馬立軍， 徐瑋劭， 劉 欣， 盧娉婷， 許金松， 馮銳鴻

(華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 廣州 510006)

氟元素廣泛存在于自然界中，是生物代謝過程中必需的微量元素之一[1-2]。適當(dāng)攝入氟元素對預(yù)防蛀牙和治療骨質(zhì)疏松癥至關(guān)重要，也有利于神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)和酶系統(tǒng)的正?；顒覽3]。人體內(nèi)氟元素的最佳水平通常是通過牙膏、飲用水、食物和其他氟化物補(bǔ)充劑來維持的。然而，攝入過量的氟元素，會導(dǎo)致代謝紊亂、骨骼疾病、牙齒斑點(diǎn)、腎結(jié)石等[4-5]。因此，開發(fā)能夠選擇性識別F-的方法是非常必要的。

熒光探針因操作簡單、選擇性高、靈敏度高，而被應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、化學(xué)分析、醫(yī)學(xué)診斷等各個領(lǐng)域，是一種很有前景的檢測方法[6-7]。近年來，一些F-熒光探針被相繼報道。但由于F-的富電性使其具有很強(qiáng)的親核能力，水合能強(qiáng)，所以在含水體系中檢測F-具有很大的挑戰(zhàn)性，這也是目前F-探針領(lǐng)域所面臨的共性難題[8-10]。F-探針的設(shè)計(jì)思路主要包括基于氫鍵的去質(zhì)子化、氟硼絡(luò)合和化學(xué)劑量計(jì)法等，其中，化學(xué)劑量計(jì)法是基于特定的陰離子誘導(dǎo)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的，通常涉及共價鍵的斷裂和形成，屬于反應(yīng)型探針。F-具有觸發(fā)Si—O鍵斷裂而發(fā)生脫硅化反應(yīng)的能力，一些基于F-促進(jìn)Si—O鍵斷裂的熒光探針已經(jīng)被報道[11-13]。但此類探針分子設(shè)計(jì)具有一定的難度，一方面要考慮識別檢測環(huán)境能否滿足脫硅化反應(yīng)所需的基本條件；另一方面還需考慮探針分子上具有其他一些F-的結(jié)合位點(diǎn)，以便增強(qiáng)探針與F-的結(jié)合進(jìn)而產(chǎn)生化學(xué)劑量計(jì)法。

咔唑作為一種重要的含氮雜環(huán)化合物，它的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)和剛性平面結(jié)構(gòu)使其具有較大的π電子共軛程度，熒光效率高，在許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[14]。本文選用咔唑作為熒光基團(tuán)獲得了一種基于脫硅化反應(yīng)的化學(xué)劑量計(jì)法F-熒光探針。采用4-羥基咔唑與叔丁基二甲基氯硅烷反應(yīng)獲得了一種含Si—O鍵的F-熒光探針(HCTC)，F(xiàn)-的存在能夠促使分子中Si—O鍵斷裂，從而增強(qiáng)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)的強(qiáng)度，導(dǎo)致咔唑基團(tuán)的熒光開啟現(xiàn)象[15-16]。HCTC對F-具有高選擇性、高靈敏度，以及響應(yīng)速度快、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，同時還可以被制備成試紙用于水體系中F-的熒光檢測，這為檢測F-提供了一種有效的手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

主要儀器：熒光分光光度計(jì)(F-4600，日本島津)、紫外-可見分光光譜儀(UV-2700，日本島津)、核磁共振波譜儀(NMR Systems 600 MHz，美國瓦里安)、高分辨質(zhì)譜儀(solanX 70 FT-MS，德國布魯克)。

主要試劑：4-羥基咔唑(百靈威公司)、叔丁基二甲基氯硅烷(百靈威公司)、咪唑、二氯甲烷、乙腈、二甲基亞砜等，均為分析純，市售。

1.2 HCTC的合成與表征

本實(shí)驗(yàn)利用4-羥基咔唑和叔丁基二甲基氯硅烷合成HCTC，其合成路線如圖1 所示[17-18]。

將4-羥基咔唑(0.184 g，約1.0 mmol)和咪唑(0.225 g，約2.0 mmol)分別溶于4.0 mL二氯甲烷后置于圓底燒瓶中，然后緩慢滴加溶解后的叔丁基二甲基氯硅烷(0.226 1 g，約1.5 mmol)，隨即出現(xiàn)大量白色懸濁物，將混合物于室溫下攪拌約5 h。用適量去離子水洗滌反應(yīng)混合物3次后用真空泵抽濾，收集濾液中的有機(jī)層，加入無水 MgSO4干燥，再用真空干燥法除去溶液中的有機(jī)溶劑，所得的粗產(chǎn)物用洗脫劑(石油醚與二氯甲烷體積比為1∶1 )經(jīng)柱層析進(jìn)一步純化后置于真空干燥箱中烘干，得到白色粉末0.114 2 g，產(chǎn)率38.4%。HCTC的1H NMR(600 MHz，acetonitrile-d3)的化學(xué)位移(δ)分別為：9.26 (d,J= 48.8 Hz, 1H),8.27～8.25(m,1H),7.47～7.45(m,1H),7.36(ddd,J=8.2,7.2,1.2 Hz,1H),7.24(t,J=7.9 Hz,1H),7.17(td,J=7.6,1.0 Hz,1H),7.11～7.09(m,1H),6.67(dd,J=7.8,0.6 Hz,1H),1.08～1.07(m,9H),0.36～0.35(m,6H)。HCTC的高分辨質(zhì)譜ESI-MS(m/z)測量結(jié)果為297.154 0，而理論計(jì)算C18H23NOSi的相對分子質(zhì)量為297.154 9。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，所獲得的產(chǎn)物為目標(biāo)分子。

