郭新月, 張 嵐,2, 張 晴, 左春柳, 李松洋, 嚴(yán)新悅, 袁 敏,2

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 唐山 063210； 2.華北理工大學(xué) 基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心,河北 唐山 063210)

油菜素甾醇(BRs)作為一種植物內(nèi)源類固醇激素,自從20世紀(jì)70年代被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)以來,其極強(qiáng)的生理活性激發(fā)了國(guó)際生物學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域科學(xué)家們濃厚的研究興趣.從BRs的生物合成與代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、到生理作用,科學(xué)家們對(duì)BRs生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)越來越深入.

不同于動(dòng)物甾醇類激素只在特定的組織器官合成,植物體內(nèi)幾乎所有的組織都具有甾醇類激素的合成能力.BRs合成的關(guān)鍵基因突變可導(dǎo)致植株矮化,葉片顏色深綠,葉柄縮短,花期延遲和頂端優(yōu)勢(shì)減弱等表型,外源施加BRs能恢復(fù)BR合成突變體的表型[1-2].植物體內(nèi)產(chǎn)生的BRs首先被細(xì)胞膜表面的受體BRI1識(shí)別,BRs的結(jié)合磷酸化并激活BRI1及其共受體BAK1[3-4].活化的BRI1磷酸化并激活下游的激酶BSKs和CDG1,后者進(jìn)一步磷酸化并激活下游的磷酸酶BSU1[5-6].活化的BSU1去磷酸化并失活下游的激酶BIN2[7].與此同時(shí),磷酸酶PP2A快速地去磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子BZR1/BES1[8],去磷酸化后的BZR1/BES1進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[9-10],將信號(hào)向下傳導(dǎo),參與調(diào)控植物體內(nèi)多種生理過程的調(diào)控,包括促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)與生長(zhǎng)、暗形態(tài)建成、器官邊界形成,氣孔發(fā)育,性別決定,維管組織分化,雄性繁殖,種子萌發(fā),開花,衰老,以及對(duì)各種非生物和生物脅迫的抗性等[11-13].

目前油菜素甾醇類物質(zhì)已發(fā)現(xiàn)70多種,并實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模低成本工業(yè)化生產(chǎn).農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,BRs對(duì)水稻、小麥、玉米、棉花、芹菜、番茄、草莓和葡萄等多種植物表現(xiàn)出增產(chǎn)增收、提高抗逆性或提高果實(shí)品質(zhì)等效果[14-15].隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)BRs影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育與濃度相關(guān),尤其表現(xiàn)在BRs對(duì)植物根系的影響,并且不同植物根系對(duì)BRs的響應(yīng)濃度存在差異[16].通常較低濃度的BRs促進(jìn)植物主根和側(cè)根的發(fā)育,較高濃度的BRs促進(jìn)側(cè)根發(fā)育的同時(shí)抑制主根的生長(zhǎng),過高濃度的BRs顯著抑制生長(zhǎng),主根和側(cè)根發(fā)育均受到顯著抑制[17].但是低濃度BRs促進(jìn)而高濃度BRs抑制根生長(zhǎng)的發(fā)育機(jī)制目前還不清楚.本研究利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了不同濃度BRs處理下番茄幼苗根部的基因表達(dá)變化,旨在解析BRs調(diào)控植物根系發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,為更加有效地利用BRs激素奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為Micro-Tom,來源于華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室.

1.2 番茄幼苗不同濃度BRs處理及表型觀察

番茄種子用70 %酒精消毒1 min,10 %次氯酸鈉消毒7 min,無菌水沖洗6～8次后置于浸濕的滅菌濾紙上,28 ℃催芽48 h后分別點(diǎn)種于含有0,0.5,1,10和50 nmol/L 表油菜素內(nèi)脂(eBL，BRs的一種)的1/2 MS固體平板培養(yǎng)基上,25 ℃，16 h光照/8 h黑暗條件下豎直培養(yǎng)4 d后觀察并拍照.Image J軟件測(cè)量各組根長(zhǎng),并利用Student′s t-test進(jìn)行差異分析.

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

1.3.1 樣品收集、RNA提取及測(cè)序

將番茄幼苗在0,0.5,10 nmol/L eBL的1/2 MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d,取根部,液氮凍存后送至上海元莘生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,每組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù).經(jīng)RNA提取、質(zhì)控、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)檢步驟后上機(jī)進(jìn)行雙端測(cè)序.測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳至Genome Sequence Archive(GSA,組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫(kù)),收錄編號(hào)為CRA006812.

