(xiàn)，高劑量輻射的種子出現(xiàn)不發(fā)芽或部分種子發(fā)芽后真葉發(fā)育受到抑制的現(xiàn)象；高劑量輻射存活的植株矮小；輻射植株葉片出現(xiàn)花葉、復(fù)葉增加1～2片、葉片畸形的現(xiàn)象，但無明顯規(guī)律。

對存活率的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(表1)，對照組和2個(gè)低劑量組(400、600 Gy)的金花菜幼苗存活率分別為69.79%、69.27%和71.88%，高劑量組(800～1 200 Gy)的存活率分別是21.88%、20.31%、19.27%，低劑量組的幼苗存活率顯著高于高劑量組。存活率和輻射劑量的線性回歸方程為y=-0.0534x+80.992(R2=0.713)，將成活率50%代入方程，計(jì)算得出金花菜種子輻射的LD50為580 Gy。

幼苗株高的結(jié)果分析顯示，各處理(0～1 200 Gy)幼苗平均株高分別為10.45、9.41、9.10、7.33、6.67、6.06 cm，對照組幼苗株高最高，對照組和低劑量組的幼苗株高顯著高于高劑量組。

對分枝數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，對照組和400 Gy處理組的分枝數(shù)分別為4.50和5.30，高于其他處理，二者間無顯著性差異，分枝數(shù)隨著輻射劑量的增加而減少。

2.3 輻射劑量與生長指標(biāo)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表2)，輻射劑量與幼苗存活率、株高和分枝數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為-0.815、-0.704、-0.504。株高與分枝數(shù)和存活率存在顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)分別為0.416和0.805，發(fā)芽率與分枝數(shù)、存活率為正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)分別為0.323和0.338，但無顯著性。

圖2 不同輻射劑量對金花菜生長的影響(分枝期)Fig.2 Effect of different radiation doses on the growth of bur clover(branching period)

表1 60Co-γ輻射對金花菜幼苗生長影響Table 1 Effect of 60Co-γ radiation treatments on the seedling growth of bur clover

表2 相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis

2.4 60Co-γ射線輻射對金花菜開花和結(jié)莢的影響

金花菜多在秋季種植，一般在次年3月初開花，整個(gè)花期持續(xù)約40 d，邊開花邊結(jié)果，一般在植株距離地面1/3處莢果變黑時(shí)整株采收種子。

重復(fù)測量分析結(jié)果顯示，時(shí)間和輻射劑量均對開花數(shù)量有顯著性影響(P<0.05)，且時(shí)間和輻射劑量存在顯著交互作用。由表3可知，除800 Gy處理組外，其他處理植株的開花數(shù)量均在第2次記錄時(shí)(D7，即3月14日)達(dá)到最大值，0～1 200 Gy的開花數(shù)量分別達(dá)到484、548、587、287、568、493，D14后開花數(shù)量逐漸下降；到最后一次記錄時(shí)(D42，即4月18日)，對照組、800 Gy、1 000 Gy和1 200 Gy處理組植株開花數(shù)量均為0，400 Gy和600 Gy處理組開花數(shù)量分別為46和94。400 Gy和600 Gy處理組金花菜開花數(shù)量在整個(gè)花期均高于對照，600 Gy處理組金花菜開花數(shù)量在第7～第28天為最高。

對結(jié)莢數(shù)量的重復(fù)測量分析結(jié)果顯示，時(shí)間和輻射劑量對結(jié)莢數(shù)量影響顯著(P<0.05)，且時(shí)間和輻射劑量存在顯著交互作用。由表4可知，各處理結(jié)莢數(shù)量隨著時(shí)間逐漸增加，D35時(shí)，0～1 200 Gy各處理的結(jié)莢數(shù)量分別達(dá)到為508、547、588、420、438、423，低劑量(0～600 Gy)結(jié)莢數(shù)量相對較高，但差異不顯著；最后一次記錄(D42)顯示，400～800 Gy處理組結(jié)莢數(shù)量分別為577、648和485，對照組、1 000 Gy和1 200 Gy處理組莢果全部掉落，高劑量組植株比低劑量組提前一周枯黃。

表3 不同輻射劑量對金花菜開花數(shù)量的影響Table 3 Effect of different radiation treatments on flowers number of bur clover

表4 不同輻射劑量處理對金花菜結(jié)莢數(shù)量的影響Table 4 The effect of different radiation treatments on pods number of bur clover

