劉 毅，謝雁鳴，黎元元，崔 鑫，席俊羽

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

基于生物信息學(xué)的乳腺癌細(xì)胞焦亡相關(guān)基因多組學(xué)分析及相關(guān)中藥篩選預(yù)測(cè)

劉 毅，謝雁鳴*，黎元元*，崔 鑫，席俊羽

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

基于生物信息學(xué)探究細(xì)胞焦亡相關(guān)基因在乳腺癌中的作用及臨床意義，并篩選可對(duì)細(xì)胞焦亡起調(diào)控作用的中藥。從TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取乳腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)集；使用R、Perl語(yǔ)言對(duì)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)、變異進(jìn)行評(píng)估；對(duì)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行細(xì)胞焦亡基因分型及預(yù)后差異基因分型，并對(duì)各分型進(jìn)行多組學(xué)分析；構(gòu)建預(yù)后模型、進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，按照風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分組進(jìn)行亞組多組學(xué)分析并檢驗(yàn)對(duì)生存的預(yù)測(cè)能力；以細(xì)胞焦亡基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件構(gòu)建“細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)-成分-中藥”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，進(jìn)而得出核心中藥及其相關(guān)屬性。大多數(shù)細(xì)胞焦亡基因在乳腺癌中表達(dá)異常并具有拷貝數(shù)變異，細(xì)胞腫瘤抗原（cellular tumor antigen p53，）等11個(gè)基因發(fā)生了體細(xì)胞突變；細(xì)胞焦亡分型中A亞型預(yù)后好、細(xì)胞焦亡基因及免疫相關(guān)通路高表達(dá)、免疫細(xì)胞含量高；B型與之相反，且A、B兩亞型差異明顯，其分型差異基因有1223個(gè)。將不同的焦亡基因重新聚類，得到3個(gè)基因型，乳腺癌細(xì)胞焦亡預(yù)后差異基因分型中I組預(yù)后最好，II組最差，I組主要為基因及細(xì)胞焦亡基因高表達(dá)，II組主要呈現(xiàn)低表達(dá)。預(yù)后模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，低風(fēng)險(xiǎn)組細(xì)胞焦亡基因高表達(dá)、預(yù)后好，高風(fēng)險(xiǎn)組相反，通過(guò)列線圖可對(duì)患者不同臨床特征進(jìn)行預(yù)后評(píng)估；免疫細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)性大多呈負(fù)相關(guān)；腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞及總評(píng)分均為高風(fēng)險(xiǎn)組更低，腫瘤突變負(fù)荷則高風(fēng)險(xiǎn)組更高；干細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)得分呈正相關(guān)。“細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)-成分-中藥”網(wǎng)絡(luò)得出木蝴蝶、紅花等17味中藥為核心藥物，其性味主要為苦寒，次以辛溫，輔以甘平之品，主要調(diào)節(jié)肝、肺、脾、胃等臟腑。細(xì)胞焦亡基因在乳腺癌的免疫中發(fā)揮重要作用，與乳腺癌患者預(yù)后具有明顯相關(guān)性，調(diào)控細(xì)胞焦亡基因的中藥主要有木蝴蝶、紅花等17味藥物，可為乳腺癌的診療及中藥干預(yù)研究提供思路與參考。

細(xì)胞焦亡；生物信息學(xué)；中藥；乳腺癌；多組學(xué)分析；木蝴蝶；紅花

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種由炎癥小體引發(fā)的裂解性程序性細(xì)胞死亡形式[1]，該過(guò)程由促炎性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1、4、5、11的底物gasdermin D介導(dǎo)并伴隨炎癥和免疫反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡可以影響腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。因此，有報(bào)道認(rèn)為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡是一種潛在的癌癥治療策略[4]。

乳腺癌（breast cancer）是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的最常見(jiàn)原因[5]，其終生患病概率為12.3%[6]，對(duì)女性群體有極大的危害性。受益于診斷及影像技術(shù)發(fā)展與早期篩查，乳腺癌的死亡率已經(jīng)大幅降低[7]，但由于存在一定復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，乳腺癌患者的預(yù)后仍然不佳[8-9]。目前乳腺癌的治療主要包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療、放療、化療、靶向治療等[10-12]，但這些治療往往存在較嚴(yán)重的不良反應(yīng)[13-15]。因此，鑒于細(xì)胞焦亡對(duì)癌癥存在調(diào)控作用，以此研究方向?yàn)橹笇?dǎo)或可開(kāi)發(fā)更加安全、有效的新藥物。

中藥對(duì)于乳腺癌治療的有效性被廣泛報(bào)道[16]，而挖掘與細(xì)胞焦亡相關(guān)的中藥則更有利于指導(dǎo)相關(guān)研究與臨床應(yīng)用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從多組學(xué)角度全面分析細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)及其與乳腺癌生存、預(yù)后、免疫、腫瘤微環(huán)境等方面的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上篩選出可能對(duì)細(xì)胞焦亡有調(diào)控作用的中藥。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）中分別獲取乳腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄組、臨床、突變及拷貝數(shù)數(shù)據(jù)。對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行解壓、ID轉(zhuǎn)換并將其格式由FPKM（fragments per kilobase per million）轉(zhuǎn)換為T(mén)PM（transcripts per million）。在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索“breast cancer survival”并限定數(shù)據(jù)類型（expression profiling by array）及物種（homo sapiens）進(jìn)行篩選，獲取基因表達(dá)及臨床數(shù)據(jù)，然后對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行基因符號(hào)注釋。

1.2 乳腺癌細(xì)胞焦亡基因突變、拷貝數(shù)變異、差異、生存及預(yù)后分析

通過(guò)檢索細(xì)胞焦亡相關(guān)文獻(xiàn)獲得細(xì)胞焦亡相關(guān)基因，將樣品突變數(shù)據(jù)中的細(xì)胞焦亡相關(guān)基因利用R語(yǔ)言“maftools”包及Perl語(yǔ)言進(jìn)行突變類型、頻率、數(shù)目、堿基改變及負(fù)荷的統(tǒng)計(jì)分析，并將結(jié)果以瀑布圖表示；然后檢索UCSC Xena（https:// xena.ucsc.edu/）數(shù)據(jù)庫(kù)并下載乳腺癌拷貝數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)，使用Perl語(yǔ)言提取樣品中細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的拷貝數(shù)，再使用R語(yǔ)言將樣品細(xì)胞焦亡相關(guān)基因拷貝數(shù)結(jié)果繪制成拷貝數(shù)頻率圖及圈圖；將TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣品表達(dá)量數(shù)據(jù)使用R語(yǔ)言中的“l(fā)imma”和“sva”包進(jìn)行合并，并提取細(xì)胞焦亡基因的表達(dá)量，再將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所得臨床數(shù)據(jù)中的生存時(shí)間、生存狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，使用R語(yǔ)言的“survival”和“surminer”包進(jìn)行生存和預(yù)后分析并可視化。

1.3 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型及分型基因生存分析、基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）、免疫細(xì)胞差異分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）和差異性分析

根據(jù)細(xì)胞焦亡的表達(dá)量使用R語(yǔ)言的“ConsensuClusterPlus”對(duì)乳腺癌細(xì)胞焦亡基因進(jìn)行聚類分型，其中聚類算法為K-means，距離類型為歐氏距離；然后使用R語(yǔ)言的“RcolorBrewer”“GSVA”“PRGcluster”等將分型后的兩組細(xì)胞焦亡基因進(jìn)行生存分析、細(xì)胞焦亡基因表達(dá)分析、GSVA、ssGSEA、PCA并可視化，最后將細(xì)胞焦亡分型的兩組樣品基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，并獲得分型之間的差異基因。

