楊 凈， 李素新， 張躍輝， 李路豪， 劉兆臣， 沈東啟， 黨曉衛(wèi)

鄭州大學第一附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 鄭州 450052

布加綜合征(Budd -Chiari syndrome，BCS)是由各種原因所致的肝靜脈或其開口以上的下腔靜脈阻塞性病變[1]。在亞洲，BCS患者病程較長，多為下腔靜脈節(jié)段性或膜性阻塞伴或不伴肝靜脈阻塞[2]。靜脈流出道梗阻會導致肝臟淤血，長期肝淤血會使肝竇血栓形成和壓力增加，進而促進肝纖維化[3]。肝纖維化的形成伴隨著膠原和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的積聚，缺氧是肝纖維化進程中的重要特征[4]。而肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化的發(fā)展中起關鍵作用，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor，HIF-1α)調(diào)節(jié)缺氧時HSC的活化，對膠原沉積和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產(chǎn)生尤為重要[5]。

二甲雙胍被廣泛用作治療2型糖尿病已有60多年的歷史[6-7]。除了降血糖作用外，越來越多的研究[8-10]表明二甲雙胍還具有較強的抗炎、抗衰老和抗腫瘤活性。一些研究[11-12]表明二甲雙胍可以改善不同類型的肝纖維化。目前關于BCS引起的肝纖維化研究較少，其病理改變?yōu)橛傺?，具體機制尚不清楚。二甲雙胍能否改善BCS誘導的肝纖維化，目前尚無相關研究。本實驗通過建立BCS小鼠模型，來探討二甲雙胍與BCS所致淤血性肝纖維化之間的關系以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 鹽酸二甲雙胍購自上海麥克林試劑公司；HE染色和天狼猩紅染色試劑購自武漢塞維爾生物公司；免疫組化染色試劑購自北京康為世紀生物技術公司；熒光定量PCR試劑購自南京諾唯贊生物公司；PCR引物序列購自北京博邁德生物科技有限公司；GAPDH、VEGF、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、HIF-α、纖維蛋白原(Fibrinogen)、Ⅰ 型膠原(Collagen1)抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實驗動物與方法 4周齡SPF級C57BL/6J小鼠30只購自北京華阜康生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK(豫)2020-0008。體質量20～22 g。室溫22 ℃，正常周期(12 h光照、12 h黑暗)，清潔飼養(yǎng)。將小鼠隨機分為4組：假手術組(SHAM組)6只，假手術+二甲雙胍組(SHAM+M組)5只，布加綜合征模型組(BCS組)10只，布加綜合征模型+二甲雙胍組(BCS+M組)9只。適應性飼養(yǎng)1周后，采用下腔靜脈部分結扎術造模[3]，結扎部位為肝上下腔靜脈，SHAM組不結扎，其余操作同模型組。SHAM+M組和BCS+M組飲水中加入0.1%二甲雙胍，6周后處死小鼠[3]。取部分小鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋切片。其余新鮮肝臟標本-80 ℃冷凍保存，用作后續(xù)實驗。

1.3 HE染色和天狼猩紅染色 石蠟切片脫蠟至水化后，分別行HE染色和天狼猩紅染色，梯度酒精脫水封片。光學顯微鏡下觀察，Image J軟件計算膠原陽性面積。

1.4 免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟并水化后，根據(jù)一抗說明書選擇檸檬酸或EDTA抗原修復液(pH=9)進行抗原修復，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶30 min，3%山羊血清封閉30 min，加一抗4 ℃孵育過夜，加入與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育1 h，DAB顯色。光學顯微鏡觀察結果，Image J軟件計算陽性面積。

1.5 實時熒光定量PCR 以qPCR 檢測GAPDH、Collagen1、HIF-1α的mRNA表達。引物序列如表1所示。

稱取肝組織20～50 mg，加入1 mL TRIzol勻漿，并按照說明書步驟提取總RNA，提取出的RNA逆轉錄合成cDNA，然后行PCR檢測?；蛳鄬Ρ磉_量以2-ΔΔCt計算。

