高志穎, 李彥生, 于鎮(zhèn)華**, 金 劍, 王光華, 劉曉冰**

(1.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院 哈爾濱 150030; 2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室 哈爾濱 150081)

大氣CO濃度已從工業(yè)革命前的280 mol?L上升到現(xiàn)今的410 mol?L, 達到過去數(shù)百萬年以來的最高值, 模型預(yù)測大氣CO濃度將在2050年和2100年分別達到550 mol?L和700 mol?L。土壤微生物是地球上最重要的物質(zhì)分解者, 是驅(qū)動地球元素化學循環(huán)的“引擎”, 參與土壤有機質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化, 其群落結(jié)構(gòu)和功能的改變很可能會影響土壤有機質(zhì)的動態(tài)變化。由于土壤中的CO濃度遠高于大氣中的CO濃度, 因此大氣CO濃度的升高對土壤微生物的影響是以植物作為媒介而產(chǎn)生的間接影響。一般情況下, 大氣CO濃度升高會增強植物地上部分的光合作用, 促進植物地上部生物量的增加, 增加根際沉積物和凋落物等植物來源的碳向土壤中的輸送, 這部分碳作為土壤微生物的主要碳源和能源,能夠增加微生物的代謝活性。

大豆(Glycine max)是世界上最重要的豆科作物之一, 我國東北地區(qū)是大豆的主產(chǎn)區(qū), 其大豆產(chǎn)量占據(jù)全國大豆總產(chǎn)量的一半以上。自1923年培育出第一個品種以來, 截至20世紀末, 東北地區(qū)共培育出600余個大豆品種, 種質(zhì)資源豐富。且作為C3作物的代表, 大豆對大氣CO濃度升高的響應(yīng)比其他非豆科C3作物和C4作物更要敏感。在全球范圍內(nèi),針對大豆產(chǎn)量、生長狀況、生理過程、營養(yǎng)品質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性等對大氣CO濃度升高的響應(yīng)開展了廣泛研究: 如有研究發(fā)現(xiàn), 大氣CO濃度升高有利于提高作物產(chǎn)量; 增加大豆成熟期從土壤表面吸收的總氮量; 并且在一定程度上可顯著增加大豆R8期脂肪含量, 而顯著降低大豆籽粒中蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量; 在營養(yǎng)元素方面, 鋅(Zn)和鐵(Fe)濃度在高CO條件下也呈降低趨勢; 大氣CO濃度升高也簡化了土壤真菌的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵菌屬等。然而, 大豆根際微生物代謝功能多樣性對大氣CO濃度升高如何響應(yīng)尚不太清楚, 相關(guān)研究將對明確未來大氣CO濃度升高條件下土壤微生物的代謝過程、解析土壤微生物所參與的土壤養(yǎng)分循環(huán)過程和維持土壤碳庫的平衡, 維護土壤生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和生態(tài)功能的穩(wěn)定性具有重要意義。

據(jù)此, 本研究選取東北地區(qū)不同年代廣泛推廣的大豆品種, 利用開頂式氣室(open top chamber,OTC)模擬21世紀中葉大氣CO濃度(550 mol?L)升高條件, 通過BIOLOG方法, 解析大氣CO濃度升高條件下大豆根際土壤微生物對不同碳源利用情況的影響, 以明確未來大氣CO濃度升高條件下土壤微生物代謝功能的變化, 為進一步揭示未來大氣CO濃度升高對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的影響提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 研究方法

1.1.1 研究區(qū)域概況

試驗地點位于中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所(45°73′N, 126°61′E, 海拔128 m)。以正常大氣CO濃度410 mol?L為對照(CK), 利用開頂式氣候箱(OTC)模擬大氣CO濃度升高(550±30 mol?L)條件(EC), 每個處理設(shè)有3個重復(fù)。OTC箱體為正八邊形結(jié)構(gòu), 直徑3.5 m, 主體高2 m, 體積約為25 m,箱體主體框架由透明亞克力板(透光率＞95%)與三角鐵構(gòu)成, 頂端45°收縮口可減少外部氣體對箱內(nèi)氣體的擾動。利用空氣攪勻系統(tǒng)及外接的CO鋼瓶開關(guān)來控制保持箱內(nèi)CO均勻分布, 通過大氣CO濃度監(jiān)測系統(tǒng)(CI-301, CID, Inc.USA)實時監(jiān)測OTC內(nèi)的CO濃度。