1.4 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型差異基因基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將“1.3”項(xiàng)所得的細(xì)胞焦亡分型之間的差異基因使用R語(yǔ)言的“clusterProfiler”和“enrichplot”包分別進(jìn)行GO的生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細(xì)胞成分（cellular component，CC）富集分析和KEGG通路富集分析，按照＜0.005進(jìn)行篩選，并繪制GO及KEGG分析的氣泡圖。

1.5 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型預(yù)后相關(guān)差異基因再分型及其生存與表達(dá)分析

根據(jù)“1.3”項(xiàng)所得分型差異基因的生存分析結(jié)果探尋預(yù)后相關(guān)的差異基因，再通過(guò)R語(yǔ)言聚類分析將預(yù)后相關(guān)差異基因進(jìn)行聚類分型，選取準(zhǔn)確性最高的聚類結(jié)果作為分型結(jié)果。根據(jù)分型結(jié)果比較不同分型之間的生存情況，并繪制生存曲線與差異基因熱圖。然后將“1.3”項(xiàng)所得基因分型的結(jié)果與“1.2”項(xiàng)所得細(xì)胞焦亡基因表達(dá)量數(shù)據(jù)使用R語(yǔ)言進(jìn)行差異分析并繪制箱線圖。

1.6 預(yù)后模型的構(gòu)建、分析及其可視化

①將包含單因素顯著基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù)的集合進(jìn)行隨機(jī)分組，分為訓(xùn)練（train）組及驗(yàn)證（test）組；然后構(gòu)建基因表達(dá)量及生存時(shí)間、狀態(tài)的套索算法（least absolute shrinkage and selection operator，Lasso）回歸模型并進(jìn)行交叉驗(yàn)證，選擇其中誤差最小的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因作為L(zhǎng)asso回歸模型顯著基因，結(jié)合顯著基因與其表達(dá)量構(gòu)建COX回歸模型。②利用訓(xùn)練組得出模型計(jì)算公式，即基因表達(dá)量乘以系數(shù)再求和，進(jìn)一步根據(jù)公式計(jì)算訓(xùn)練組風(fēng)險(xiǎn)得分，根據(jù)得分中位數(shù)區(qū)分高、低風(fēng)險(xiǎn)組；驗(yàn)證組同理，即通過(guò)公式計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)得分，并根據(jù)訓(xùn)練組的中位數(shù)區(qū)分驗(yàn)證組的高、低風(fēng)險(xiǎn)組；進(jìn)行生存差異分析并得出差異的值、受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）、風(fēng)險(xiǎn)曲線及列線圖。③將細(xì)胞焦亡分型、基因分型結(jié)果通過(guò)R語(yǔ)言分別進(jìn)行預(yù)后分析，比較不同分型之間的差異性及風(fēng)險(xiǎn)得分并可視化；再分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的差異性，并繪制箱線圖。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與免疫細(xì)胞含量分析

將“1.2”項(xiàng)中TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)所得數(shù)據(jù)的并集利用R語(yǔ)言CIBERSORT命令獲得總量為1的免疫細(xì)胞相對(duì)含量；將免疫細(xì)胞相對(duì)含量的數(shù)據(jù)結(jié)果根據(jù)＜0.05進(jìn)行過(guò)濾，并與“1.6”項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)得分的結(jié)果取交集，最后對(duì)所有免疫細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)計(jì)算，得到風(fēng)險(xiǎn)得分、基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性結(jié)果。

1.8 腫瘤微環(huán)境分析、腫瘤突變負(fù)荷分析及干細(xì)胞分析

①將“1.2”項(xiàng)中TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)所得數(shù)據(jù)的并集使用R語(yǔ)言“estimate”包對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤純度分析以及綜合評(píng)分；利用評(píng)分結(jié)果與“1.6”項(xiàng)所得高、低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行腫瘤微環(huán)境差異分析，并采用小提琴圖表示。②將所有樣品的風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)與染色體突變位置數(shù)據(jù)利用Perl語(yǔ)言分析得出其按照高、低風(fēng)險(xiǎn)組區(qū)分的腫瘤突變數(shù)據(jù)，并使用R語(yǔ)言繪制瀑布圖；利用R語(yǔ)言的“reshape2”包結(jié)合“1.7”項(xiàng)中樣品風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)及“1.5”項(xiàng)中分型數(shù)據(jù)獲取腫瘤突變負(fù)荷數(shù)據(jù)，并以箱線圖表示。③將泛癌干細(xì)胞打分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)合“1.7”項(xiàng)中樣品風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言分析獲得相關(guān)性結(jié)果并繪制散點(diǎn)圖。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用R v.4.1.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組獨(dú)立樣品數(shù)據(jù)比較采用檢驗(yàn)。3組及以上的數(shù)據(jù)，則采用單因素方差分析（ANOVA）及Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，以＜0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.10 “細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)-有效成分-中草藥”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與藥物篩選

將細(xì)胞焦亡相關(guān)靶基因使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）查找靶點(diǎn)相關(guān)的有效成分并根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進(jìn)行篩選，然后通過(guò)有效成分篩選相關(guān)中藥，使用CytoscapeV 3.8.0構(gòu)建“靶點(diǎn)-成分-中藥”網(wǎng)絡(luò)并通過(guò)拓?fù)鋵W(xué)分析獲取核心中藥。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)收集與處理結(jié)果

通過(guò)檢索TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得TCGA-乳腺癌中包含正常樣品113個(gè)，腫瘤樣品1109個(gè)；獲得的GEO數(shù)據(jù)（GSE146558）中包含腫瘤樣品109個(gè)。

2.2 乳腺癌細(xì)胞焦亡基因突變分析、拷貝數(shù)變異分析、差異分析、生存分析及預(yù)后分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)檢索文獻(xiàn)獲得細(xì)胞焦亡基因52個(gè)，具體如表1所示。通過(guò)分析乳腺癌中細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的拷貝數(shù)變異和基因突變的發(fā)生率，可知在986個(gè)突變數(shù)據(jù)樣品中有394個(gè)樣品發(fā)生了變異，突變比例占39.96%，其中突變率最高，達(dá)34%，其他為（2%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%），如圖1-A所示；圖1-B則顯示大多數(shù)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因存在拷貝數(shù)的變化，而拷貝增加較缺失頻率略大；由圖1-C可進(jìn)一步看出拷貝數(shù)變化的細(xì)胞焦亡相關(guān)基因所在染色體的位置；由圖1-D可以看出71%的細(xì)胞焦亡基因在正常樣品和腫瘤樣品間表達(dá)存在顯著性差異，其中、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、為腫瘤組表達(dá)上調(diào)，、、、、、、、、、、、、、、為腫瘤組表達(dá)下調(diào)。將TCGA與GEO數(shù)據(jù)合并后進(jìn)行生存分析，結(jié)果見(jiàn)表2，其中風(fēng)險(xiǎn)率（hazard ratio，HR）＞1的基因?yàn)楦唢L(fēng)險(xiǎn)基因，＜0.05則說(shuō)明該基因?yàn)轭A(yù)后相關(guān)，根據(jù)圖2-A可知，生存曲線中的預(yù)后相關(guān)基因有、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、，其大多為高表達(dá)則預(yù)后較好；然后進(jìn)一步構(gòu)建預(yù)后網(wǎng)絡(luò)，如圖2-B所示，其中紫色節(jié)點(diǎn)表示高風(fēng)險(xiǎn)基因，綠色節(jié)點(diǎn)表示低風(fēng)險(xiǎn)基因、節(jié)點(diǎn)大小表示值，紅色連線表示正向共表達(dá)，藍(lán)色連線表示負(fù)向共表達(dá)，由連線密度可知其中存在密切的聯(lián)系。

