趙記龍，許大金, 任旭萌, 張勝偉

(河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 分子細胞生物學(xué)教育部重點實驗室,河北 石家莊 050024)

位于植物細胞膜表面的類受體激酶(receptor-like kinases,RLKs)在介導(dǎo)外界信號向細胞內(nèi)傳遞過程中發(fā)揮著重要作用.典型的RLKs由胞外域,跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成.一般認為當(dāng)胞外域與特異的配基結(jié)合后,其激酶活性會被激活或抑制,胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域與下游蛋白相互作用并啟動其生化反應(yīng)(如磷酸化),調(diào)控下游基因表達進行信號輸出,從而將外界信號傳遞到胞內(nèi),實現(xiàn)對環(huán)境的快速變化作出反應(yīng)[1-2].因此對RLKs胞內(nèi)激酶域活性的研究成為了分析其生物學(xué)功能及鑒定下游底物分子的基礎(chǔ).

凝集素樣類受體激酶(lectin-receptor like kinases,LecRKs)最初在擬南芥中被發(fā)現(xiàn),因胞外域含有一個保守的凝集素結(jié)構(gòu)域而得名,是僅次于富含亮氨酸重復(fù)序列類受體激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinases,LRR-RLKs)的第二大亞家族,其在水稻中有超過250個成員,在擬南芥中有超過75個成員[3-4].由于在動物和酵母中均未鑒定到此類蛋白,所以推測它們是植物中所特有的一類RLKs.

與LRR-RLKs相比,目前關(guān)于植物的LecRKs報道較少,僅對少部分基因的功能進行了研究.由于LecRKs的胞外域與動物的凝集素蛋白相似,科學(xué)家推測其可能具有識別和轉(zhuǎn)糖的功能[4-5].近些年的研究表明,LecRKs在植物抵御生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[6-8].例如,擬南芥LecRK Ⅴ.5,LecRK Ⅸ.1和LecRK Ⅸ.2能增強對疫霉的抗性[9]；LecRK Ⅵ.2是氣孔先天免疫的正調(diào)節(jié)因子[10]；LecRK Ⅸ.2或LecRK Ⅳ.3能增強對丁香假單胞菌或葡萄孢菌的抗性；SDS2與RLCK118/176相互作用,通過磷酸化調(diào)控NADPH氧化酶OsRbohB,刺激活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,從而正向調(diào)控水稻免疫反應(yīng)[11-12]；病原體入侵時會造成胞內(nèi)ATP釋放到胞外,被受體LecRK1.9/DORN1感知,從而磷酸化RBOHD,導(dǎo)致ROS爆發(fā),關(guān)閉氣孔[13].筆者所在課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),LecRK Ⅳ.1/SIT1參與鹽脅迫的早期應(yīng)答過程.SIT1激酶活性被鹽激活后,通過激活下游的MAPK3/6,進而促進乙烯的合成和ROS的產(chǎn)生,引起植物對鹽的敏感反應(yīng)[14-15]；最新研究表明番茄SlLecRK1.9通過誘導(dǎo)ERFs表達提高番茄對尖鐮孢番茄頸腐根腐病?；筒≡目剐訹16].

LecRK Ⅳ.3屬于擬南芥LecRLKs家族中的一員,其編碼序列全長2 025 bp,編碼674個氨基酸,其在擬南芥中的分子功能未有詳細報道.筆者初步的研究數(shù)據(jù)表明,LecRK Ⅳ.3在植物鹽脅迫、紫外線脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用(數(shù)據(jù)未發(fā)表).因此,本研究擬對LecRKⅣ.3基因胞內(nèi)域(intracellular domain,ID)進行體外原核表達純化,獲得正確的LecRK Ⅳ.3ID蛋白,并驗證其具有激酶活性,為進一步揭示LecRK Ⅳ.3的生物學(xué)功能及其所調(diào)控的信號通路奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌克隆感受態(tài)細胞DH5α,表達感受態(tài)細胞BL21,Rosetta,BL21(AI),Rosetta(DE3)pLysS,OverExpress C43(DE3)和pET-30a載體；BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 ku)、化學(xué)發(fā)光的底物(Dura)(美國：Thermo Fisher Scientific)；基因克隆Pfu高保真酶(中國：北京全式金生物)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、PCR產(chǎn)物膠回收和質(zhì)粒快速提取試劑盒(中國：天根生物)；一步重組試劑盒(中國：諾維贊生物)；菌落PCR鑒定Extaq酶(日本：Takara)；His純化Ni柱(美國：GE)；IPTG、溶菌酶(美國：Sigma)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的His-HRP抗體(中國：康為世紀(jì))；放射性同位素32P(中國：同輻).