1.3.2 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行質(zhì)量過濾獲得高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)(clean data)并匯總統(tǒng)計(jì).利用HISAT2的算法將質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)于小番茄ITAG4.0參考基因組進(jìn)行比對(duì),(https:∥data.jgi.doe.gov/search?q=ITAG4.0&expanded=Phytozome-691),并用Stringtie拼接鑒定新基因和新轉(zhuǎn)錄本.針對(duì)已知和新鑒定的基因和轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)過質(zhì)量控質(zhì)后與NR(非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，SwissProt(蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù),https:∥www.uniprot.org/)，PFAM(蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù),https:∥pfam.xfam.org/)，GO(基因本體數(shù)據(jù)庫(kù),http:∥geneontology.org/)，KEGG(代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù),https:∥www.kegg.jp/kegg/pathway.html)及STRING(蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫(kù),https:∥cn.string-db.org/)六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋,全面獲取基因和轉(zhuǎn)錄本的功能信息.通過比對(duì)計(jì)算基因的表達(dá)水平.根據(jù)Hisat2軟件的比對(duì)結(jié)果,計(jì)算每個(gè)基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的FPKM(每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的基因片段值)值,作為基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本中的表達(dá)量,進(jìn)而對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,依據(jù)|log2FoldChange|>=1.00為標(biāo)準(zhǔn)篩選不同樣本之間顯著差異表達(dá)的基因.針對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO與KEGG功能注釋與富集分析.利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)可以將基因按照參與的生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分、實(shí)現(xiàn)的分子功能分類.利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)可以將基因按照參與的信號(hào)通路或行使的功能分類.

表1 引物列表Tab.1 List of Primers

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR( qRT-PCR)檢測(cè)候選基因的表達(dá)量

將番茄幼苗在0,0.5,和10 nmol/L eBL的1/2 MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d,提取根部總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.設(shè)計(jì)候選基因和內(nèi)參基因(actin)特異性引物,見表1.qRT-PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性(95 ℃,15 min),變性(95 ℃,10 s),退火延伸(60 ℃,32 s),40個(gè)循環(huán).每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù).利用單因素方差分析進(jìn)行表達(dá)量的差異顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度BRs抑制番茄幼苗主根伸長(zhǎng)

為了研究BRs對(duì)番茄根系發(fā)育的影響,本研究比較了不同濃度eBL(0.5,1,10，50 nmol/L)處理4 d的番茄幼苗根系的形態(tài)特征.與對(duì)照相比,當(dāng)eBL濃度為0.5 nmol/L時(shí),主根長(zhǎng)度增加,但差異不顯著；當(dāng)eBL濃度升高至1 nmol/L時(shí),主根長(zhǎng)度變短,但差異不顯著；當(dāng)eBL濃度升高至10 nmol/L及更高濃度時(shí),主根伸長(zhǎng)被顯著抑制(圖1).

圖1 番茄幼苗主根對(duì)不同濃度eBL的響應(yīng)Fig.1 The Response of Tomato Seedlings Upon Different Concentration of eBL Treatment

表2 六大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果Tab.2 Annotation Result in Six Different Databases

2.2 基因組比對(duì)與注釋

為了解析高濃度BRs抑制番茄幼苗主根伸長(zhǎng)的分子機(jī)理,本研究對(duì)0，0.5，10 nmol/L的eBL培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)4 d的番茄幼苗根組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序.測(cè)序共獲得 60.305 Gb質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù),單個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量均在6.87 Gb以上,各樣品平均數(shù)據(jù)量為 6.701 Gb,Q30(堿基錯(cuò)誤識(shí)別率為0.1 %稱為Q30)堿基百分比在 93.06 %以上,GC含量為 42.42 %～42.60 %.將各樣品的質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù)與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì),比對(duì)率從94.887 %到95.336 %不等,其中唯一比對(duì)率為92.530 %～92.950 %.六大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果如表2所示,NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋率最高,共獲得30 463個(gè)基因注釋.

2.3 差異基因的鑒定

為了分析比較eBL處理組與對(duì)照組基因表達(dá)的差異,本研究對(duì)34 075個(gè)基因進(jìn)行了表達(dá)量分析,基于基因表達(dá)量定量結(jié)果,進(jìn)行組間差異分析,獲得組間差異表達(dá)的基因.0.5 nmol/L eBL處理組與對(duì)照相比,差異基因數(shù)較少,只有56個(gè),包括46個(gè)上調(diào)和10個(gè)下調(diào)基因.這一結(jié)果與0.5 nmol/L eBL促進(jìn)主根伸長(zhǎng)不明顯相吻合.10 nmol/L eBL處理組與對(duì)照相比,主根伸長(zhǎng)被顯著抑制,測(cè)序獲得的差異基因數(shù)也較多,共585個(gè),包括271個(gè)上調(diào)和314個(gè)下調(diào)基因(表3).