2.3 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型及分型基因生存分析、GSVA、ssGSEA、PCA和差異分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，可將樣品分為A和B 2個(gè)亞型（圖3-A）；對(duì)2個(gè)亞型進(jìn)行生存分析，如圖3-B所示，可知其存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），且A亞型預(yù)后較好；對(duì)2個(gè)亞型基因表達(dá)進(jìn)行分析，如圖3-C所示，可得A亞型多數(shù)呈現(xiàn)高表達(dá)，B亞型則相反；通過(guò)GSVA分析，則能看出A亞型主要對(duì)免疫相關(guān)通路呈現(xiàn)高表達(dá)，B亞型主要表現(xiàn)為低表達(dá)（圖3-D）；從ssGSEA分析結(jié)果（圖3-E）可知，22個(gè)在兩亞型間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的免疫細(xì)胞，其中活化B細(xì)胞、活化的CD4細(xì)胞、活化的CD8細(xì)胞、活化的樹(shù)突狀細(xì)胞、CD56bright自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、γδT細(xì)胞、未成熟B細(xì)胞、未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、1型T輔助細(xì)胞、17型T輔助細(xì)胞、2型T輔助細(xì)胞均在A亞型中含量高；唯有CD56dim自然殺傷細(xì)胞在B亞型中含量高；PCA分析（圖3-F）顯示，根據(jù)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)量可將A與B亞型明顯區(qū)分；最后通過(guò)設(shè)置|log2FC|＞0.585、＜0.05，篩選出細(xì)胞焦亡分型的顯著差異基因有1223個(gè)。

2.4 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型差異基因GO富集分析和KEGG通路富集分析

通過(guò)對(duì)1223個(gè)細(xì)胞焦亡分型的顯著差異基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明，BP主要涉及T細(xì)胞活化、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、單核細(xì)胞分化、細(xì)胞活化的正調(diào)控、T細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)等免疫過(guò)程；MF主要涉及受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、免疫受體等；CC主要涉及質(zhì)膜筏的外側(cè)、內(nèi)吞囊泡、膜筏、膜微區(qū)等（圖4-A）。KEGG通路富集分析顯示，主要包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒感染、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、造血細(xì)胞譜系、結(jié)核、吞噬體、破骨細(xì)胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、TNF信號(hào)通路等炎癥、免疫相關(guān)通路（圖4-B）。

表1 細(xì)胞焦亡相關(guān)基因

Table 1 Information of pyroptosis-related genes

序號(hào)基因符號(hào)基因名稱 1BAK1B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）同源拮抗劑/殺傷劑（Bcl-2 homologous antagonist/killer） 2BAXBcl-2-相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein） 3CASP1半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1） 4CASP3半胱氨酸天冬氨酸酶-3（Caspase-3） 5CASP4半胱氨酸天冬氨酸酶-4（Caspase-4） 6CASP5半胱氨酸天冬氨酸酶-5（Caspase-5） 7CHMP2A帶電多泡體蛋白2a（charged multivesicular body protein 2a） 8CHMP2B帶電多泡體蛋白2b（charged multivesicular body protein 2b） 9CHMP3帶電多泡體蛋白3（charged multivesicular body protein 3） 10CHMP4A帶電多泡體蛋白4a（charged multivesicular body protein 4a） 11CHMP4B帶電多泡體蛋白4b（charged multivesicular body protein 4b） 12CHMP4C帶電多泡體蛋白4c（charged multivesicular body protein 4c） 13CHMP6帶電多泡體蛋白6（charged multivesicular body protein 6） 14CHMP7帶電多泡體蛋白7（charged multivesicular body protein 7） 15CYCS細(xì)胞色素C（cytochrome C） 16ELANE中性白細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase） 17GSDMD焦孔素D（gasdermin D） 18GSDME焦孔素E（gasdermin E） 19GZMB粒酶B（granzyme B） 20HMGB1高遷移率基團(tuán)蛋白B1（high mobility group protein B1） 21IL18白細(xì)胞介素-18（interleukin-18） 22IL1A白細(xì)胞介素-1α（interleukin-1alpha） 23IL1B白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1beta） 24IRF1干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1） 25IRF2干擾素調(diào)節(jié)因子2（interferon regulatory factor 2） 26TP53細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53） 27TP63腫瘤蛋白63（tumor protein 63） 28AIM2干擾素誘導(dǎo)蛋白AIM2（interferon-inducible protein AIM2） 29CASP6半胱氨酸天冬氨酸酶-6（Caspase-6） 30CASP8半胱氨酸天冬氨酸酶-8（Caspase-8） 31CASP9半胱氨酸天冬氨酸酶-9（Caspase-9） 32GPX4磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase） 33GSDMA焦孔素A（gasdermin A） 34GSDMB焦孔素B（gasdermin B） 35GSDMC焦孔素C（gasdermin C） 36IL6白細(xì)胞介素6（interleukin-6） 37NLRC4含NLR家族CARD域蛋白4（NLR family CARD domain-containing protein 4） 38NLRP1核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 1） 39NLRP2核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白2（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2） 40NLRP3核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3） 41NLRP6核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 6） 42NLRP7核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白7（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 7） 43NOD1核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白1（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1） 44NOD2核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2） 45PJVKpejvakin 46PLCG11-磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1（1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-1） 47PRKACAcAMP依賴性蛋白激酶催化亞基α（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha） 48PYCARD含有 CARD 的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD） 49SCAF11富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子2相互作用蛋白11（serine/arginine-rich splicing factor 2-interacting protein 11） 50TIRAP受體結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白（Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein Toll/interleukin-1） 51TNF腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor） 52GZMA顆粒酶A（granzyme A）

a-細(xì)胞焦亡基因突變頻率瀑布圖（圖中A為腺嘌呤，T為胸腺嘧啶，C為胞嘧啶，G為鳥(niǎo)嘌呤） b-拷貝數(shù)變異頻率統(tǒng)計(jì)圖 c-細(xì)胞焦亡基因拷貝數(shù)圈圖 d-細(xì)胞焦亡基因差異分析箱線圖 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下同