引物合成和測序均由Invitrogen公司完成.

1.2 試驗方法

1.2.1LecRKIV.3ID基因克隆與His-LecRKⅣ.3ID原核表達載體的構(gòu)建

用TRIzol法從生長7 d的擬南芥幼苗中提取植物總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.設(shè)計LecRKⅣ.3ID特異引物ID-F/ID-R,利用Pfu高保真DNA聚合酶進行擴增獲得片段長度為1 059 bpLecRKⅣ.3-ID的PCR產(chǎn)物.產(chǎn)物膠回收后經(jīng)一步重組法連入預(yù)先BamH Ⅰ和HindⅢ酶切過的pET-30 a空載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆感受態(tài)細胞DH5α.挑取單克隆菌落,利用基因ID-F/載體T7-term引物進行菌落PCR鑒定,陽性克隆進行測序,最終獲得序列正確融合的His-LecRKⅣ.3ID表達載體.

1.2.2His-LecRKⅣ.3的轉(zhuǎn)化和蛋白純化

將1 μL融合成功的His-LecRKⅣ.3ID分別轉(zhuǎn)化至不同的表達感受態(tài)細胞宿主中(見表1).根據(jù)在不同表達感受態(tài)細胞中的轉(zhuǎn)化效率和生長情況,探究His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白激酶表達的最適宿主.最后挑取最適宿主進行下一步實驗.

表1 常用大腸桿菌表達感受態(tài)細胞類型及特點Tab.1 E. coli Expression Competent Cell Types and Characteristic

挑取平皿上單克隆菌落,接菌至3 mL液體LB培養(yǎng)基(kan+),37 ℃過夜搖培,次日1∶100(體積比)擴培至OD值=0.8～1.0(λ=600 nm),收集1 mL菌液為誘前菌體.取50 mL誘導(dǎo)后菌液,其中取出1 mL菌液為誘后菌體,其余低溫6 000 r/min,離心15 min,收集菌體；加入平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.4,500 mmol/L NaCl,1 mmol/L PMSF,1 mmol/L MgCl2,溶菌酶 1 mg/mL,蛋白酶抑制劑cocktail,20 mmol/L 咪唑)重懸菌體,移液槍吹吸充分打散,冷室孵育30 min；使用超聲波破碎儀,30 %強度、超聲3 s、停止8 s進行破碎,至菌液澄清透明,一般不超過5 min；低溫14 400 rpm離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,上清和沉淀分別收集1 mL留樣；其中上清中加入100 μL預(yù)先平衡的Ni-NTA Agarose beads,冷室垂直搖床上孵育1 h以內(nèi)；低溫1 500 r/min,離心5 min,收集瓊脂糖凝膠微球,取出1 mL 流穿液(flow through,FL)留樣；富集的瓊脂糖凝膠微球中加入洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.4,500 mmol/L NaCl,50 mmol/L 咪唑),洗滌3次,每次5 min；將瓊脂糖凝膠微球轉(zhuǎn)移至重力柱內(nèi),再洗滌2次,低溫1 500 r/min離心10 s,去掉殘留的洗滌緩沖液；加入100 μL洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.4,500 mmol/L NaCl,100 mmol/L 咪唑),孵育5 min；低溫1 500 r/min離心1 min,收集蛋白,共洗脫3次,留樣Elution1(E1),Elution2(E2),Elution3(E3).