1.1.2 供試土壤、大豆材料和生長管理

本試驗選取在東北黑土區(qū)不同年代廣泛種植的4個大豆品種: ‘小黃金’(1951年培育, 簡稱XH)、‘牡豐5號’(1972年培育, 簡稱MF)、‘綏農(nóng)14號’(1996年培育, 簡稱SN)和‘東生1號’(2003年培育, 簡稱DS)。試驗土壤采集于黑龍江省五常市農(nóng)田, 將土壤自然風干后過4 mm篩, 裝入PVC桶(底面直徑29.0 cm, 高25.5 cm), 具體施肥量參照文獻[14]。每個PVC桶內(nèi)播種6粒種子, 每個品種播種12桶, 待出苗后10 d, 每個桶內(nèi)保留2株長勢相近的幼苗, 每個品種選取6桶在正常大氣CO濃度下生長, 6桶在高CO濃度下生長, 分別隨機置于3個重復(fù)內(nèi)進行統(tǒng)一管理, 即每個OTC中每個品種有2桶。在大豆生長期控制土壤含水量為田間持水量的80%左右。

1.1.3 土壤樣品采集方法

采樣前將采樣必需的容器及工具進行滅菌。在大豆生長最旺盛的R5期(鼓粒初期), 每個OTC內(nèi), 每個品種選取長勢較好的大豆植株1桶。首先,剪掉地上植株, 將盆栽桶倒扣于滅菌報紙上, 然后將桶緩慢拔起, 用手掌輕微敲打土柱使其破碎, 使用 “抖根法”采集根際土, 將收集到的根際土放入封口袋密封置于冰盒內(nèi), 盡快運回實驗室于4 ℃冰箱保存。每個品種的CK和EC處理的土壤分別有3個重復(fù)樣品。采用烘干法測定土壤含水量。

1.1.4 土壤微生物群落代謝特征測定

本研究利用含有31種碳源的ECO生態(tài)板(BIOLOG-ECO)分析微生物代謝特征。ECO板的接種液制備過程如下: 首先, 根據(jù)已測的土壤含水量計算5 g干土所需的鮮土重。然后, 稱取相當于5 g干土重的鮮土于45 mL滅菌NaCl溶液(0.85%)中, 搖床振蕩40 min (170 rpm); 振蕩結(jié)束后, 取3 mL懸濁液加入到27 mL滅菌NaCl溶液(0.85%), 搖床振蕩20 min(170 rpm); 之后再吸取懸濁液3 mL加入到27 mL滅菌NaCl溶液(0.85%), 振蕩10 min。經(jīng)過上述3次振蕩后, 土壤懸濁液最終被稀釋1000倍, 吸取150 μL該懸濁液加入到ECO板每個小孔中, 將接種好的ECO生態(tài)板放在保濕的容器中, 于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每隔24 h用BIOLOG儀(BIOTEK Instruments INC, USA)讀取波長為590 nm下的吸光值。

1.1.5 數(shù)據(jù)分析

單孔平均顏色變化率(AWCD)可反映樣本中吸光度特征。常通過繪制每個樣品的 AWCD值隨時間的變化曲線來體現(xiàn)微生物平均活性的變化, 反映微生物碳源代謝的平均狀況。其計算公式如下:

式中: C為每個碳源孔的吸光度值, R為對照孔吸光度值。

多樣性指數(shù)的計算包括Shannon指數(shù)、Simpon指數(shù)和Invsimpson指數(shù), 計算公式參照文獻[18]。采用R軟件vegan包進行主成分分析, 主成分響應(yīng)曲線分析(PRC)參照王強等的方法。繪圖應(yīng)用RStudio (Version 1.2.5033)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大豆品種根際土壤微生物群落碳源代謝特征對大氣CO2濃度升高的響應(yīng)

