劉笑笑 路玉潔 田威龍 肖有恩 覃燕靈 吳細(xì)波 司景磊 梁 晶 蘭干球*

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)，廣西南寧 530022）

血清免疫指標(biāo)是衡量動(dòng)物健康水平的重要指標(biāo)，TNFα、IL-6、CRP是目前研究較多的血清免疫指標(biāo)。白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)在宿主防御中發(fā)揮重要作用[1]；C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)是一種急性反應(yīng)蛋白，是重要的機(jī)體炎性反應(yīng)生物標(biāo)志物，起到免疫調(diào)節(jié)和吞噬炎性反應(yīng)的作用[2]；腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 在機(jī)體發(fā)生炎癥或病毒感染時(shí)，會(huì)通過自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)被激活后，作為促炎細(xì)胞因子被優(yōu)選出來，發(fā)揮殺傷被病毒感染的宿主細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。TNFα、IL-6、CRP在機(jī)體免疫和檢測(cè)感染方面均具有重要作用[4]。試驗(yàn)對(duì)此3項(xiàng)免疫指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行分析及正態(tài)分布檢驗(yàn)，得出3項(xiàng)免疫指標(biāo)的相關(guān)性及群體分布情況，為豬育肥期免疫指標(biāo)的正常范圍值、健康檢測(cè)及以大白豬為疾病模型的各時(shí)期免疫指標(biāo)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬乃來自廣西南寧某大型核心種豬場(chǎng)，所有仔豬統(tǒng)一飼喂商業(yè)飼料，且未添加任何抗生素，70日齡統(tǒng)一轉(zhuǎn)入育肥舍，待其適應(yīng)后，統(tǒng)一進(jìn)行血清樣品的采集(80日齡)。

1.2 樣品采集

使用20 mL注射器采取大白豬前腔靜脈血后，注入5 mL一次性真空采血管內(nèi)，常溫靜止1～2 h后4℃3 000 rmp離心15 min，吸取上清液(即血清)至1.5 mL離心管內(nèi)備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腫瘤壞死因子α的測(cè)定

采用九邦生物科技公司的豬腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢驗(yàn)血清樣本中的腫瘤壞死因子α，具體操作步驟如下：①試劑盒4℃保存，試驗(yàn)開始前應(yīng)先室溫平衡20 min；②標(biāo)準(zhǔn)孔依次加入各梯度標(biāo)準(zhǔn)液50 μL，空白孔不加樣；③樣本孔加入50 μL待測(cè)血清樣品；④樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μL HPR標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封膜后37℃恒溫箱孵育60 min后，棄去液體，每孔加入350 μL洗滌液并靜置1 min后，棄去液體，反復(fù)操作5次；⑥所有孔內(nèi)加入A液、B液各50 μL，37℃恒溫箱孵育15 min；⑦所有孔內(nèi)加入50 μL終止液，使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值；⑧根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值及對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液濃度，使用Excel軟件計(jì)算得出直線回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，OD值代入方程即可計(jì)算所有樣品TNFα的濃度。測(cè)定單位為pg/mL。

1.3.2 白細(xì)胞介素-6的測(cè)定

采用九邦生物科技公司的豬白細(xì)胞介素-6 ELISA試劑盒檢驗(yàn)血清中的白細(xì)胞介素-6，測(cè)定單位為pg/mL，具體操作步驟同腫瘤壞死因子α的測(cè)定。

1.3.3 C-反應(yīng)蛋白的測(cè)定

采用九邦生物科技公司的豬C-反應(yīng)蛋白ELISA試劑盒檢驗(yàn)血清樣本中的C-反應(yīng)蛋白，測(cè)定單位為mg/L，具體操作步驟同腫瘤壞死因子α的測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用R語言檢驗(yàn)不同性別的顯著性，其他數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，包括：描述性統(tǒng)計(jì)、t檢驗(yàn)、Person相關(guān)性分析、正態(tài)分布檢驗(yàn)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著性檢驗(yàn)

使用R語言Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(rank sum test)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖1所示，公豬TNFα、IL-6、CRP的值均高于母豬，但各免疫指標(biāo)差異均不顯著(P＞0.05)。