誘前,誘后,上清,沉淀,FL,E1,E2和E3樣品分別用20 μL 2× SDS蛋白上樣緩沖液重懸,100 ℃水浴10 min,頂速離心,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測蛋白純化情況.

1.2.3 His-LecRK Ⅳ.3ID融合蛋白的鑒定.

為了驗證純化的蛋白是否為LecRK Ⅳ.3ID,利用Anti-His-HRP抗體通過Western blot免疫印跡檢測.將His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5 %脫脂奶粉封閉,孵育Anti-His-HRP,化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶.

1.2.4 LecRK Ⅳ.3的激酶活性分析

將0.5 μg His-LecRK Ⅳ.3ID加入激酶反應(yīng)緩沖液中(50 mmol/L HEPES-KOH pH=7.5,10 mmol/L MgCl2,1 mmol/L DTT,5 mmol/L MnCl2,100 μmol/L ATP,5 μCi同位素標(biāo)記ATP),30 ℃反應(yīng)3 h；反應(yīng)完畢后,加入2×蛋白上樣緩沖液,70 ℃溫浴15 min,頂速離心,預(yù)制膠進行SDS-PAGE；電泳完畢后用考染液拷染3 h以上,再用超純水脫色7 h 以上,照相留圖；膠貼住磷屏放至壓片暗盒內(nèi),利用Typhone儀器掃描信號.

2 結(jié)果與分析

2.1 LecRK Ⅳ.3ID基因克隆及His-LecRK Ⅳ.3ID原核表達載體構(gòu)建

以擬南芥的cDNA為模版,LecRKⅣ.3 ID-F/ID-R為特異性引物進行PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳,在UV-B燈下可觀察到一條約1k bp的特異高亮條帶(圖 1a).通過一步重組法將膠回收的目的基因片段與預(yù)先用BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切后的pET-30a空載體進行連接反應(yīng).轉(zhuǎn)化DH5α后進行菌落PCR鑒定,對得到的陽性克隆進行測序,最后獲得序列融合成功的His-LecRKⅣ.3ID環(huán)狀質(zhì)粒(圖 1b,c).

2.2 不同表達感受態(tài)細胞宿主對His-LecRK Ⅳ.3ID轉(zhuǎn)化的影響

將融合成功的His-LecRKⅣ.3ID分別轉(zhuǎn)化至不同的表達感受態(tài)細胞宿主中.結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化BL21和Rosetta宿主中的大腸桿菌均不能正常生長,而轉(zhuǎn)化BL21(AI),Rosetta(DE3)pLysS,OverExpress C43(DE3)宿主中的大腸桿菌均可以正常生長.其中,OverExpress C43(DE3)宿主中的大腸桿菌生長菌落數(shù)最多,轉(zhuǎn)化效率最高(圖2).

A～E宿主分別是：BL21,Rosetta,BL21(AI),OverExpress C43(DE3),Rosetta(DE3)pLysS.圖2 His-LecRK Ⅳ.3ID在不同表達感受態(tài)細胞宿主中的生長情況Fig.2 The Growth of His-LecRK Ⅳ.3ID in Different Host Cells

將轉(zhuǎn)化His-LecRKⅣ.3ID的宿主BL21(AI)和OverExpress C43(DE3)菌株分別進行接菌、擴培,使用0.5 mmol/L IPTG 在18 ℃誘導(dǎo)12 h.結(jié)果表明,OverExpress C43(DE3)宿主中得到的His-LecRK Ⅳ.3ID融合蛋白主要在可溶性蛋白中表達(圖3a),而BL21(AI)宿主中得到的His-LecRK Ⅳ.3ID融合蛋白主要在包涵體中(圖3b).

