朱 騫 趙雄濤 張 濰 周冬梅

宮頸癌(cervical cancer)是臨床上常見的惡性腫瘤，據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(the global cancer observatory,GLOBOCAN)2018年報(bào)告，宮頸癌是女性的第四大常見惡性腫瘤[1]。衛(wèi)生部的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年有超過13 萬宮頸癌新發(fā)病例，占全球新發(fā)病例數(shù)的25%左右，死亡病例約2～3 萬[2]。宮頸癌的診斷數(shù)據(jù)顯示，將近一半的患者已處于疾病晚期，超過了手術(shù)治療的最佳時(shí)期[3]，因此化療在宮頸癌的治療中占有重要地位。以順鉑(cisplatin，DDP)為代表的鉑類藥物聯(lián)合化療被認(rèn)為是宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案[3-4]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，LncRNA CDKN1A 反義鏈啟動(dòng)子DNA 損傷激動(dòng)RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR)能夠降低宮頸癌細(xì)胞株HeLa的順鉑耐藥，并且降低HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[5]。然而PANDAR究竟是通過何種機(jī)制抑制HeLa的順鉑耐藥性尚不明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞打破細(xì)胞間和細(xì)胞間基質(zhì)黏附狀態(tài)的重要過程，賦予癌細(xì)胞化療耐藥性。本文在前期研究基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PANDAR的靶基因并研究PANDAR介導(dǎo)的EMT在HeLa細(xì)胞順鉑耐藥中的作用，旨在明確PANDAR對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa順鉑耐藥性的作用機(jī)制，提供理論依據(jù)并完善研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自上海拜力公司，順鉑購自Sigma 公司，HeLa-DDP耐藥細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)前期建立。LV-sh-PANDAR 慢病毒載體購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。RIPA裂解液和牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor 1，TGF-β1)抗體，Smad4抗體，鈣粘附蛋白E(E-cadherin)抗體及鈣粘附蛋白N(N-cadherin)抗體購自Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，于5%CO2，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HeLa-DDP耐藥細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)前期建立，采用藥物濃度梯度遞增法獲得[5]。

1.3 蛋白提取和免疫印跡Western blot

收集HeLa或HeLa-DDP細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液后每孔加入1 ml RIPA裂解液，冰上裂解10 min。BCA試劑盒檢測(cè)裂解液蛋白濃度。每孔加入15 μg蛋白于聚丙烯酰胺凝膠上并進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；隨后用5%牛血清白蛋白封閉1 h。4 ℃條件下一抗(E-cadherin，N-cadherin，TGF-β，Smad4)孵育PVDF膜并過夜，隨后二抗孵育。ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析目的條帶。

1.4 PANDAR靶基因預(yù)測(cè)

通過lncATLAS網(wǎng)站 (https://lncatlas.crg.eu/)預(yù)測(cè)PANDAR評(píng)估PANDAR的定位(位于細(xì)胞核)。通過RNAInter網(wǎng)站(http://www.rna-society.org/rnainter/)預(yù)測(cè)PANDAR潛在的靶基因；根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道篩選靶基因。

1.5 CCK-8檢測(cè)

0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，分別用不同濃度(0、1、2、4、8和16 μg/ml)順鉑處理，48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔在450 nm處的吸光值。

1.6 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

0.25%胰蛋白酶消化HeLa-DDP細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜。用無血清的培養(yǎng)基處理細(xì)胞8 h后加入10 ng/ml的TGF-β，37 ℃作用36 h。收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于400 μL Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，加入10 μL PI并混勻，冰浴避光放置5 min，30 min內(nèi)于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞隨機(jī)分為四組：PANDAR，PANDAR + TGF-β，PANDAR + Cisplatin和PANDAR + Cisplatin + TGF-β。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析及Bonferroni事后檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)志分子表達(dá)

顯微鏡下觀察HeLa細(xì)胞及HeLa-DDP細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，HeLa細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞間緊密相連。HeLa-DDP細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈長梭形，細(xì)胞間疏散。Western blot結(jié)果表明，與HeLa細(xì)胞相比，HeLa-DDP細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量下調(diào)，而間質(zhì)分子標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)量上調(diào)(圖1)。表明HeLa-DDP細(xì)胞發(fā)生了EMT變化。