表3 不同濃度eBL處理獲得的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Tab.3 Summary of the Number of DEGs Detected Under Different Concentration of eBL Treatment

2.4 差異基因GO富集分析

為了進(jìn)一步獲得差異表達(dá)基因的功能信息,本研究分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行了GO富集分析,將基因按照參與的生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分,實(shí)現(xiàn)的分子功能等進(jìn)行分類,同時(shí)對(duì)GO富集最顯著性的前10位GO條目繪制網(wǎng)絡(luò)圖.0.5 nmol/L eBL處理與對(duì)照相比獲得的差異基因數(shù)目太少,未得到GO富集結(jié)果.10 nmol/L eBL處理產(chǎn)生的差異表達(dá)基因GO富集分析表明,上調(diào)基因主要富集在乙烯合成(ethylene biosynthetic process)和代謝(ethylene metabolic process),烯烴合成(alkene biosynthetic process,olefin biosynthetic process)和代謝(cellular alkene metabolic process,olefin metabolic process)2個(gè)方面.

橙黃節(jié)點(diǎn)代表GO條目；其他顏色的節(jié)點(diǎn)代表是富集到每個(gè)GO條目中的差異基因；橙黃節(jié)點(diǎn)的大小與富集到該通路中的差異基因個(gè)數(shù)成正比.圖2 10 nmol/L eBL處理上調(diào)基因的GO富集網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 GO Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.4 差異基因KEGG富集分析

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)提供了整合代謝途徑查詢,系統(tǒng)分析基因功能和基因組信息,有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究.為了獲得10 nmol/L eBL處理的差異基因參與的信號(hào)通路信息,本研究分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行了KEGG富集分析,同時(shí)對(duì)KEGG富集最顯著性的前10位KEGG條目繪制網(wǎng)絡(luò)圖.結(jié)果如圖3和表4所示,上調(diào)基因在乙烯合成通路(cysteine and methionine metabolism),植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction),植物MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(MAPK signaling pathway-plant)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與代謝(biosynthesis of secondary metabolites)這幾方面有明顯的富集.

橙黃節(jié)點(diǎn)代表KEGG條目;其他顏色的節(jié)點(diǎn)代表是富集到每個(gè)KEGG條目中的差異基因;橙黃節(jié)點(diǎn)的大小與富集到該通路中的差異基因個(gè)數(shù)成正比.圖3 10 nmol/L eBL處理上調(diào)表達(dá)基因KEGG富集網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 KEGG Enrichment Network Diagram of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

表4 10 nmol/L eBL處理上調(diào)表達(dá)基因KEGG富集結(jié)果列表Tab.4 KEGG Enrichment List of Up-regulated Genes Under 10 nmol/L eBL Treatment

2.5 乙烯合成相關(guān)差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示eBL處理后番茄幼苗根中乙烯合成關(guān)鍵基因ACO(ACC氧化酶)和ACS(ACC合成酶)出現(xiàn)了明顯的表達(dá)上調(diào).為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果的準(zhǔn)確性,本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證了0.5，10 nmol/L eBL處理后番茄幼苗根中ACO和ACS的表達(dá)量.結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,0.5，10 nmol/L eBL處理均顯著促進(jìn)了ACO和ACS的表達(dá),且10 nmol/L eBL處理產(chǎn)生的促進(jìn)效果更明顯(圖4).

誤差線代表3次生物學(xué)重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)誤差; a,b,c代表顯著性差異p<0.05.圖4 qRT-PCR檢測(cè)含有不同濃度eBL的1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d的番茄幼苗根中ACO和ACS的表達(dá)量Fig.4 qRT-PCR Analysis of ACO and ACS Expression in the Tomato Roots of 4-day-old Seedlings Grown in 1/2 MS Medium Containing Different Concentrations of eBL

3 討論與結(jié)論

根系在植物的整個(gè)生命周期中發(fā)揮非常重要的作用,除了固著支持植株地上部分,還負(fù)責(zé)從土壤中吸收供植株生長(zhǎng)發(fā)育所需的水分、無機(jī)鹽和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素,合成并貯存有機(jī)物質(zhì).根深才葉茂,根系與地上部在代謝上緊密相聯(lián),因此,對(duì)根系及其生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究,有助于農(nóng)業(yè)上提高作物抗逆性，保證作物產(chǎn)量和品質(zhì).