2.5 乳腺癌細(xì)胞焦亡分型預(yù)后相關(guān)差異基因再分型及其生存分析與表達(dá)分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)1223個(gè)細(xì)胞焦亡分型預(yù)后顯著差異基因進(jìn)行再分型，可得到3組分型基因，分別為I、II、III，如圖5-A所示；對(duì)這3組分型基因進(jìn)行生存分析，3組分型差異存在顯著性差異（＜0.05），且其中I組預(yù)后最好，II組預(yù)后最差（圖5-B）；對(duì)3組分型基因進(jìn)行表達(dá)分析，可見(jiàn)I組主要表現(xiàn)為高表達(dá)，II組主要呈現(xiàn)低表達(dá)（圖5-C），結(jié)合生存分析及基因表達(dá)分析可知，相關(guān)基因呈現(xiàn)高表達(dá)則預(yù)后較好，反之則預(yù)后較差，與預(yù)期一致；接下來(lái)對(duì)3組細(xì)胞焦亡基因分型進(jìn)行差異分析，可知3組之間超過(guò)80%細(xì)胞焦亡基因存在顯著性差異，其中超過(guò)60%細(xì)胞焦亡基因?yàn)镮組高表達(dá)，超過(guò)70%細(xì)胞焦亡基因?yàn)镮I組低表達(dá)（圖5-D）。

2.6 預(yù)后模型構(gòu)建、預(yù)后分析及其可視化結(jié)果

2.6.1 預(yù)后模型Lasso回歸結(jié)果及交叉驗(yàn)證 結(jié)果如圖6-A、B所示，COX回歸模型得出2組及總體的風(fēng)險(xiǎn)值；預(yù)后模型構(gòu)建過(guò)程如圖6-C所示，即首先根據(jù)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)量將樣品分為2個(gè)亞型（A、B亞型），然后通過(guò)差異分析找出該2亞型中存在的差異基因，通過(guò)分析差異基因的表達(dá)量對(duì)基因進(jìn)行分型（分型I、分型II和分型III）；對(duì)差異基因進(jìn)行生存分析以找出預(yù)后相關(guān)的差異基因并構(gòu)建預(yù)后相關(guān)模型；再根據(jù)預(yù)后模型將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，最終根據(jù)預(yù)后模型預(yù)測(cè)患者的生存期。

表2 細(xì)胞焦亡基因生存分析

Table 2 Survival analysis of pyroptosis genes

基因HRP值基因HRP值 BAK11.086 233 4160.087 484 657AIM20.931 151 0620.066 065 479 BAX0.970 691 3540.105 234 434CASP60.910 201 2930.084 018 105 CASP10.896 254 8790.010 444 668CASP80.818 232 0470.005 053 259 CASP31.067 483 8400.158 124 658CASP90.697 598 3540.002 007 942 CASP40.826 676 9950.014 357 829GPX40.852 816 8900.020 811 101 CASP50.928 306 5720.109 390 972GSDMB0.967 202 3440.064 985 900 CHMP2A0.848 139 8750.018 369 884GSDMC1.113 768 9640.004 412 956 CHMP2B1.345 011 5030.001 323 049IL61.004 507 1980.280 644 973 CHMP4B0.874 446 5480.046 762 979NLRC41.172 839 9550.030 111 467 CHMP4C1.190 235 2730.008 719 777NLRP10.942 709 2080.032 939 873 CHMP60.813 665 0390.005 475 246NLRP20.956 027 0220.068 839 075 CHMP70.943 839 4580.010 553 598NLRP30.944 446 0080.042 430 619 CYCS1.262 775 2940.005 881 638NLRP60.893 862 7040.022 686 052 ELANE0.877 124 5100.084 815 313NLRP70.928 231 6950.012 910 692 GSDMD0.917 067 5750.001 474 721NOD11.013 837 2360.087 182 922 GZMB0.880 111 2550.001 741 422NOD20.986 949 2810.054 333 534 HMGB11.001 715 0220.244 834 971PLCG11.035 148 3180.109 209 786 IL180.802 492 4070.000 842 706PRKACA1.082 406 9900.115 309 162 IL1A0.943 171 5880.008 360 707PYCARD0.872 856 3540.000 215 098 IL1B0.976 908 5220.050 530 822SCAF111.111 688 2610.036 312 269 IRF10.813 292 0160.001 267 743TIRAP1.223 149 4130.016 585 961 IRF20.636 756 1190.002 620 915TNF0.972 806 3410.129 396 207 TP531.125 176 5660.012 799 973GZMA0.867 120 1070.000 788 690 TP630.863 959 6550.000 120 009

A-預(yù)后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)胞焦亡基因生存曲線 B-細(xì)胞焦亡基因預(yù)后網(wǎng)絡(luò)

A-BRCA細(xì)胞焦亡聚類分型結(jié)果（1-聚類1，2-聚類2） B-細(xì)胞焦亡分型生存曲線 C-細(xì)胞焦亡分型熱圖 D-細(xì)胞焦亡分型GSVA分析熱圖 E-細(xì)胞焦亡分型免疫細(xì)胞差異分析箱線圖 F-細(xì)胞焦亡分型PCA散點(diǎn)圖

2.6.2 細(xì)胞焦亡分型風(fēng)險(xiǎn)得分的差異分析 結(jié)果表明A、B兩亞型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中分型B的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分更高，如圖6-D所示；基因分型風(fēng)險(xiǎn)得分的差異分析結(jié)果表明分型I、II及分型II、III之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分型I、III之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)可以看出分型II的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分最高，如圖6-E所示。

圖4 細(xì)胞焦亡分型差異基因GO及KEGG富集分析氣泡圖

2.6.3 高、低風(fēng)險(xiǎn)組細(xì)胞焦亡基因表達(dá)量的差異分析 結(jié)果如圖6-F所示，高、低風(fēng)險(xiǎn)組中細(xì)胞焦亡基因絕大多數(shù)（41/52）存在顯著差異，且這些基因中除、、3個(gè)基因在高風(fēng)險(xiǎn)組為高表達(dá)外，其余均表現(xiàn)為低表達(dá)；此外由生存曲線（圖6-G）可知，不論訓(xùn)練組、驗(yàn)證組還是總體組（訓(xùn)練組及驗(yàn)證組的總和）其高、低風(fēng)險(xiǎn)組的生存時(shí)間都存在顯著差異，說(shuō)明構(gòu)建的預(yù)后模型可區(qū)分高、低風(fēng)險(xiǎn)組的患者；由ROC曲線（圖6-H）可知，訓(xùn)練組線下面積最大而驗(yàn)證組線下面積最小，因此通過(guò)預(yù)后模型預(yù)測(cè)生存期訓(xùn)練組準(zhǔn)確性最大而驗(yàn)證組最小，而不論訓(xùn)練組、驗(yàn)證組還是總體組線下面積都大于0.65，因此預(yù)后模型預(yù)測(cè)生存期準(zhǔn)確性均較高；列線圖可提供預(yù)后模型對(duì)患者不同臨床特征生存期的預(yù)測(cè)，由圖6-I可知女性、年齡62歲、高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后差，其1年、3年、5年生存率分別為96.7%、83.4%、70.9%，圖6-J則顯示了列線圖生存率預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性；最后根據(jù)患者高、低風(fēng)險(xiǎn)排序繪制風(fēng)險(xiǎn)曲線（圖6-K），不論訓(xùn)練組、驗(yàn)證組還是總體組3者都是隨風(fēng)險(xiǎn)值增高而死亡人數(shù)增多，與預(yù)測(cè)相符，而風(fēng)險(xiǎn)熱圖則提示所列基因皆為低風(fēng)險(xiǎn)基因。