2 結(jié)果與討論

2.1 HCTC對F-的熒光識別

在365 nm激發(fā)波長下，向20.0 μmol/L探針HCTC的乙腈待測液中加入不同濃度的F-(0.0～180.0 μmol/L)。如圖2所示，隨著F-濃度的增大，HCTC在波長433 nm處出現(xiàn)了1個新的熒光發(fā)射峰并不斷增強(qiáng)。在365 nm波長紫外燈下照射下，加入F-后的溶液顯示出很強(qiáng)的藍(lán)紫色熒光(圖2插圖下)，這可能是由于氧硅鍵的斷裂導(dǎo)致氧負(fù)離子裸露，導(dǎo)致ICT效應(yīng)增強(qiáng)[15]。此外，HCTC在波長433 nm處的熒光強(qiáng)度與F-的濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(圖2插圖上)。

圖2 HCTC對F-的熒光響應(yīng)特性

分別測試了HCTC測試液(20.0 μmol/L)以及其加入140.0 μmol/L 的F-后在波長433 nm位置的熒光發(fā)射強(qiáng)度與隨時間變化的強(qiáng)度-時間曲線(圖3)。加入F-前，空白探針的熒光強(qiáng)度很低，且基本不隨時間變化。而加入F-后，HCTC的熒光變化趨勢表現(xiàn)為先快速增長后開始下降，9 min后熒光強(qiáng)度基本趨于穩(wěn)定，該探針在設(shè)定的測試條件下響應(yīng)速度相對較快[19-20]，熒光穩(wěn)定性較好?；谠搶?shí)驗(yàn)結(jié)果，在測定HCTC對離子的熒光響應(yīng)時，配置好溶液并放置9 min后進(jìn)行測量。

圖3 HCTC溶液中加入140.0 μmol/L F-前后的熒光強(qiáng)度掃描曲線

2.2 HCTC識別F-的選擇性和抗干擾性能

圖4 不同陰離子對HCTC熒光探針的干擾性

2.3 HCTC與F-的結(jié)合比和結(jié)合常數(shù)

為了探究HCTC與F-的結(jié)合模式，通過Job’s plot曲線法[21]來確定探針與F-之間的結(jié)合比(圖5)。固定HCTC與F-的總濃度為20.0 μmol/L，不斷改變兩者的濃度比例并測試其熒光強(qiáng)度，對F-所占濃度比例[c(F-)/c(F-+探針)]作圖，得到其工作曲線。從圖中可以看出，F(xiàn)-的濃度為總濃度的0.5倍時，熒光強(qiáng)度變化值達(dá)到最大，因此確定HCTC識別F-的最佳結(jié)合比為1∶1。

圖5 不同濃度比對HCTC熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的影響

根據(jù)Benesi-Hildebrand方程[22]，結(jié)合熒光滴定光譜(圖2)和圖5的工作曲線，計(jì)算結(jié)合常數(shù)Kobs，計(jì)算公式如下：

其中，I0表示溶液中空白探針HCTC(20.0 μmol/L)的熒光強(qiáng)度，I表示向探針溶液中加入F-后的熒光強(qiáng)度，Imax表示向探針溶液中加入F-后的最大熒光強(qiáng)度，結(jié)合常數(shù)Kobs通過1/(I-I0)與F-濃度倒數(shù)作圖的斜率來確定。如圖6所示，擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.997，表明HCTC與F-的結(jié)合較好地符合1∶1的模式，這與Job’s plot曲線法的結(jié)果一致。因此， HCTC與F-的結(jié)合比可確定為1∶1(物質(zhì)的量之比)。通過公式擬合得到結(jié)合常數(shù)Kobs約2.780×103L/mol，表明HCTC與F-的結(jié)合能力較強(qiáng)[23]。

圖6 在1∶1的結(jié)合模式下的擬合圖

2.4 HCTC識別F-的檢測限和紫外吸收光譜

檢測限是體現(xiàn)熒光探針靈敏度的一個重要指標(biāo)，查閱文獻(xiàn)[24]可知檢測限計(jì)算公式為：

Limit=3S/K，

其中，S表示空白探針溶液(20.0 μmol/L)在波長433 nm處的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K表示F-濃度與最大熒光發(fā)射峰強(qiáng)度擬合曲線的斜率。通過測試6組空白探針的熒光強(qiáng)度得到S=0.418 6。擬合曲線結(jié)果如圖7所示，擬合得到Kobs=5.98，通過計(jì)算得到HCTC檢測F-的檢測限為0.21 μmol/L，低于一些已報道的探針[1,4,12,23]，具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