根發(fā)育過程主要包括胚發(fā)育、分生區(qū)細(xì)胞的分裂和分化、伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的伸長(zhǎng)、成熟區(qū)根毛的形成與側(cè)根的起始和形成等.這一系列生長(zhǎng)發(fā)育過程受到自身發(fā)育年齡,環(huán)境和激素等多種因素的影響,而根系的發(fā)育具有很大的可塑性,奠定了植物適應(yīng)外界復(fù)雜多變環(huán)境的基礎(chǔ)[16-17].已有研究表明生長(zhǎng)素在植物根生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,外源施加生長(zhǎng)素抑制主根的伸長(zhǎng)而促進(jìn)側(cè)根的產(chǎn)生.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素在分生區(qū)靜止中心區(qū)域積累,誘導(dǎo)PLT(plethora)基因的表達(dá).外源施加乙烯合成前體ACC抑制主根伸長(zhǎng),并激活了AUX1和PIN2的表達(dá).鉻通過激活生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AUX1導(dǎo)致生長(zhǎng)素在根尖積累,進(jìn)而抑制主根伸長(zhǎng),并且乙烯在此過程中起到協(xié)同作用[18-20].以上均表明生長(zhǎng)素和乙烯交互調(diào)節(jié)根的發(fā)育.BRs被認(rèn)為是一種新型的植物生長(zhǎng)促進(jìn)類激素,源于20世紀(jì)70年代Michell等發(fā)現(xiàn)它能夠使豌豆幼苗節(jié)間伸長(zhǎng).越來越多的證據(jù)表明BRs最典型的就是作用于細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂,并且在根細(xì)胞伸長(zhǎng)、側(cè)根起始以及大豆根瘤發(fā)育中發(fā)揮重要作用[21-22].Chaiwanon等[17]發(fā)現(xiàn)低濃度的BRs促進(jìn)擬南芥根的伸長(zhǎng),而高濃度的BRs會(huì)抑制擬南芥根的伸長(zhǎng).不同濃度BRs處理小麥幼苗,主根和側(cè)根均表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象,BRs濃度越高,抑制越嚴(yán)重.但是目前存在很多懸而未決的問題,如低濃度BRs促進(jìn)而高濃度BRs抑制根生長(zhǎng)的發(fā)育機(jī)制是什么；植物如何感知不同的BRs濃度；根中是否存在不同親和力的BRs受體.

BRs調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝往往是與其他信號(hào)通路中的組分交互作用.已有研究表明BRs促進(jìn)乙烯的生物合成而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[23].BRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄因子BZR1和乙烯信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子EIN3相互作用,協(xié)同調(diào)控基因表達(dá),在暗中促進(jìn)頂端彎鉤的發(fā)育,在光下協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng),進(jìn)一步豐富和完善了植物激素BRs和乙烯交叉互作的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[24-25].本研究中不同濃度BRs處理番茄幼苗,同樣發(fā)現(xiàn)高濃度BRs顯著抑制了番茄幼苗主根伸長(zhǎng).轉(zhuǎn)錄組分析表明,高濃度BRs處理引起乙烯合成通路,植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),植物MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與代謝等途徑的基因明顯上調(diào),進(jìn)一步熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)0.5，10 nmol/L eBL處理均顯著促進(jìn)了乙烯合成相關(guān)基因ACO和ACS的表達(dá).結(jié)果暗示BRs和乙烯可能交叉互作調(diào)控高濃度BRs對(duì)植物主根生長(zhǎng)的抑制,但是,二者交互影響的下游組分仍需進(jìn)一步研究.

番茄營(yíng)養(yǎng)豐富,既是蔬菜也是水果,是人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡墓咧?在中國(guó)南北方均廣泛種植.高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)番茄的培育對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義.目前,番茄中有關(guān)BRs方面的研究還較少,限制了這一重要激素在番茄生產(chǎn)種植中的應(yīng)用,本研究分析了不同濃度BRs處理對(duì)番茄幼苗根系的影響,研究結(jié)果不僅可為BRs在番茄生產(chǎn)中的科學(xué)正確使用提供理論基礎(chǔ),也對(duì)BRs在植物根系發(fā)育的作用機(jī)制研究提供了支撐.