2.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與免疫細(xì)胞含量分析結(jié)果

通過(guò)CIBERSORT計(jì)算求得每種免疫細(xì)胞在每個(gè)樣品中的相對(duì)含量作為免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果；利用該結(jié)果進(jìn)一步得出風(fēng)險(xiǎn)得分與免疫細(xì)胞相關(guān)性，其中存在顯著負(fù)相關(guān)性的有幼稚B細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1、單核細(xì)胞、γδT細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、靜息CD4記憶T細(xì)胞、漿細(xì)胞；存在顯著正相關(guān)性的有活化樹(shù)突狀細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞，見(jiàn)圖7-A。參與模型構(gòu)建的基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性如圖7-B所示，其中大部分基因與免疫細(xì)胞存在相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)性較正相關(guān)性者多。

2.8 腫瘤微環(huán)境分析、腫瘤突變負(fù)荷分析及干細(xì)胞分析結(jié)果

2.8.1 腫瘤微環(huán)境分析 首先獲得腫瘤微環(huán)境TCGA、GEO兩數(shù)據(jù)庫(kù)臨床樣品的評(píng)分結(jié)果，包含基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分、免疫細(xì)胞評(píng)分、總評(píng)分以及腫瘤純度4個(gè)方面；然后將腫瘤微環(huán)境評(píng)分結(jié)果按照高、低風(fēng)險(xiǎn)分組進(jìn)行差異分析，由圖8-A可知基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分、免疫細(xì)胞評(píng)分及總評(píng)分在高、低風(fēng)險(xiǎn)組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且腫瘤微環(huán)境評(píng)分均為高風(fēng)險(xiǎn)組更低；使用瀑布圖展示高、低風(fēng)險(xiǎn)組的突變數(shù)據(jù)，如圖8-B、C所示，2組的突變率較接近（84.12%、85.89%），而高風(fēng)險(xiǎn)組突變率略高于低風(fēng)險(xiǎn)組。

2.8.2 腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)性分析 結(jié)果顯示高、低風(fēng)險(xiǎn)組間腫瘤突變負(fù)荷存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中高風(fēng)險(xiǎn)組患者的腫瘤突變負(fù)荷較高（圖8-D）；對(duì)3組基因分型樣品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及腫瘤突變負(fù)荷進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖8-E可知二者相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈正相關(guān)。

A-細(xì)胞焦亡分型預(yù)后差異基因再聚類分型結(jié)果 B-預(yù)后差異基因分型生存曲線 C-預(yù)后差異基因分型熱圖 D-預(yù)后差異基因分型的細(xì)胞焦亡基因差異分析箱線圖

2.8.3 干細(xì)胞相關(guān)性分析 結(jié)果（圖8-F）顯示干細(xì)胞指數(shù)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間存在相關(guān)性（＜0.05），且二者呈正相關(guān)。

2.9 “細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)-成分-中藥”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與中藥篩選結(jié)果

通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，找到18個(gè)細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，將與該18個(gè)細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的34種有效成分（表3）及380味中藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（圖9-A）并進(jìn)行分析，分別通過(guò)節(jié)點(diǎn)度（degree）值篩選核心成分和核心中藥，核心成分（度值＞2.5倍中位數(shù)）主要包括槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、β-胡蘿卜素（β-carotene）、金合歡素（acacetin）、黃芩素（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、表沒(méi)食子兒茶精沒(méi)食子酸酯 [(?)-epigallocatechin-3-gallate]、川陳皮素（nobiletin）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）、柚皮素（naringenin）；核心中藥（度值＞2.5倍中位數(shù)）主要包括木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢(qián)草、敗醬草、枇杷葉、關(guān)黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花17味。對(duì)380味中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，其中四氣以溫、寒、微寒、平為主；五味以苦、辛、甘為主；歸經(jīng)主要?dú)w肝、肺經(jīng)，見(jiàn)圖9-B、C、D。

A-Lasso回歸模型圖 B-交叉驗(yàn)證圖 C-預(yù)后模型構(gòu)建過(guò)程?；鶊D D-細(xì)胞焦亡分型風(fēng)險(xiǎn)得分差異分析圖 E-預(yù)后差異基因分型風(fēng)險(xiǎn)得分差異分析圖 F-高、低風(fēng)險(xiǎn)組細(xì)胞焦亡基因表達(dá)差異分析箱線圖 G-訓(xùn)練組、驗(yàn)證組、總體組的高低風(fēng)險(xiǎn)生存分析曲線 H-訓(xùn)練組、驗(yàn)證組、總體組ROC曲線 I-生存期預(yù)測(cè)列線圖 J-列線圖校準(zhǔn)曲線 K-訓(xùn)練組、驗(yàn)證組、總體組風(fēng)險(xiǎn)曲線

A-diagram of model of lasso regression B-cross-validation results C-alluvial diagram of prognostic model construction process D-diagram of differential analysis of risk score in different clusters of pyroptosis genes E-diagram of differential analysis of risk score in different clusters of prognostic differential genes F-box plot of differential analysis of pyroptosis genes’ expression in group of high or low risk G-survival curves of high or low risk in train, test and total groups H-ROC curves in train, test and total groups I-nomogram of life time prediction J-nomogram calibration curve K-risk curves of train, test and total groups

圖6 預(yù)后模型構(gòu)建、預(yù)后分析及其可視化結(jié)果

Fig. 6 Results of construction of prognostic model, prognostic analysis and their visualization

3 討論

細(xì)胞焦亡作為一種受調(diào)節(jié)的促炎形式的細(xì)胞死亡，其在形態(tài)學(xué)、機(jī)制學(xué)和病理生理學(xué)上不同于包括細(xì)胞凋亡和壞死在內(nèi)的其他形式的細(xì)胞死亡，其特點(diǎn)是質(zhì)膜快速破裂，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)，包括IL-1β、IL-18和警報(bào)素高遷移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB-1）等[17]。細(xì)胞焦亡已被確認(rèn)與心血管疾病、傳染病、卵巢癌、肺癌等疾病有關(guān)，但是其與乳腺癌的關(guān)系卻仍缺少相關(guān)研究證實(shí)[18-20]，且相關(guān)的生物信息學(xué)研究也缺乏涉及中藥方面的分析，因此本研究對(duì)3者的關(guān)系進(jìn)行了一定程度探究。

本研究首先根據(jù)乳腺癌細(xì)胞焦亡基因突變分析可知突變頻率遠(yuǎn)高于其他基因，而研究證實(shí)的突變可能是除乳腺癌1型易感蛋白（breast cancer type 1 susceptibility protein，）、乳腺癌2型易感蛋白（Breast cancer type 2 susceptibility protein，）外的另一個(gè)導(dǎo)致乳腺癌的關(guān)鍵因素，其與三陰性乳腺癌有關(guān)[21]；腫瘤組和正常組的對(duì)比則可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)大多數(shù)在二者中存在顯著差異，而腫瘤組表達(dá)上調(diào)者略多于表達(dá)下調(diào)者，研究認(rèn)為[4]細(xì)胞焦亡與癌癥的關(guān)系復(fù)雜，不同組織和遺傳背景的細(xì)胞焦亡對(duì)癌癥的影響不同而呈現(xiàn)促癌和抑癌2種作用。乳腺癌細(xì)胞焦亡基因生存分析顯示，生存曲線差異顯著且高風(fēng)險(xiǎn)的基因中高表達(dá)與乳腺癌患者較差的存活率相關(guān)[22]，并可介導(dǎo)癌細(xì)胞中的非典型細(xì)胞焦亡途徑，導(dǎo)致腫瘤壞死；在腫瘤組中低表達(dá)，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡[23]；作為磷脂酶C的主要亞型，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要介質(zhì)，其在各種癌癥中經(jīng)常富集和突變，并參與腫瘤發(fā)生的過(guò)程，包括增殖、遷移和侵襲[24]；有文獻(xiàn)報(bào)道稱其可作為乳腺癌細(xì)胞凋亡的生物標(biāo)志物在化療后表達(dá)增加[25]；分析研究認(rèn)為與乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移有關(guān)[26]；所參與的通路則有促成雌激素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和內(nèi)分泌抵抗的作用[27]；在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，且在乳腺癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及治療抵抗方面起作用[28]?？傮w來(lái)說(shuō)細(xì)胞焦亡基因在乳腺癌中突變頻率不高，但其突變大部分與預(yù)后相關(guān)。

