崔 瑤 時 沛 王建新

近年來，臨床對中晚期宮頸癌患者通常采用同步放化療方式，但部分患者效果并不理想，原因與其對放療不敏感或產(chǎn)生抗性密切相關(guān)[1]。因此，研究宮頸癌放療抗性機(jī)制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放療敏感性是改善該病預(yù)后的重要途徑。微小RNA(microRNA，miR)是一種具有進(jìn)化保守性，長度19～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，研究表明其與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、死亡等生物過程有關(guān)，且參與腫瘤發(fā)病及進(jìn)展[2-3]。近年來，miR-455-3p被發(fā)現(xiàn)異常低表達(dá)于涎腺腺樣囊性癌、卵巢癌、宮頸癌等惡性腫瘤中，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等腫瘤生物學(xué)行為[4-6]。然而，目前鮮有關(guān)于miR-455-3p過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞放療敏感性的影響及機(jī)制研究。本研究通過建立miR-455-3p過表達(dá)的宮頸癌C33a細(xì)胞系，研究其對宮頸癌細(xì)胞放療敏感性的影響，并探究相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 宮頸癌C33a細(xì)胞株，購于上?？道噬锟萍加邢薰?。培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)條件(飽和濕度，37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)箱。

1.1.2 主要試劑和儀器 帶有綠色熒光標(biāo)記的miR-455-3p過表達(dá)質(zhì)粒miR-455-3p mimics、陰性對照質(zhì)粒miR-NC(武漢生命之美科技有限公司)，LipofectamineTM2000試劑盒(上海陽光生物科技有限公司)，qRT-PCR檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(美國Sigma公司)，二甲基噻唑(dimethylthiazole，MTT)溶液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液、FITC-Anexin V染液、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液(上海懋康生物科技有限公司)，兔抗人去乙?；?(histone deacetylase2，HADC2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT一抗，山羊抗兔IgG二抗(美國Santa cruz公司)。

NIB900-FL倒置熒光顯微鏡(德國萊卡顯微系統(tǒng)有限公司)，CFX96 QRT-PCR儀(美國Bio-rad公司)，Elekta Synergy直線加速器(瑞典Elekta公司)，Amnis? ImageStream?X MK Ⅱ流式細(xì)胞儀(德國Luminex公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期C33a細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿瓶底75%左右時，胰酶消化，調(diào)整密度至1×105個/孔，接種至6培養(yǎng)板傳代。細(xì)胞再次融合至70%左右時，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作要求將帶有綠色熒光標(biāo)記的miR-455-3p過表達(dá)質(zhì)粒miR-455-3p mimics、陰性對照質(zhì)粒miR-NC轉(zhuǎn)染至C33a細(xì)胞，分別設(shè)為miR-455-3p mimics組、miR-NC組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后經(jīng)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。取未經(jīng)處理的細(xì)胞設(shè)為空白組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)、Western blot檢測miR-455-3p mRNA，HADC2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量 qRT-PCR檢測miR-455-3p、HADC2 mRNA相對表達(dá)量：取各組細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA，檢測純度與濃度后，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后根據(jù)qRT-PCR檢測試劑盒說明書要求設(shè)置反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：SYBR Green Mix 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1.5 μL，加入雙蒸水使總反應(yīng)體系至20 μL，95 ℃ 35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s重復(fù)40個循環(huán)，72延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計算miR-455-3p、HADC2 mRNA相對表達(dá)量。實驗所用引物：miR-455-3p：上游：5'-GTCACGTGCATGCGCGCACGCTGC-3'；下游：5'-GCACGTGTGCACGTGCGCACGCAC-3'；GAPDH：上游：5'-TGACGTCGTGCAGGACGTGCATGC-3'；下游：5'-AGGCGCTGCATGCCGTACGTGACG-3'。所有實驗重復(fù)3次取平均值。