圖1 HeLa細(xì)胞及HeLa-DDP細(xì)胞形態(tài)及EMT標(biāo)志分子表達(dá)

2.2 PANDAR對(duì)HeLa-DDP細(xì)胞EMT發(fā)生的影響

PANDAR過表達(dá)載體處理HeLa-DDP細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示HeLa-DDPControl及HeLa-DDPNC細(xì)胞呈長梭形，而HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞多呈圓形或卵圓形。Western blot結(jié)果表明與HeLa-DDPNC細(xì)胞相比，HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)量上升，N-cadherin表達(dá)量下降(圖2A)。

光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示，HeLa-DDPsh-PANDAR細(xì)胞與HeLa-DDPsh-NC細(xì)胞形態(tài)上差別不大，均呈長梭形。Western blot結(jié)果表明與HeLa-DDPsh-NC細(xì)胞相比，HeLa-DDPsh-PANDAR細(xì)胞E-cadherin表達(dá)量下降，N-cadherin表達(dá)量上升(圖2B)。

A為Western blot檢測(cè)PANDAR過表達(dá)對(duì)E-cadherin及N-cadherin表達(dá)水平的影響；B為Western blot檢測(cè)PANDAR敲減對(duì)E-cadherin及N-cadherin表達(dá)水平的影響。

2.3 PANDAR對(duì)HeLa細(xì)胞TGF-β/Smad4通路的影響

RNAInter預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.rna-society.org/rnainter/)顯示Smad4為PANDAR潛在的靶基因，且這一預(yù)測(cè)結(jié)果得到ChIP-seq分析數(shù)據(jù)的支持[6-7]。Western blot結(jié)果顯示，與HeLaNC細(xì)胞中TGF-β(0.96±0.13)和Smad4 (1.07±0.15)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，HeLaPANDAR細(xì)胞中TGF-β(0.28±0.06)和Smad4(0.38±0.03)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A～B)。

HeLash-PANDAR細(xì)胞TGF-β蛋白相對(duì)表達(dá)水平為2.13±0.15，Smad4蛋白相對(duì)表達(dá)水平為2.67±0.18，與 HeLash-NC細(xì)胞(TGF-β：1.03±0.06；Smad4：1.05±0.03)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3C～D。

A為PANDAR過表達(dá)后TGF-β及Smad4蛋白表達(dá)水平；B為PANDAR過表達(dá)后TGF-β及Smad4蛋白相對(duì)定量結(jié)果；C為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白表達(dá)水平；D為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白相對(duì)定量結(jié)果。

2.4 TGF-β逆轉(zhuǎn)PANDAR對(duì)EMT的影響

PANDAR過表達(dá)的HeLa/DDP細(xì)胞，加入10 ng/ml的TGF-β處理，檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白水平的變化。光學(xué)顯微鏡顯示，TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞排列不規(guī)則，多呈長梭形，細(xì)胞間疏散。Western blot結(jié)果顯示，與HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞中E-cadherin(1.00±0.08)和N-cadherin(1.00±0.03)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，HeLa-DDPPANDAR+TGF-β細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平(0.46±0.06)相對(duì)降低，N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平(2.58±0.13)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)E-cadherin及N-cadherin表達(dá)水平

2.5 TGF-β逆轉(zhuǎn)PANDAR介導(dǎo)的HeLa-DDP細(xì)胞Cisplatin耐受

如圖5A顯示，隨著Cisplatin濃度升高，HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞OD450值逐漸降低。與TGF-β未處理相比，TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞OD450值上調(diào)(圖5A)。TGF-β處理顯著降低Cisplatin誘導(dǎo)的HeLa-DDPPANDAR細(xì)胞凋亡(P<0.05)，見圖5B～C。

注：A為CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力；B為細(xì)胞凋亡定量結(jié)果；C為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

3 討論

本文研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR抑制HeLa-DDP細(xì)胞的EMT進(jìn)程。PANDAR過表達(dá)后TGF-β和Smad4蛋白表達(dá)水平顯著降低。TGF-β逆轉(zhuǎn)了PANDAR介導(dǎo)的HeLa-DDP細(xì)胞EMT進(jìn)程和Cisplatin耐藥。