圖1a和1b分別為不同大豆品種根際微生物在正常CO濃度和高CO濃度下的AWCD變化趨勢。從中可以看出品種SN在正常CO濃度下整個培養(yǎng)期內(nèi)具有較高的AWCD值, 而品種MF則在高CO條件下整個培養(yǎng)時期內(nèi)具有較高的AWCD值。表明不同大豆品種根際微生物對不同碳源的代謝受大氣CO升高的影響。因此, 選取培養(yǎng)時間為96 h的AWCD值進一步對不同大豆品種在不同CO濃度下的微生物代謝功能多樣性進行深入分析。

圖1 正常CO2濃度(a)和CO2濃度升高(b)條件下不同大豆品種根際微生物在BIOLOG-ECO板上的平均顏色變化率(AWCD)Fig.1 AWCD of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under ambient CO2 (a) and elevated CO2 (b)concentrations

2.2 大氣CO2濃度升高對不同大豆品種根際土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響

不同大豆品種根際土壤微生物在不同大氣CO濃度條件下培養(yǎng)96 h的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Invsimpson指數(shù)如圖2所示。從圖中可以看出品種XH、MF和DS上述3個指數(shù)在大氣CO濃度升高條件下略有增加但均沒有顯著差異。但品種SN在大氣CO濃度升高條件下, 上述3個指數(shù)均顯著低于正常大氣CO濃度條件下的指數(shù)。

圖2 不同大豆品種根際土壤微生物在大氣CO2濃度升高(EC)及不升高(CK)處理下的微生物多樣性指數(shù)Fig.2 Diversity indexes of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under elevated CO2 (EC) and ambient CO2 (CK)concentrations

2.3 大氣CO2濃度升高下不同大豆品種根際土壤微生物碳源利用的主成分分析

雙標圖(biplot)可將不同土壤樣品信息和具體碳源類型相結(jié)合, 如圖3所示, 相連的為3次重復(fù), 紅色箭頭表征不同碳源吸光度的變化梯度, 體現(xiàn)了不同樣本在碳源吸光度(A2-H4)變化梯度上的分布。對不同大豆品種根際微生物在正常CO濃度(CK)下以及高CO濃度(EC)下的土壤微生物群落功能多樣性進行主成分分析(PCA), 結(jié)果表明, 前兩個主成分PC1和PC2分別解釋了原變量特征的35.12%和11.67%。從圖3可以看出, 大氣CO濃度升高條件下, 品種XH、MF和DS的微生物群落代謝功能相似性較高; 而品種SN在CK和EC的樣本分別位于主成分1軸的負向和正向兩端, 說明不同CO濃度導(dǎo)致SN的根際微生物群落對碳源的利用方向發(fā)生改變, 其代謝特征受CO濃度升高影響較大。第1主成分、第2主成分和第3主成分是變異的主要來源, 相關(guān)碳源在3個主成分上的載荷值, 即相關(guān)系數(shù),如 表1所示。其中, 對于品種SN的CK處理, 其碳源變化與主成分1中負相關(guān)的碳源種類相關(guān)性較強,其中負相關(guān)的碳源中載荷絕對值大于0.7的有6種,包括氨基酸類1種(L-絲氨酸)、糖類2種(β-甲基-D-葡萄糖苷和D-甘露醇)、羧酸類1種(D-半乳糖醛酸)、聚合物類1種(吐溫80)和其他類1種(D,L-α-磷酸甘油); 品種SN的EC處理碳源變化與主成分1中正相關(guān)的碳源種類相關(guān)性較強, 具體包括糖類的α-D-乳糖和羧酸類的α-丁酮酸(表1)。

表1 31種碳源在大氣CO2濃度升高(EC)及不升高(CK)處理下在第1、2和3主成分上的載荷值Table 1 Carbon substrates loaded on the principal components in analysis of BIOLOG ECO micro-plate data under elevated (EC)and ambient CO2 (CK) conditions