Western blot檢測HADC2蛋白相對表達(dá)量：取各組細(xì)胞，經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，8 000 r/min，離心半徑8 cm離心10 min，全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，沸水浴10 min變性，BCA試劑盒定量。取30 μg待測蛋白，混合上樣緩沖液，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗滌，加入兔抗人HADC2一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(1∶8 000)，常溫孵育2 h，TBST洗滌，加入ELC發(fā)光液，暗室中顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以HADC2/GAPDH灰度值表示其蛋白相對表達(dá)量。所有實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 生物信息學(xué)軟件及雙熒光素酶實驗驗證miR-455-3p與HADC2的靶向關(guān)系 采用生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRwalk初步預(yù)測，含有miR-455-3p結(jié)合位點的HADC2 mRNA 3'UTR，由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司對其進(jìn)行鑒定與擴(kuò)增，構(gòu)建HADC2 3'UTR野生型(HADC2-WT)、突變型(HADC2-MT)雙熒光素酶報告載體。取對數(shù)期C33a細(xì)胞，細(xì)胞融合至75%左右時開始轉(zhuǎn)染，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書要求，將HADC2-WT、HADC2-MT與內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒pRLTK共轉(zhuǎn)染至空白組、miR-455-3p mimics組、miR-NC組，孵育48 h，PBS清洗細(xì)胞，加入Promega細(xì)胞裂解液(110 μL/孔)，孵育20 min，根據(jù)熒光素酶試劑盒操作要求對熒光素酶強(qiáng)度進(jìn)行檢測，并計算相對熒光素酶活性，相對熒光素酶活性值=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。所有實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 MTT法檢測不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率 采用直線加速器，6 MV X射線照射，距離100 cm，吸收劑量率200 cGy/min，將1.5 cm補(bǔ)償膠覆蓋于培養(yǎng)板上用以模擬皮膚，將培養(yǎng)板放置于水槽上。取各組細(xì)胞，調(diào)整密度至1×105個/孔，接種至6培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合至75%左右時，分別采用2、4、6、8 Gy照射劑量處理24 h，加入新鮮制備MTT溶液(20 μL/孔，5.00 g/L)，2 h后棄上清，加入DMSO溶液(150 μL/孔)，充分振蕩10 min，結(jié)晶完全溶解后采用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度值(A490 nm)，計算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-不同照射劑量組A490 nm/空白對照組A490 nm)×100%，并繪制抑制率曲線，獲取放療對C33a細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量(half inhibitory concentration，IC50)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞，調(diào)整密度至1×105個/孔，接種至6培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合至75%左右時，8 Gy照射劑量處理24 h，PBS洗滌，2800 r/min，離心半徑12 cm離心10 min，4 ℃ binding buffer標(biāo)記液重懸細(xì)胞，與5 μL AnnexinV-FITC混合均勻，4 ℃避光孵育15 min，加入5 μL PI染液染色5 min，過濾，60 min內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 PI染色檢測細(xì)胞周期 取各組細(xì)胞，細(xì)胞融合至75%左右時8 Gy照射劑量處理24 h，采用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止，輕吹細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管(15 mL)，4 ℃ 3 000 r/min，離心半徑10 cm離心10 min，4 ℃ PBS沖洗后繼續(xù)離心10 min；加入PBS重懸細(xì)胞，與1 mL 70% 4 ℃乙醇混合均勻，4 ℃固定24 h，離心、沖洗后加入PI染液(RNaseA 10 μL，染色緩沖液0.5 mL，PI染液25 μL)，避光冰浴30 min；300目濾網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.2.7 Western blot檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達(dá)量 取各組細(xì)胞，蛋白收集、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜等方式同1.2.2，加入兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，孵育、顯色、計算方式同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率觀察

宮頸癌C33a細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，miR-NC組、miR-455-3p mimics組轉(zhuǎn)染效率均>80%，符合后續(xù)實驗要求。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率(×400)

2.2 各組miR-455-3p、HADC2表達(dá)比較

miR-455-3p mRNA，HADC2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-455-3p mimics組miR-455-3p mRNA相對表達(dá)量高于空白組、miR-NC組，HADC2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于空白組、miR-NC組(P<0.05)；空白組、miR-NC組miR-455-3p mRNA，HADC2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組miR-455-3p、HADC2表達(dá)情況

2.3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測及雙熒光素酶實驗結(jié)果

生物信息學(xué)預(yù)測顯示Has-miR-455-3p與HADC2基因的3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點。見圖2。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，HADC2-WT相對熒光素酶活性值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HADC2-MT相對熒光素酶活性值組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；miR-455-3p mimics組HADC2-WT相對熒光素酶活性值低于空白組、miR-NC組(P<0.05)；空白組、miR-NC組HADC2-WT相對熒光素酶活性值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 雙熒光素酶實驗結(jié)果

圖2 HADC2潛在上游miR-455-3p預(yù)測結(jié)果

2.4 不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率及IC50

不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率及IC50值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-455-3p mimics組不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率高于空白組、miR-NC組，IC50值低于空白組、miR-NC組(P<0.05)；空白組、miR-NC組不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率及IC50值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3、圖3。

表3 不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率及

圖3 不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率

2.5 各組凋亡率比較

空白組、miR-NC組、miR-455-3p mimics組凋亡率分別為(2.21±0.35)%、(2.36±0.41)%、(48.52±6.14)%，凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=281.348，P<0.001)；miR-455-3p mimics組凋亡率高于空白組、miR-NC組(t=16.838、16.773，P<0.001)；空白組、anti-miR-NC組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.622，P=0.551)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