A-風(fēng)險(xiǎn)得分與免疫細(xì)胞相關(guān)性圖 B-模型構(gòu)建基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖

通過(guò)將乳腺癌細(xì)胞焦亡基因進(jìn)行聚類及分型，發(fā)現(xiàn)A亞型患者生存結(jié)局優(yōu)于B亞型，且A亞型中細(xì)胞焦亡基因多數(shù)呈現(xiàn)高表達(dá)；GSVA、ssGSEA分析顯示，炎癥相關(guān)通路、免疫細(xì)胞均在A亞型中富集，A亞型特征為細(xì)胞焦亡基因高表達(dá)、免疫激活和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、有生存優(yōu)勢(shì)，B亞型與之相反。對(duì)細(xì)胞焦亡基因分型進(jìn)行預(yù)后差異分析，得出差異基因1223個(gè)，并將之再次聚類獲得3組基因分型，同樣得到I組細(xì)胞焦亡基因表達(dá)最高、生存預(yù)期最好，II組細(xì)胞焦亡基因表達(dá)最低、生存預(yù)期最差，2次分型結(jié)果一致。通過(guò)構(gòu)建預(yù)后模型并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，得出高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后差，低風(fēng)險(xiǎn)組細(xì)胞焦亡基因高表達(dá)，且有較高的準(zhǔn)確性。不論免疫浸潤(rùn)還是腫瘤微環(huán)境分析都得出同一個(gè)結(jié)論，即高風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后較差、細(xì)胞焦亡基因低表達(dá)、生存期較短、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)少；低風(fēng)險(xiǎn)組則與之相反，這也反映了細(xì)胞焦亡與乳腺癌及其腫瘤微環(huán)境、免疫反應(yīng)之間的關(guān)系。研究認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境與乳腺癌的產(chǎn)生與進(jìn)展密切相關(guān)[29-30]，而其則表現(xiàn)為大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，如B細(xì)胞浸潤(rùn)與晚期乳腺癌相關(guān)、CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)與乳腺癌預(yù)后相關(guān)[30-31]。

A-高、低風(fēng)險(xiǎn)組腫瘤微環(huán)境差異分析小提琴圖 B-低風(fēng)險(xiǎn)組基因突變頻率瀑布圖 C-高風(fēng)險(xiǎn)組基因突變頻率瀑布圖 D-高、低風(fēng)險(xiǎn)組腫瘤突變負(fù)荷差異分析箱線圖 E-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤突變負(fù)荷相關(guān)性散點(diǎn)圖 F-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與干細(xì)胞相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

表3 18個(gè)細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)相關(guān)成分

Table 3 Related ingredients of 18 pyroptosis genes

MOLID化學(xué)成分OB/%DLMOLID化學(xué)成分OB/%DL MOL006821(?)-epigallocatechin-3-gallate55.090.77MOL003187triptolide51.290.68 MOL009135ellipticine30.820.28MOL005944matrine63.770.25 MOL000422kaempferol41.880.24MOL007154tanshinone iia49.890.40 MOL010616eckol87.060.63MOL002773β-carotene37.180.58 MOL000358β-sitosterol36.910.75MOL002928oroxylin A41.370.23 MOL005828nobiletin61.670.52MOL001592piperine42.520.23 MOL013179fisetin52.600.24MOL001714podophyllotoxin59.940.86 MOL000471aloe-emodin83.380.24MOL005916irisolidone37.780.30 MOL001689acacetin34.970.24MOL000546diosgenin80.880.81 MOL002714baicalein33.520.21MOL012920sinomenine30.980.46 MOL009593verticinone60.070.67MOL001924paeoniflorin53.870.79 MOL000173wogonin30.680.23MOL003627sophocarpine64.260.25 MOL005344ginsenoside Rh236.320.56MOL003680sophoridine60.070.25 MOL000098quercetin46.430.28MOL013079dl-praeruptorin A46.460.53 MOL004328naringenin59.290.21MOL004575astilbin36.460.74 MOL000006luteolin36.160.25MOL002662rutaecarpine40.300.60 MOL001439arachidonic acid45.570.20MOL002322isovitexin31.290.72

A-“細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)-成分-中藥”網(wǎng)絡(luò)圖 B-細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥四氣分布 C-細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥五味分布 D-細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥歸經(jīng)分布

從上述分析可知，細(xì)胞焦亡與乳腺癌有顯著的相關(guān)性，因此挖掘可調(diào)控細(xì)胞焦亡靶基因的中藥則可為乳腺癌治療藥物的研發(fā)提供參考。乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”范疇，其發(fā)病主要為情志失調(diào)、脾胃損傷、沖任失調(diào)，痰濁、瘀血乘結(jié)乳房而生[32]。從數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果來(lái)看，所得核心中藥木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢(qián)草、敗醬草、枇杷葉、關(guān)黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花[33-49]等均具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗炎作用，其所含成分中山柰酚可通過(guò)抑制Caspase-1的表達(dá)和活性、增加Toll樣受體4和NLRP3的蛋白表達(dá)以及抑制GSDMD的分解來(lái)減少細(xì)胞焦亡[50]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明槲皮素可阻斷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡來(lái)抑制骨關(guān)節(jié)炎[51]；木犀草素則被報(bào)道有助于減輕膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型肺組織中Caspase-11依賴的細(xì)胞焦亡[52]；黃芩素可上調(diào)微小RNA-192-5p（miR-192-5p）/硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）軸而抑制NLRP3/Caspase-1通路，從而調(diào)控細(xì)胞焦亡和炎癥[53]；漢黃芩素可通過(guò)抑制GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性[54]；表沒(méi)食子兒茶精沒(méi)食子酸酯可抑制Caspase-1激活和IL-1β分泌[55]；柚皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA-200b（miR-200b）/鋅指蛋白802（zinc finger protein 802，JAZF1）軸抑制乳腺癌的發(fā)生[56]。根據(jù)生物信息學(xué)分析表明，乳腺癌中細(xì)胞焦亡過(guò)程涉及免疫浸潤(rùn)與炎性因子聚集，而炎性因子聚集多造成局部炎癥發(fā)熱，該過(guò)程與中醫(yī)的“火毒”存在一定的相似性[57]，因此其治療用藥以苦、寒為主；而內(nèi)火多因“郁”而成，毒則為“聚而不散”所致，故用藥應(yīng)當(dāng)辛散溫通；中醫(yī)歷來(lái)強(qiáng)調(diào)顧護(hù)正氣，正氣存內(nèi)，邪不可干，故甘平補(bǔ)益之品當(dāng)為輔。從歸經(jīng)來(lái)看細(xì)胞焦亡相關(guān)藥物主要?dú)w肝、肺、脾、胃經(jīng)，因龍虎回環(huán)、脾升胃降皆為周身氣機(jī)之樞，故細(xì)胞焦亡、乳腺癌此類“郁”所致的病理過(guò)程或疾患應(yīng)以此為歸經(jīng)。