圖3 不同大豆品種根際微生物功能多樣性在大氣CO2濃度升高(EC)及不升高(CK)處理下的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under elevated CO2 EC) and ambient CO2 (CK) concentrations

2.4 大氣CO2濃度、大豆品種以及兩者的交互作用對根際土壤微生物利用31種碳源情況的影響

從表2可以看出, 不同大豆品種顯著影響了氨基酸類碳源中的甘氨酰-L-谷氨酸(F4)、L-精氨酸(A4)、L-絲氨酸(D4), 羧酸類中的D-半乳糖醛酸(B3)、D-葡糖胺酸(F2), 聚合物類碳源中的吐溫80 (D1), 其他類碳源中的1-磷酸葡萄糖(G2)和丙酮酸甲酯(B1);大氣CO濃度升高顯著影響了氨基酸類碳源中的L-絲氨酸(D4), 糖類碳源中的β-甲基-D-葡萄糖苷(A2),羧酸中的D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯(A3)和衣康酸(F3); 大豆品種和大氣CO濃度交互作用顯著影響了胺類碳源中的腐胺(H4), 氨基酸類碳源中的L-精氨酸(A4)、L-天門冬酰胺(B4)、L-絲氨酸(D4), 羧酸類碳源中的γ-羥丁酸(E3)、D-葡糖胺酸(F2)、衣康酸(F3), 聚合物類碳源中的吐溫40 (C1)。具體體現(xiàn)在: L-精氨酸、L-絲氨酸、D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯在品種XH中表現(xiàn)為下降, 在其余品種中表現(xiàn)為升高; 1-磷酸葡萄糖在SN中增加, 而在其他品種中降低; 甘氨酰-L-谷氨酸、D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯、衣康酸在MF中降低, 在其余品種中表現(xiàn)為升高; L-絲氨酸、D-半乳糖醛酸、1-磷酸葡萄糖、D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯、腐胺、L-天門冬酰胺在DS中降低, 在其他品種中升高。

表2 大氣CO2濃度、品種及兩者的交互作用對大豆根際土壤微生物不同碳源利用影響的顯著性分析Table 2 Significance analysis of effects of atmospheric CO2 concentration, soybean cultivars and their interaction on the utilization of different carbon sources of microbe in rhizosphere of soybean

3 討論

3.1 不同大豆品種根際微生物功能特征變化

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)過程, 其代謝活性可以作為評估土壤質(zhì)量和保持土壤肥力的重要指示因子。本研究中, 不同大豆品種根際土壤微生物利用碳源的動力學特征(AWCD)(圖1)、主成分分析(圖3)以及不同大豆品種對碳源利用情況的顯著性分析(表2)表明, 不同大豆品種根際微生物對碳源的代謝功能具有一定差異。金劍等對黑龍江省1950—2006年間推廣的大豆品種的主要農(nóng)藝性狀變化進行研究,發(fā)現(xiàn)隨著品種推廣年代由遠及近, 新品種在碳同化和分配轉(zhuǎn)運的效率上顯著高于老品種。本研究4個大豆品種推廣年份不同, 分別是XH (1951年)、MF(1972年)、SN (1996年)和DS (2003年)。因 此,推測本研究不同大豆品種根際微生物代謝特征差異很可能與不同基因型大豆根系分泌物和根際沉積物的組成和數(shù)量有關(guān)。金劍等對2個不同大豆基因型R1期的根際和非根際微生物群落功能多樣性進行了研究, 亦發(fā)現(xiàn)不同基因型大豆在碳源利用的類型上不同, 與本研究結(jié)果類似。