3 討論

輻射誘變選育新牧草品種能提高變異頻率、加速育種過程、獲得某些優(yōu)良性狀[15]，可以用于培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的草類植物新品種。低毒小冠花新品系、科輻系特早熟沙打旺(科輻一號、科輻二號、科輻六號)都是牧草輻射誘變育種取得的優(yōu)良突變材料[16]，Tift-Eagle狗牙根和Tift-94狗牙根是草坪草輻射誘變育種的代表品種[17]，這些品種的推廣應(yīng)用效果良好，推動(dòng)了草業(yè)相關(guān)育種研究的發(fā)展。

耿興敏等[18]利用0～250 Gy的60Co-γ輻射不同品種的桂花種子，發(fā)現(xiàn)60Co-γ輻射劑量總體上與桂花種子發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；李波等[19]利用600～1 800 Gy對苜蓿種子輻射，發(fā)現(xiàn)苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢均隨輻射劑量的增加呈下降趨勢。本試驗(yàn)中，輻射劑量和發(fā)芽率整體上為負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與前人研究結(jié)果一致，但并未達(dá)到顯著相關(guān)水平；與前人研究不同的是金花菜種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出先升后降的規(guī)律，輻射處理的種子發(fā)芽率均高于對照，說明一定劑量范圍的60Co-γ輻射能提高種子發(fā)芽率。

本研究結(jié)果顯示，輻射劑量與幼苗存活率、株高、分枝數(shù)均為顯著負(fù)相關(guān)。劉友接等[20]、李秀芬等[21]、劉春貴等[22]都認(rèn)為低劑量輻射可以提高植物種子發(fā)芽率和存活率；Beyaz[23]研究發(fā)現(xiàn)低劑量輻射還可以提高幼苗對鹽和干旱脅迫的耐受性，高劑量輻射抑制發(fā)芽，對植株生長不利。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，但劑量不同，Beyaz對箭筈豌豆的低輻射劑量界定在100 Gy以內(nèi)，本研究金花菜的低劑量輻射在600 Gy以內(nèi)。具體而言，400 Gy對金花菜幼苗存活率、株高和分枝數(shù)都有較好的促進(jìn)作用，600 Gy對幼苗存活率和株高也有較好促進(jìn)作用，超過600 Gy的輻射劑量降低了金花菜幼苗存成活率，導(dǎo)幼苗致植株矮小，分枝數(shù)減少，甚至出現(xiàn)真葉枯黃、植株死亡等現(xiàn)象，呈現(xiàn)顯著的抑制作用，說明低劑量(≤600 Gy)輻射促進(jìn)金花菜生長，而高劑量(>600 Gy)對金花菜生長的抑制作用明顯。

前人關(guān)于水果和花卉育種應(yīng)用的研究發(fā)現(xiàn)60Co-γ輻射會(huì)造成開花時(shí)間推遲、花色變化[24]，改變莢果形態(tài)、產(chǎn)量、顏色等性狀[25]。本試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)花色、莢果形態(tài)和顏色的明顯變化，但由金花菜開花數(shù)量和結(jié)莢數(shù)量的變化趨勢可知，輻射對金花菜開花和結(jié)莢數(shù)量有影響，600 Gy的輻射量可提高開花、結(jié)莢數(shù)量，超過600 Gy的輻射量對開花和結(jié)莢的抑制作用明顯。

60Co-γ射線可能抑制植株生長或引起植株死亡[26]，在誘變育種中，LD50是輻射適宜劑量選擇的依據(jù)[27-28]，也是開展大量突變體誘變研究的基礎(chǔ)[29]。不同植物之間、同一植株不同器官間，對60Co-γ輻射的耐受力和反應(yīng)不同，LD50也不同。相關(guān)牧草輻射研究表明，無芒雀麥干種子LD50為100～150 Gy[30]，三葉草種子輻射的LD50為792 Gy[31]，高羊茅種子LD50為100～150 Gy，高羊茅分化苗的LD50為20～25 Gy[32]。本研究以幼苗存活率計(jì)算LD50，得到金花菜干種子的LD50為580 Gy，劑量率為2 Gy·min-1。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ輻射對金花菜種子的輻射效應(yīng)明顯。400 Gy輻射劑量可顯著提高種子發(fā)芽率；當(dāng)輻射劑量低于600 Gy時(shí)，輻射能促進(jìn)金花菜種子萌發(fā)、生長和結(jié)實(shí)；當(dāng)劑量高于600 Gy時(shí)，隨著輻射劑量的增加，植株的生長和結(jié)實(shí)受到抑制。金花菜種子適宜的LD50為580 Gy，劑量率為2 Gy·min-1。