4 結(jié)論

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的乳腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞焦亡相關(guān)多組學(xué)分析，從而得出細(xì)胞焦亡與乳腺癌有顯著的相關(guān)性，其涉及腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)機(jī)制。而對(duì)細(xì)胞焦亡起調(diào)控作用的中藥主要為木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢(qián)草、敗醬草、枇杷葉、關(guān)黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花，其主要為苦寒，次為辛溫，輔以甘平之品，而主要調(diào)節(jié)肝、肺、脾、胃等臟腑，發(fā)揮清熱解毒、調(diào)和肝脾之功。本研究結(jié)果可為中藥的臨床應(yīng)用與進(jìn)一步研究提供指導(dǎo)與參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Shi J J, Gao W Q, Shao F. Pyroptosis: gasdermin-mediated programmed necrotic cell death [J]., 2017, 42(4): 245-254.

[2] Kovacs S B, Miao E A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis [J]., 2017, 27(9): 673-684.

[3] Fang Y, Tian S W, Pan Y T,. Pyroptosis: A new frontier in cancer [J]., 2020, 121: 109595.

[4] Xia X J, Wang X, Cheng Z,. The role of pyroptosis in cancer: Pro-cancer or pro- “host”? [J]., 2019, 10(9): 650.

[5] Nagini S. Breast cancer: Current molecular therapeutic targets and new players [J]., 2017, 17(2): 152-163.

[6] Rojas K, Stuckey A. Breast cancer epidemiology and risk factors [J]., 2016, 59(4): 651-672.

[7] Li T, Mello-Thoms C, Brennan P C. Descriptive epidemiology of breast cancer in China: Incidence, mortality, survival and prevalence [J]., 2016, 159(3): 395-406.

[8] Fan L, Strasser-Weippl K, Li J J,. Breast cancer in China [J]., 2014, 15(7): e279-e289.

[9] Chetlen A, Mack J, Chan T. Breast cancer screening controversies: Who, when, why, and how? [J]., 2016, 40(2): 279-282.

[10] Pan H C, Gray R, Braybrooke J,. 20-year risks of breast-cancer recurrence after stopping endocrine therapy at 5 years [J]., 2017, 377(19): 1836-1846.

[11] Peart O. Metastatic breast cancer [J]., 2017, 88(5): 519M-539M.

[12] McDonald E S, Clark A S, Tchou J,. Clinical diagnosis and management of breast cancer [J]., 2016, 57(Suppl 1): 9S-16S.

[13] Condorelli R, Vaz-Luis I. Managing side effects in adjuvant endocrine therapy for breast cancer [J]., 2018, 18(11): 1101-1112.

[14] Taylor C W, Kirby A M. Cardiac side-effects from breast cancer radiotherapy [J].(), 2015, 27(11): 621-629.

[15] Lacouture M, Sibaud V. Toxic side effects of targeted therapies and immunotherapies affecting the skin, oral mucosa, hair, and nails [J]., 2018, 19(Suppl 1): 31-39.

[16] 李云祥, 梁引庫(kù), 高飛雄, 等. 中藥治療乳腺癌疾病研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2019, 25(3): 211-219.

[17] Xu Y J, Zheng L, Hu Y W,. Pyroptosis and its relationship to atherosclerosis [J]., 2018, 476: 28-37.

[18] Zeng Z L, Li G H, Wu S Y,. Role of pyroptosis in cardiovascular disease [J]., 2019, 52(2): e12563.

[19] Man S M, Karki R, Kanneganti T D. Molecular mechanisms and functions of pyroptosis, inflammatory caspases and inflammasomes in infectious diseases [J]., 2017, 277(1): 61-75.

[20] Zheng S S, Xie X Y, Guo X K,. Identification of a pyroptosis-related gene signature for predicting overall survival and response to immunotherapy in hepatocellular carcinoma [J]., 2021, 12: 789296.

[21] Sheikh A, Hussain S A, Ghori Q,. The spectrum of genetic mutations in breast cancer [J]., 2015, 16(6): 2177-2185.

[22] Hou J W, Zhao R C, Xia W Y,. PD-L1-mediated gasdermin C expression switches apoptosis to pyroptosis in cancer cells and facilitates tumour necrosis [J]., 2020, 22(10): 1264-1275.

[23] Ke H L, Wang X P, Zhou Z,. Effect of weimaining on apoptosis and Caspase-3 expression in a breast cancer mouse model [J]., 2021, 264: 113363.

[24] Jang H J, Suh P G, Lee Y J,. PLCγ1: Potential arbitrator of cancer progression [J]., 2018, 67: 179-189.

[25] Kadam C Y, Abhang S A. Apoptosis markers in breast cancer therapy [J]., 2016, 74: 143-193.

[26] Zohny S F, El-Shinawi M. Significance of survivin and Bcl-2 homologous antagonist/killer mRNA in detection of bone metastasis in patients with breast cancer [J]., 2011, 28(Suppl 1): S108-S114.

[27] Yang F, Xie H Y, Yang L F,. Stabilization of MORC2 by estrogen and antiestrogens through GPER1- PRKACA-CMA pathway contributes to estrogen-induced proliferation and endocrine resistance of breast cancer cells [J]., 2020, 16(6): 1061-1076.

[28] Masjedi A, Hashemi V, Hojjat-Farsangi M,. The significant role of interleukin-6 and its signaling pathway in the immunopathogenesis and treatment of breast cancer [J]., 2018, 108: 1415-1424.

[29] Soysal S D, Tzankov A, Muenst S E. Role of the tumor microenvironment in breast cancer [J]., 2015, 82(3/4): 142-152.

[30] Mittal S, Brown N J, Holen I. The breast tumor microenvironment: Role in cancer development, progression and response to therapy [J]., 2018, 18(3): 227-243.

[31] Wu J B, Zhu Y Y, Luo M M,. Comprehensive analysis of pyroptosis-related genes and tumor microenvironment infiltration characterization in breast cancer [J]., 2021, 12: 748221.

[32] Kresovich J K, O'Brien K M, Xu Z L,. Prediagnostic immune cell profiles and breast cancer [J]., 2020, 3(1): e1919536.

[33] 譚新華, 陸德銘. 中醫(yī)外科學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1999: 396.

[34] Cao Y, Cao W J, Qiu Y M,. Oroxylin A suppresses ACTN1expression to inactivate cancer-associated fibroblasts and restrain breast cancer metastasis [J]., 2020, 159: 104981.

[35] Wu J Y C, Yu Z L, Fong W F,. Chemotherapeutic activities ofand its reversal effect on multidrug resistance in cancer cells [J]., 2013, 10(4): 36-40.

[36] Zhao H J, Liu T, Mao X,. Fructustannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cellsvia MAPK/MMP pathways [J]., 2015, 36(6): 758-768.

[37] 夏夢(mèng)雨, 張雪, 王云, 等. 白果的炮制方法、化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥房, 2020, 31(1): 123-128.