2.6 各組細(xì)胞周期分布比較

G0/G1、G2/M占比組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-455-3p mimics組G0/G1占比高于空白組、miR-NC組，G2/M占比低于空白組、miR-NC組(P<0.05)；空白組、miR-NC組G0/G1占比、G2/M占比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；G0、S占比組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組細(xì)胞周期分布比較

2.7 各組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比較

p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；miR-455-3p mimics組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT低于空白組、miR-NC組(P<0.05)；空白組、miR-NC組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比較

3 討論

宮頸癌是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，且近年來呈發(fā)病率升高、年輕化趨勢[7]。放療是宮頸癌尤其是中晚期患者主要治療方式之一，但部分患者由于對放射線不敏感而造成治療中斷或失敗，導(dǎo)致預(yù)后不良。研究認(rèn)為[8-9]，宮頸癌放療敏感性通常與細(xì)胞周期檢測點無法被正確激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常、DNA雙鏈損傷、細(xì)胞缺氧等有關(guān)，且局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者放療抗性更強(qiáng)，不同病理類型放療抗性也存在差異。因此，探索宮頸癌放療增敏方式已成為目前該病研究熱點。

miRNA轉(zhuǎn)錄后通過結(jié)合靶向蛋白編碼基因mRNA的3'UTR，抑制其翻譯或誘導(dǎo)其降解，發(fā)揮與原癌基因、抑癌基因類似的作用，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程如放療抵抗相關(guān)機(jī)制[10-11]。近年來，miRNA在腫瘤進(jìn)程中的關(guān)鍵作用使其逐漸成為腫瘤診斷血清標(biāo)志物及潛在治療靶標(biāo)而備受關(guān)注。miR-455-3p在結(jié)直腸癌、上皮性卵巢癌等腫瘤中低表達(dá)，被認(rèn)為是抑癌基因參與各種生物進(jìn)程的調(diào)控[12-13]。Yi等[14]采用qRT-PCR檢測miR-455-3p在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)時發(fā)現(xiàn)其異常低表達(dá)，且與腫瘤體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，并對該病預(yù)后不良具有預(yù)測作用。Liu等[15]研究得出，miR-455-3p在人食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤發(fā)生及化療耐藥中起重要作用，且通過使多個與干性相關(guān)的途徑失活來減少CD90+和CD271+T細(xì)胞亞群，提示其與耐藥相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，與空白組、miR-NC組比較，miR-455-3p mimics組不同照射劑量對C33a細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、細(xì)胞G0/G1占比升高，IC50值、細(xì)胞G2/M占比降低，提示miR-455-3p過表達(dá)可增強(qiáng)宮頸癌C33a細(xì)胞放療敏感性。王朝等[16]研究認(rèn)為，miR-455-3p過表達(dá)可促進(jìn)C33a細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其放射敏感性，本研究結(jié)果與其具有一致性，共同提示miR-455-3p過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞的放療增敏作用。

HDAC2是HDAC家族成員，可催化蛋白發(fā)生去乙?；⒔Y(jié)合帶負(fù)電DNA，使染色質(zhì)呈組抑結(jié)構(gòu)，抑制特定基因如腫瘤抑制基因的表達(dá)。本研究顯示，miR-455-3p mimics組HADC2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量低于空白組、miR-NC組，且經(jīng)雙熒光素酶實驗驗證HADC2是miR-455-3p的靶基因。PI3K/AKT通路是機(jī)體重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，研究證實其與腫瘤放療抗性密切相關(guān)，過度激活該信號將導(dǎo)致放療失敗，抑制該通路可改善腫瘤細(xì)胞放療抗性[17]。目前認(rèn)為應(yīng)激因素引發(fā)HDAC2表達(dá)及活性改變的主要機(jī)制是激活PI3K/AKT信號通路，細(xì)胞受到刺激后PI3K發(fā)生磷酸化，產(chǎn)生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇，經(jīng)磷酸化作用引起AKT活化，轉(zhuǎn)移至胞漿或胞核中，介導(dǎo)下游底物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等行為，增強(qiáng)細(xì)胞缺氧抗力，減少細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放化療抗性[18]。本研究結(jié)果中，miR-455-3p mimics組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT低于空白組、miR-NC組，提示miR-455-3p可能通過下調(diào)HADC2，抑制PI3K、AKT發(fā)揮宮頸癌C33a細(xì)胞放療增敏作用。

綜上所述，miR-455-3p過表達(dá)可提高放療對宮頸癌C33a細(xì)胞增殖抑制率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而增強(qiáng)細(xì)胞放療敏感性，推測其作用機(jī)制與下調(diào)HADC2從而抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。