表1 qPCR引物序列Table 1 The primers used for qPCR analysis

1.6 免疫蛋白印跡(Western Blot) 稱取20～50 mg肝組織，加入RIPA細胞裂解液，勻漿后冰上裂解，離心收集上清，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱，冷卻到室溫，BCA法測量蛋白濃度。SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h。一抗4 ℃孵育過夜。相應二抗室溫孵育1.5 h。使用 ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白，以Image J軟件分析條帶吸光度(A)值，與內(nèi)參照結果比較，計算相對表達量。

2 結果

2.1 建模情況及肝臟標本檢查結果 SHAM組小鼠存活5只，SHAM+M組均存活；BCS組和BCS+M組各存活8只，BCS組中有6只成模，BCS+M組有7只成模，造模成功率為81%。小鼠成模6周以后處死小鼠取材，與SHAM組相比，肉眼可見BCS組肝臟明顯淤血，表面呈細顆粒狀，邊緣銳利(圖1a)，同時可觀察到BCS組小鼠出現(xiàn)了腹水和腹壁靜脈曲張，提示模型建立成功。與BCS組相比，BCS+M組肝臟淤血減輕，表面細顆粒減少。比較各組之間肝指數(shù)(肝質量/體質量)，BCS組明顯高于SHAM組和BCS+M組(P值均<0.05)(圖1b)。

注：a,肝臟組織標本(造模后6周);b,各組小鼠肝指數(shù)(肝質量/體質量)。

2.2 二甲雙胍對BCS小鼠模型肝纖維化的作用 HE染色結果顯示：與SHAM組相比，BCS組肝纖維化情況明顯，中央靜脈和肝竇內(nèi)淤血，中央靜脈旁肝細胞排列紊亂，肝竇擴張，并伴有少量炎癥細胞浸潤。與BCS組相比，BCS+M組淤血減輕，肝竇擴張未見明顯減輕(圖2)。

與SHAM組相比，BCS組膠原沉積明顯增多(P<0.01)，BCS+M組膠原相較于BCS組沉積減少(P<0.01)(圖3a、e);qPCR和Western Blot結果顯示(圖3c、d、g)：BCS組Collagen1表達明顯高于SHAM組和BCS+M組(P值均<0.05)；免疫組化和Western Blot結果表明(圖3b、c、f、h)：與SHAM組相比，BCS組α-SMA高表達(P<0.05)，與BCS組相比，BCS+M組α-SMA的表達降低(P<0.05)。

2.3 二甲雙胍對BCS組肝臟纖維蛋白原(Fibrinogen)表達的影響 免疫組化染色(圖4a)顯示,Fibrinogen多沉積肝竇內(nèi)，BCS組Fibrinogen表達相較于SHAM組增高(P<0.01)，與BCS組相比，BCS+M組Fibrinogen表達降低(P<0.01)(圖4a、c)。Western Blot結果與免疫組化相符合(圖4b、d)。

2.4 二甲雙胍對于小鼠肝纖維化肝臟組織中HIF-1α和VEGF表達的影響 qPCR和Western Blot結果(圖5)表明，BCS組HIF-1α的表達相較于SHAM組明顯增高(P<0.05)，與BCS組相比，BCS+M組HIF-1α表達降低(P<0.05)。Western Blot結果顯示，BCS組VEGF的表達高于SHAM組和BCS+M組(P值均<0.05)。

3 討論

許多因素都會導致肝臟損傷并發(fā)展為肝纖維化，最終演變?yōu)楦斡不１緦嶒灢捎孟虑混o脈部分結扎術處理小鼠，6周后BCS肝纖維化模型建立。HE染色下可觀察到與肝炎相關肝纖維化所不同的地方，其肝纖維化改變最先發(fā)生于近中央靜脈周圍區(qū)域(Ⅲ區(qū))，表現(xiàn)為中央靜脈旁肝細胞排列紊亂，紅細胞淤積并伴有少量炎癥細胞浸潤，其炎癥反應并不如肝炎相關肝纖維化明顯[13]。由于流出道的梗阻，肝竇內(nèi)壓力增高，肝竇擴張，Ⅲ區(qū)的肝纖維化會逐漸發(fā)展，形成肝靜脈之間的橋接性肝纖維化[14]。本研究在構建小鼠模型的同時給予二甲雙胍進行預防性治療，經(jīng)過了二甲雙胍的干預后，小鼠肝臟在形態(tài)學上有了明顯改善，淤血減輕，膠原沉積減少，說明了二甲雙胍能夠改善這種淤血所導致的肝內(nèi)纖維化生成。本實驗中藥物組肝竇擴張的改善并不明顯，其原因可能與二甲雙胍不能解除下腔靜脈的狹窄有關。