圖1 公、母豬TNFα、IL-6、CRP指標(biāo)顯著性檢驗(yàn)

2.2 各指標(biāo)正態(tài)分布檢驗(yàn)

使用Shapiro-wilk對(duì)TNFα、IL-6、CRP進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，IL-6、CRP均符合正分布，TNFα不符合正態(tài)分布。由于不是所有指標(biāo)都滿足正態(tài)分布，因此，運(yùn)用wilcoxon秩和檢驗(yàn)(rank sum test)對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析(非參數(shù)檢驗(yàn))。非參數(shù)檢驗(yàn)不需要利用總體的信息(總體分布)，以樣本信息對(duì)總體分布做出推斷。

圖2 TNFα、IL-6、CRP的指標(biāo)正態(tài)分布檢驗(yàn)

2.3 各指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)

TNFα、IL-6、CRP血清免疫指標(biāo)的描述性統(tǒng)計(jì)如表1所示。3項(xiàng)血清免疫指標(biāo)的均值分別為29.07 pg/mL、70.84 pg/mL和2.12 mg/L。各項(xiàng)結(jié)果中變異系數(shù)值較大，分別為36%、25%和32%，表明基于平均數(shù)為準(zhǔn)的變異程度較大、TNFα、IL-6、CRP指標(biāo)數(shù)據(jù)的離散程度較高。

表1 3項(xiàng)指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)

2.4 各指標(biāo)相關(guān)性分析

TNFα、IL-6、CRP指標(biāo)的相關(guān)性分析及顯著性檢驗(yàn)如表2所示，各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.4以上，且均呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)，表明IL-6與TNFα、CRP與TNFα、CRP與IL-6等每2個(gè)指標(biāo)間均具有中度相關(guān)性。

表2 TNFα、IL-6、CRP的相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn)

3 討論

3.1 各指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)及正態(tài)分布檢驗(yàn)

血清免疫指標(biāo)在一定程度上影響機(jī)體的健康水平[5]，豬作為人類的理想疾病模型，研究其各個(gè)時(shí)期的免疫水平變化具有重要意義[6]。本研究的結(jié)果顯示育肥期(80日齡)大白豬的公、母豬各指標(biāo)差異均不具有顯著性，表明該時(shí)期性別因素對(duì)TNFα、IL-6、CRP指標(biāo)水平的影響不大。正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果顯示除TNFα外，其余2項(xiàng)指標(biāo)符合正態(tài)分布，且TNFα數(shù)值遠(yuǎn)小于盧軍鋒[7]使用“杜長(zhǎng)大”豬110 kg屠宰采樣測(cè)得的數(shù)值，這表明TNFα在不同時(shí)期可能差異較大。描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示變異系數(shù)較大即數(shù)據(jù)的離散程度較大，表明80日齡大白豬的免疫指標(biāo)數(shù)值差異較大，這可能是因?yàn)椴蓸討?yīng)激水平的影響，研究表明應(yīng)激可對(duì)豬體內(nèi)炎癥因子水平產(chǎn)生一定影響[8]；此外，可能由于性成熟前豬體內(nèi)的免疫因子處于“上升階段”且上升程度不一致所致[9]。大白豬在育肥期免疫因子出現(xiàn)個(gè)體水平差異較大的原因及其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

3.2 各指標(biāo)相關(guān)性分析及顯著性檢驗(yàn)

TNFα、IL-6、CRP相關(guān)性結(jié)果顯示任意兩指標(biāo)之間相關(guān)性系數(shù)均在0.4以上，均呈極顯著中度相關(guān)。臘曉琳等[10]研究表明免疫因子之間具有一定的相關(guān)性，會(huì)協(xié)同促進(jìn)疾病的進(jìn)展。結(jié)合前人研究，表明TNFα、IL-6、CRP等3項(xiàng)免疫因子水平具有一定相關(guān)性，其具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

育肥期(80日齡) 大白豬的TNFα、IL-6、CRP指標(biāo)間具有極顯著相關(guān)性；性別因素對(duì)該時(shí)期指標(biāo)的表型影響不顯著。