圖7 HCTC的熒光強(qiáng)度與F-濃度變化的線性擬合圖

測試HCTC隨F-濃度變化的紫外-吸收光譜如圖8所示，20.0 μmol/L HCTC的乙腈待測液的紫外-可見吸收光譜在波長333 nm處的吸收峰為咔唑的特征吸收峰。向HCTC溶液中加入F-(0.0～200.0 μmol/L)，隨F-濃度的增加，溶液在350 nm處的紫外吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明HCTC與F-發(fā)生了明顯的相互作用。

圖8 HCTC隨F-濃度變化的紫外-吸收光譜

2.5 HCTC識別F-的機(jī)理分析

針對HCTC識別F-提出的機(jī)理如圖9所示，由于Si—O鍵的斷裂，受體裸露出氧負(fù)離子，p-π共軛作用使得受體電荷密度增加，分子處于富電子體系，從而增強(qiáng)了ICT效應(yīng)[17-18]，使基團(tuán)發(fā)生較強(qiáng)的熒光開啟現(xiàn)象并伴有輕微的紅移現(xiàn)象。

圖9 HCTC與F-作用時的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變機(jī)理圖

對HCTC識別F-進(jìn)行了核磁滴定實(shí)驗(yàn)(圖10)。先將HCTC溶于氘代乙腈溶液，測試其1H NMR譜，然后測試加入F-后的1H NMR圖譜。加入F-前，在δ=9.315、1.085 和0.364 位置分別有3個質(zhì)子峰，對應(yīng)歸屬為酰胺鍵質(zhì)子Hc、叔丁基Ha和二甲基上的質(zhì)子Hb。加入1 eq的F-后，由于F-對硅的強(qiáng)親核性，可切斷受體中的Si—O鍵，生成叔丁基二甲基氟硅烷，該分子脫離苯環(huán)后，甲基上質(zhì)子的屏蔽效應(yīng)減弱，故Ha與Hb都向高場移動。同時，由于酰胺鍵質(zhì)子Hc受到F-的強(qiáng)吸電子作用形成氫鍵，導(dǎo)致其質(zhì)子峰強(qiáng)度減弱并向低場移動。

圖10 HCTC加入F-前后的1H NMR譜

2.6 HCTC熒光試紙的制備和應(yīng)用

將HCTC制成熒光試紙，探究其檢測F-的實(shí)用性。首先，將定性濾紙剪成1.5 cm×2.5 cm的濾紙條，并將它們浸泡在HCTC的乙腈溶液中，5 min后取出晾干得到吸附了HCTC探針的試紙。然后，將它們分別浸入NaF的水/乙腈溶液(體積比9∶1)和四丁基氟化銨乙腈溶液中，1 min后取出晾干。在波長為365 nm的紫外燈光照射下進(jìn)行熒光成像(圖11)，只吸附了HCTC的試紙幾乎沒有明顯的發(fā)光現(xiàn)象，而浸入NaF的水/乙腈溶液和四丁基氟化銨的乙腈溶液的試紙均顯示了明亮的藍(lán)色熒光。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過將探針HCTC制備成熒光試紙，一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)含水體系中F-的檢測，改善了探針的檢測環(huán)境，同時實(shí)現(xiàn)了F-的快速便捷檢測。通過將探針HCTC與一些近些年已報道的F-熒光探針進(jìn)行對比(表1，圖12)，可以發(fā)現(xiàn)本文中的探針HCTC在靈敏度以及應(yīng)用性能上具有自身的特色。值得注意的是，本文報道的HCTC探針通過制備成熒光試紙能夠?qū)崿F(xiàn)水體系中F-的檢測，這是表1中其他文獻(xiàn)所不能實(shí)現(xiàn)的。

圖11 HCTC熒光試紙檢測F-的熒光顏色變化

表1 檢測F-熒光探針的性能比較

圖12 各類探針的分子結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

合成了一種以4-羥基咔唑作為熒光基團(tuán)的高選擇性反應(yīng)型F-探針HCTC。HCTC能夠?qū)-表現(xiàn)出熒光開啟識別現(xiàn)象，即F-能夠引起HCTC溶液的熒光光譜在波長433 nm處產(chǎn)生一個新的發(fā)射峰，且能夠?qū)Σ煌瑵舛菷-產(chǎn)生熒光響應(yīng)。HCTC還具有響應(yīng)速度快、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定以及較好的抗干擾能力等優(yōu)點(diǎn)。此外，HCTC熒光識別F-還具有高靈敏度，檢測限低至0.21 μmol/L，同時它還能夠被制備成試紙用于水溶液中F-的熒光檢測，顯示了一定的應(yīng)用潛力。