根際分泌物不僅為根際土壤微生物提供所需的能量, 在一定程度上也支配著根際微生物的生態(tài)演替和群落種群模式。因此, 不同的大豆品種可能具有獨特的根際微環(huán)境和微生物群落結(jié)構(gòu), 進而具有不同的微生物代謝功能特征。Xu等發(fā)現(xiàn)不同基因型大豆具有相似的根際細菌群落結(jié)構(gòu), 但其中可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)受不同基因型影響顯著, 分析原因可能與可培養(yǎng)細菌多為“r-型”生長策略的細菌, 對根系分泌物的變化響應(yīng)比較敏感。本研究采用BIOLOG方法研究微生物代謝功能多樣性, 也是基于針對可培養(yǎng)細菌的研究方法, 進一步佐證了不同大豆品種在根際微生物代謝功能上的差異與品種根系分泌物的差異有關(guān)。

3.2 大氣CO2濃度升高對不同大豆品種根際微生物功能特征的影響

CO是作物光合作用的底物, 一般來講, 大氣CO濃度升高會提高植物的光合作用, 促進植物生長, 故此, 也常將大氣CO濃度升高對植物的效應(yīng)歸納為“肥料效應(yīng)”。相比于C4植物[如玉米(Zea mays)], CO的肥料效應(yīng)對C3植物(如大豆)影響更大。高CO濃度可通過改變植物的生長、生理代謝過程來影響植物通過根部釋放到土壤中的根系分泌物、植物殘體的量及其化學組成, 進而間接改變土壤微生物的活性或群落結(jié)構(gòu)。然而, 本研究微生物功能多樣性指數(shù)結(jié)果表明, 大氣CO濃度升高條件下, 品種XH、MF和DS的微生物群落代謝功能多樣性指數(shù)變化不顯著, PCA分析也表明這3個大豆品種微生物群落代謝功能相似性較高, 而品種SN微生物群落代謝功能受大氣CO濃度升高影響變化顯著, 表明不同大豆品種根際微生物對大氣CO濃度升高的響應(yīng)不一致。分析原因可能為: 1)高CO濃度促進了大豆地上生物量的增加, 致使大豆根系分泌物和根系沉積物也隨之增加, 刺激了微生物的生長及活性, 然而隨著大豆地上生物量的進一步增加, 大豆與其根際微生物將由于土壤養(yǎng)分的限制形成競爭關(guān)系, 微生物可利用的底物缺乏, 導(dǎo)致其代謝功能減弱, 微生物代謝功能最終又回歸到與正常CO濃度類似的狀態(tài); 2)孫雪等研究發(fā)現(xiàn), 土壤理化因子是影響土壤微生物功能多樣性的主要因子。我們也證實了本研究中品種XH、MF和DS土壤全碳、全氮、碳氮比和pH在大氣CO濃度升高時均沒有發(fā)生顯著變化, 這可能是導(dǎo)致上述大豆品種根際微生物功能在大氣CO濃度升高時沒有發(fā)生顯著變化的原因之一。其中, 土壤pH被廣泛報道與細菌群落結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性較強。在本研究中, 品種SN的土壤pH受大氣CO濃度升高影響顯著, 其代謝功能亦顯著受到大氣CO濃度升高的影響。

另外, 本研究還發(fā)現(xiàn), 品種SN的CK處理和EC處理分別與主成分1負相關(guān)和正相關(guān)的碳源代謝能力相關(guān)性較強(圖3), 其中負相關(guān)碳源中的L-精氨酸常見于患病植物根系分泌物中, 2-羥基苯甲酸屬于杉木(Cunninghamia lanceolata)的主要自毒物質(zhì), 二者均不利于大豆生長, 在本研究中L-精氨酸既受到大豆品種的顯著影響, 又受到大豆品種與大氣CO濃度升高交互作用的影響(表2)。已有研究表明, 大氣CO濃度升高可能會引起植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)發(fā)生變化(如干旱、高溫和鹽漬化等)。由此我們推測, 大氣CO濃度升高是否也可能通過改變有害根系分泌物的分泌量進而影響大豆對不良環(huán)境的耐受能力呢? 由于本研究的碳源類型并不能完全代表大豆生長過程中的實際根系分泌物類型, 這種推斷有待通過田間原位試驗進一步驗證。