在不同腫瘤中，PANDAR起著抑癌或促癌的作用[8]。據(jù)報(bào)道，PANDAR可與精氨酸/絲氨酸豐富剪接因子2(SRSF2)結(jié)合，調(diào)控p53蛋白絲氨酸15磷酸化，從而降低順鉑敏感性[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR過表達(dá)可以降低HeLa-DDP細(xì)胞對(duì)Cisplatin耐受性[5]。EMT過程可通過將靜止的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可移動(dòng)的間充質(zhì)細(xì)胞并改變細(xì)胞-細(xì)胞粘附以及細(xì)胞外基質(zhì)，從而顯著促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和化學(xué)耐藥性[10-11]。在乳腺癌，黑色素瘤及結(jié)直腸癌細(xì)胞中，PANDAR敲除導(dǎo)致間充質(zhì)標(biāo)志分子(如N-鈣粘蛋白，波形蛋白，β-連環(huán)蛋白)表達(dá)降低，E-鈣粘蛋白表達(dá)升高，抑制EMT過程[12,13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HeLa-DDP細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的間質(zhì)特性，PANDAR過表達(dá)抑制了耐藥細(xì)胞的EMT進(jìn)程，而PANDAR敲除促進(jìn)耐藥細(xì)胞的EMT進(jìn)程。PANDAR在不同腫瘤中對(duì)EMT的作用可能與腫瘤的異質(zhì)性和PANDAR復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。

通過lncATLAS網(wǎng)站(https://lncatlas.crg.eu/)得知，lncRNA PANDAR主要定位于細(xì)胞核中。Zhang[14]等在肺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PANDAR主要定位于細(xì)胞核中，并通過上調(diào)芐氯素1(BECN1)激活自噬和凋亡途徑，進(jìn)而抑制肺癌發(fā)展進(jìn)程。PANDAR的細(xì)胞核定位決定了其可通過直接與靶基因結(jié)合來激活或抑制靶基因的表達(dá)。通過ChIP-seq分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PANDAR能與Smad4結(jié)合[6-7]。Smad4在TGF-β作用下，可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并于轉(zhuǎn)錄因子一起介導(dǎo)靶基因的抑制或激活。研究表明，腫瘤微環(huán)境中接近腫瘤血管的癌癥干細(xì)胞接受并響應(yīng)TGF-β信號(hào)，使癌癥干細(xì)胞細(xì)胞分裂變緩，從而避開一些靶向快速分裂細(xì)胞的抗癌療法(如順鉑治療)[15]。此外，TGF-β/Smad4信號(hào)通路通過誘導(dǎo)Snail1/2，ZEB1/2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT變化，使細(xì)胞對(duì)化療藥物表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[16-17]。本文研究發(fā)現(xiàn)，PANDAR的過表達(dá)顯著下調(diào)了TGF-β和Smad4蛋白的表達(dá)水平；TGF-β處理PANDAR過表達(dá)的HeLa-DDP細(xì)胞，研究PANDAR過表達(dá)對(duì)HeLa-DDP細(xì)胞EMT進(jìn)程和耐藥性影響的機(jī)制，結(jié)果證明TGF-β可逆轉(zhuǎn)PANDAR 過表達(dá)對(duì)HeLa-DDP細(xì)胞EMT的抑制作用。此外，TGF-β過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了PANDAR過表達(dá)誘導(dǎo)的HeLa-DDP細(xì)胞凋亡?？紤]到TGF-β介導(dǎo)凋亡和EMT是一個(gè)相互排斥和相互關(guān)聯(lián)、受到某些因素調(diào)控并因此處于動(dòng)態(tài)平衡的過程[18]，提示PANDAR可能通過TGF-β/Smad4調(diào)控宮頸癌EMT和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡過程。

綜上所述，聯(lián)合前期的研究成果，我們發(fā)現(xiàn)了PANDAR調(diào)節(jié)HeLa-DDP細(xì)胞耐藥性較完整的分子機(jī)制，即PANDAR通過抑制TGF-β/Smad4通路影響HeLa細(xì)胞的EMT進(jìn)程，進(jìn)而影響其耐藥性。這一研究發(fā)現(xiàn)為減輕宮頸癌的耐藥性和探索更有效的治療方法提供了理論依據(jù)。