圖2 各組小鼠肝臟HE染色情況

注：a,天狼猩紅染色(×100);b，α-SMA免疫組化染色(×200);c，Western Blot結果;d，Collagen1 mRNA相對表達水平;e，各組天狼猩紅染色

對α-SMA免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，BCS組高表達并以中央靜脈周圍為主，沿肝竇向四周放射狀排列，越靠近中央靜脈，其表達越高，Western Blot結果也證明了α-SMA的高表達。而α-SMA是HSC活化的標志，說明了在淤血性肝纖維化中，同樣伴隨HSC的活化。一些研究[11,15]顯示二甲雙胍能夠減輕HSC的活化，減少ECM的沉積，這與本研究的推測相符合。Collagen1作為肝纖維化膠原的主要組成成分，本實驗中二甲雙胍能夠明顯降低α-SMA以及Collagen1的表達，提示其可以抑制HSC的活化，減少ECM的分泌來發(fā)揮作用。

有研究[3]表明肝竇淤血所導致的肝纖維化不是通過炎癥介導的途徑，而是與肝竇血栓形成有關。Fibrinogen作為血栓的組成成分之一，免疫組化結果顯示其多沉積肝竇內(nèi)，其原因可能為靜脈流出道的梗阻導致血液淤積于肝竇，微血栓形成，進而導致肝竇內(nèi)壓力逐漸增加，加重肝纖維化的進展。在淤血性肝病中，肝竇淤血會導致纖維素直接接觸HSC，這會刺激HSC介導參與組裝纖連蛋白，加重肝纖維化。

注：a,Fibrinogen免疫組化染色(×200);b,Western Blot結果;c, Fibrinogen免疫組化染色面積；d,Fibrinogen蛋白相對表達水平。圖4 Fibrinogen表達情況 Figure 4 Expression of Fibrinogen

注：a,Western Blot結果;b,HIF-1α mRNA相對表達水平；c,HIF-1α蛋白相對表達水平；d,VEGF蛋白相對表達水平。圖5 小鼠肝臟HIF-1α和VEGF表達情況Figure 5 Expression of HIF-1α and VEGF in mouse liver

肝纖維化是多因素介導的復雜病理生理過程，其中缺氧可通過介導肝臟慢性炎癥、ECM的沉積以及血管新生等加速肝纖維化進程。肝臟缺氧通過HIF-1α上調(diào)HSC與肝竇內(nèi)皮細胞中的VEGF等基因表達，誘導肝竇內(nèi)皮細胞向毛細血管內(nèi)皮轉化[16]，導致肝竇表面的篩孔數(shù)量明顯減少甚至消失，導致肝內(nèi)血管阻力增加、門靜脈高壓形成。VEGF作為HIF-1α的下游因子，主要由肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞分泌，其可以特異性識別細胞膜上的血管內(nèi)皮生長因子受體，引起細胞表面活性蛋白酶的表達，增加血管通透性，導致ECM的積累，促進肝竇內(nèi)皮細胞毛細血管化。

綜上所述，二甲雙胍能夠改善由BCS所導致的淤血性肝纖維化，其作用機制可能為減少肝竇內(nèi)微血栓，抑制HIF-1α/VEGF通路來發(fā)揮作用。

倫理學聲明：本研究方案于2019年7月10日經(jīng)由鄭州大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號為2019-KY-144，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊凈參與課題設計，實施課題，撰寫論文；張躍輝、沈東啟參與課題實施；李路豪、劉兆臣參與課題設計，修改論文；李素新、黨曉衛(wèi)負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。