[38] Powell C B, Fung P, Jackson J,. Aqueous extract of, a Chinese herb used for ovarian cancer, induces apoptosis of ovarian cancer cell lines [J]., 2003, 91(2): 332-340.

[39] 羅懿釩, 歐陽(yáng)文, 唐代鳳, 等. 牛膝中皂苷和甾酮類物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2020, 22(12): 2122-2136.

[40] Li X F, Xu L, Jiang H,. Flash extraction of the active constituents and its antitumor activity from,,and[J]., 2021, 34(5): 1777-1782.

[41] 姚奕, 許浚, 黃廣欣, 等. 香薷的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2661-2670.

[42] Zhou Y X, Xin H L, Rahman K,.L.: A review of phytochemistry and pharmacological effects [J]., 2015, 2015: 925631.

[43] Wang Z Y, Xia Q, Liu X,. Phytochemistry, pharmacology, quality control and future research of(Thunb.) Vahl: A review [J]., 2018, 210: 318-339.

[44] 吳西, 周雷罡, 鄧維, 等. 連錢(qián)草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 藥品評(píng)價(jià), 2021, 18(1): 4-7.

[45] Gong L N, Zou W, Zheng K Y,. The(Caprifoliaceae): A review on traditional uses, phytochemistry, pharmacology and quality control [J]., 2021, 265: 113264.

[46] Zar P P K, Yano S, Sakao K,.anticancer activity of loquat tea by inducing apoptosis in human leukemia cells [J]., 2014, 78(10): 1731-1737.

[47] 李先寬, 馮杉, 鄭艷超, 等. 黃柏與關(guān)黃柏的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2019, 42(5): 1033-1037.

[48] 李文基, 馬駿, 趙文秀. 皂角刺抗腫瘤藥理作用及化學(xué)成分研究進(jìn)展 [J]. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 37(6): 85-88.

[49] 劉雅琳, 苗晉鑫, 田碩, 等. 馬鞭草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 河南中醫(yī), 2021, 41(2): 294-299.

[50] He C L, Yang J, Jiang X L,. Kaempferol alleviates LPS-ATP mediated inflammatory injury in splenic lymphocytes via regulation of the pyroptosis pathway in mice [J]., 2019, 41(5): 538-548.

[51] Wang Q, Ying L J, Wei B,. Effects of quercetin on apoptosis and extracellular matrix degradation of chondrocytes induced by oxidative stress-mediated pyroptosis [J]., 2022, 36(2): e22951.

[52] Zhang Z T, Zhang D Y, Xie K,. Luteolin activates Tregs to promote IL-10 expression and alleviating caspase-11-dependent pyroptosis in-induced lung injury [J]., 2021, 99: 107914.

[53] Wang X Y, Cai H, Chen Z Y,. Baicalein alleviates pyroptosis and inflammation in hyperlipidemic pancreatitis by inhibiting NLRP3/Caspase-1 pathway through the miR-192-5p/TXNIP axis [J]., 2021, 101(Pt B): 108315.

[54] Xu J J, Zhang B, Chu Z L,. Wogonin alleviates cisplatin-induced cardiotoxicity in mice via inhibiting gasdermin D-mediated pyroptosis [J]., 2021, 78(4): 597-603.

[55] Zhang C, Li X, Hu X,. Epigallocatechin-3-gallate prevents inflammation and diabetes-Induced glucose tolerance through inhibition of NLRP3 inflammasome activation [J]., 2021, 93: 107412.

[56] Wang J G, Jian W J, Li Y,. Nobiletin promotes the pyroptosis of breast cancer via regulation of miR-200b/JAZF1axis [J]., 2021, 37(7): 572-582.

[57] 梁子成, 陳泓秀, 文璐, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及數(shù)據(jù)挖掘探討中藥調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡用藥規(guī)律 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2021, 28(11): 27-33.

Multi-omics analysis of pyroptosis-related genes in breast cancer and screening prediction of related traditional Chinese medicines based on bioinformatics

LIU Yi, XIE Yan-ming, LI Yuan-yuan, CUI Xin, XI Jun-yu

Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To explore the role and clinical significance of pyroptosis related genes in breast cancer and screen traditional Chinese medicines (TCMs) that can regulate pyroptosis based on bioinformatics.Breast cancer related data sets were obtained from TCGA and GEO databases; The expression and variation of pyroptosis related genes in breast cancer was evaluate by R and Perl language; Pyroptosis genotyping and prognostic differential genotyping were performed on the data sets, and multi-omics analysis was performed for each genotype; The prognostic model were constructed, risk scores were performed, and sub-group multi-omics analysis was carried out according to risk scores to test the predictive power of survival. Finally, the pyroptosis related genes were used as the targets, and the TCMSP database and Cytoscape software were used to construct “target-component-Chinese herbal medicine” network and topological analysis to obtain core TCMs and their related attributes.Most genes related to pyroptosis were abnormally expressed in breast cancer and had copy number variation; Eleven genes such as cellular tumor antigen p53 () had somatic mutations. The A subtype of pyroptosis had good prognosis, high expression of pyroptosis genes and immune-related pathways, and high content of immune cells. Type B was the opposite, and type A and B had obvious differences, the number of differential genes was 1223. The differential genes of pyroptosis were reclustered to generate three genotypes. Among them, group I had the best prognosis, group II had the worst prognosis, and pyroptosis related genes were mainly highly expressed in group I, and lowly expressed in group II. The patients were divided into high and low risk groups according to risk scores of prognostic model. The low risk group showed high expression of pyroptosis gene and good prognosis, while the high risk group showed the opposit. The prognostic evaluation of different clinical characteristics of patients could be carried out through the nomogram; The correlation analysis of immune cells and risk scores showed that most of them were negatively correlated; In the tumor microenvironment, the stromal cell score, immune cell score and total score were lower in all high risk group, and tumor mutation burden was higher in the high risk group. Stem cells were also positively correlated with the risk score. The network of “target of pyroptosis-component-TCMs” obtained 17 TCMs, such as Muhudie () and Honghua (). Their nature and flavor were mainly bitter and cold, followed by pungent and warm, supplemented by sweet and light medicines, which mainly regulate the liver, lungs, spleen and stomach, etc.The pyroptosis genes play an important role in the immunity of breast cancer, and have obvious correlation with the prognosis of breast cancer patients. The main TCMs that regulate pyroptosis include 17 medicines such asand. The conclusion can provide ideas and references for further research.

pyroptosis; bioinformatics; traditional Chinese medicine; breast cancer; multi-omics analysis;;

R285

A

0253 - 2670(2022)18 - 5768 - 18

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.020

2022-02-20

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”項(xiàng)目（2018YFC1707400）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（CI2021B003）；2021年岐黃學(xué)者支持項(xiàng)目

劉 毅（1993—），男，山西長(zhǎng)治人，博士研究生在讀，研究方向?yàn)榛谥谐伤幷鎸?shí)世界證據(jù)與價(jià)值評(píng)估研究。E-mail: 709473245@qq.com

謝雁鳴（1959—），女，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員，研究方向?yàn)橹兴幧鲜泻笤僭u(píng)價(jià)方法學(xué)研究、中西醫(yī)結(jié)合臨床、老年病學(xué)。E-mail: ktzu2018@163.com

黎元元，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幧鲜泻笤僭u(píng)價(jià)。Tel: (010)64014411-3351 E-mail: chibjyy@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]