2.3 Western blot免疫印跡鑒定His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白

Western blot結(jié)果顯示,在48 ku分子量位置有一條特異條帶,理論分子量與實際分子量相符合,所以純化獲得的蛋白是融合的His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白(圖4).

2.4 放射性同位素法證實His-LecRK Ⅳ.3ID具有正常的激酶活性

His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白通過和放射性32P標(biāo)記的ATP進行激酶反應(yīng),放射性自顯影實驗發(fā)現(xiàn)His-LecRK Ⅳ.3ID能發(fā)生自我磷酸化(圖5),這說明它具有激酶活性.

1,2.OverExpress C43(DE3)宿主中純化His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白;M為蛋白分子量指示Maker.a.放射性自顯影(Autorad)結(jié)果,b.考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue,CCB)染色結(jié)果.圖5 LecRK Ⅳ.3ID具有激酶活性Fig.5 LecRK Ⅳ.3ID Has Kinase Activity

3 討 論

類受體激酶被認為是調(diào)節(jié)植物環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)鍵信號分子,它能夠通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實現(xiàn)對外界環(huán)境快速變化作出的反應(yīng)[1-2].近些年LecRKs家族基因的功能也被越來越多的發(fā)現(xiàn)和報道.本課題組研究發(fā)現(xiàn),LecRK Ⅳ.3在擬南芥抗鹽脅迫及UV-B脅迫過程中發(fā)揮著非常重要的作用,因此成功表達出該蛋白的激酶域并對活性進行初步分析為進一步研究LecRK Ⅳ.3的生物學(xué)功能并闡明它介導(dǎo)的信號通路奠定了基礎(chǔ).

蛋白的原核表達是獲得蛋白質(zhì)最常見方法之一[17-18].平常實驗中使用較多的標(biāo)簽一般會選擇GST,MBP,His等.His標(biāo)簽由于標(biāo)簽小、等電點低、純化介質(zhì)成本低而受到科研工作者的青睞[19]；而MBP和GST分子量較大,后續(xù)Pull-down(拉下)或蛋白質(zhì)體外結(jié)合等實驗中容易出現(xiàn)標(biāo)簽本身與潛在蛋白的非特異結(jié)合、蛋白融合標(biāo)簽后出現(xiàn)翻譯蛋白斷裂等問題.作為膜蛋白,類受體激酶的蛋白純化相對于胞質(zhì)蛋白比較困難.其一是他一般都具有較強的激酶活性,對表達宿主有毒性,在常規(guī)的大腸桿菌表達菌株中轉(zhuǎn)化效率較低,甚至不生長；其二是誘導(dǎo)過程中它特別容易進入包涵體中,不易后續(xù)的純化；其三是其誘后和誘前相比,卡馬斯亮藍染色實驗不易觀察到其菌體蛋白表達的明顯差異,只能通過后續(xù)獲取超聲破碎后的上清和沉淀再進行分析.

本文中,通過轉(zhuǎn)化不同大腸桿菌表達感受態(tài)細胞宿主找到了His-LecRK Ⅳ.3ID蛋白純化的最佳宿主,并在18 ℃低溫條件下成功純化了正確的、有激酶活性的His-LecRK Ⅳ.3ID融合蛋白.這不僅為研究LecRK Ⅳ.3的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),還為將來純化具有較強激酶活性的蛋白激酶提供理論參考.在His-LecRK Ⅳ.3ID純化過程中,發(fā)現(xiàn)His標(biāo)簽固有的缺點,由于His標(biāo)簽融合蛋白洗脫需要用到咪唑,而高濃度咪唑容易使蛋白變性,所以蛋白不適合于冷凍保存.筆者通過實驗證實,較穩(wěn)定的蛋白可于4 ℃短暫保存一周,若需要長期保存需要通過透析或脫鹽柱去除咪唑,以免影響后續(xù)的實驗.最后建議蛋白激酶類蛋白純化要現(xiàn)用現(xiàn)制,以此保證蛋白的正常生物學(xué)功能.