張夢(mèng)琦李平波柳絮張華李臻劉芳姚方印

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濕地農(nóng)業(yè)與生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

水稻(Oryza sativaL.)是重要的糧食作物，其穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)對(duì)保障世界糧食安全具有重要意義[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的深入推進(jìn)，土地流轉(zhuǎn)速度的加快，作物生產(chǎn)急需向規(guī)?；?、輕簡(jiǎn)化方向發(fā)展[2，3]。水稻旱直播是一種新型種植方式，與人工插秧和機(jī)械插秧相比，具有省工降本等優(yōu)點(diǎn)，適用于水稻的規(guī)?；?、輕簡(jiǎn)化種植。但是，旱直播方式的粗放田間管理導(dǎo)致雜草生長(zhǎng)嚴(yán)重，對(duì)水稻的生長(zhǎng)和產(chǎn)量影響很大[4]。因而，培育抗除草劑的水稻新品種是適應(yīng)輕簡(jiǎn)化栽培的重要手段。

咪唑乙鹽酸又稱咪草煙，屬于咪唑啉酮類除草劑，具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn)，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制高等植物體內(nèi)乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，ALS)的活性從而抑制側(cè)鏈氨基酸的合成[5]，進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的合成，有絲分裂指數(shù)下降，最終使組織失綠、黃化，植株逐漸死亡達(dá)到除草目的[6－8]。作物對(duì)咪唑啉酮類除草劑的抗性來(lái)源于ALS基因一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異從而導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)變化，不同位點(diǎn)的突變產(chǎn)生了抗除草劑水平的差異[8－11]。王芳權(quán)等[12]在水稻品種資源材料中篩選到一株抗咪草煙的水稻(金粳818)，通過(guò)對(duì)其ALS基因的測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其ALS基因第1 880位堿基G轉(zhuǎn)換為A，即第627位氨基酸由絲氨酸(Ser，S)突變?yōu)樘於０?Asn，N)。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，將金粳818來(lái)源的ALS基因?qū)肫渌静牧现校瑥亩嘤隹惯洳轃煹乃拘缕贩N，這對(duì)于水稻旱直播方式的推廣具有重要意義[13，14]。

水稻的豐產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)受水稻鱗翅目害蟲的影響。稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟可造成水稻減產(chǎn)5%~10%[15，16]。主要表現(xiàn)為葉片枯白、枯心苗、白穗等。對(duì)水稻鱗翅目害蟲具有抗性的稻種資源目前尚未發(fā)現(xiàn)，因此對(duì)螟蟲的防治主要以施用農(nóng)藥為主，但同時(shí)也存在農(nóng)藥殘留污染、防治效果不佳以及增加成本等問題。培育抗蟲水稻是抵御蟲害的重要措施之一，目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的抗蟲基因，將Bt蛋白基因?qū)氤Ｒ?guī)水稻，可以提高水稻對(duì)螟蟲的抗性[17]。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的種植推廣對(duì)減少農(nóng)藥使用、增加作物產(chǎn)量、提高經(jīng)濟(jì)效益及環(huán)境保護(hù)等具有重要意義[18]。

本研究通過(guò)雜交和分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)，將抗除草劑ALS基因與抗蟲基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A聚合，獲得同時(shí)具有持久穩(wěn)定的抗除草劑和抗蟲的新品系，為黃淮稻區(qū)水稻直播和抗蟲水稻的推廣提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

顯性核不育材料的除草劑抗性基因ALS來(lái)源于金粳818[12]。攜帶抗蟲基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A的供體親本華恢1號(hào)、T1C－19、T2A－1是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的單拷貝轉(zhuǎn)Bt基因水稻株系。潤(rùn)農(nóng)11、圣稻22、華粳5均是黃淮稻區(qū)的粳稻主栽品種，農(nóng)藝性狀優(yōu)良。

1.2 分子標(biāo)記檢測(cè)

在水稻分蘗盛期取新鮮幼嫩葉片，采用CTAB法[15]提取供試水稻基因組總DNA。

利用王廣達(dá)等[19]設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物ALS－627－F/ALS－627－R和限制性內(nèi)切酶DdeI對(duì)感咪草煙基因型(ALS－G)和抗咪草煙基因型(ALS－A)進(jìn)行區(qū)分。利用Yang等[20]開發(fā)的引物Cry1Ab1Ac－F/Cry1Ab1Ac－R、Cry1C－F/Cry1CR、Cry2A－F/Cry2A－R對(duì)抗性基因Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A進(jìn)行檢測(cè)。具體引物序列見表1。

表1 本研究所用分子標(biāo)記

1.2.1 抗蟲基因的分子檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系(20 μL):DNA模板3μL，2×PowerTaqPCR Master-Mix 10μL，正反引物各0.5μL，ddH2O 6μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

1.2.2 抗除草劑基因ALS的分子檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系及程序同1.2.1。酶切體系(30μL):DNA模板(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)20μL，10×K Buffer 3μL，DdeⅠ酶0.34μL，ddH2O 6.66μL。37℃反應(yīng)0.5 h。經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

1.3 性狀評(píng)價(jià)

1.3.1 田間除草劑抗性鑒定 于苗期人工噴灑咪唑乙鹽酸除草劑在水稻植株葉片上，5 d后進(jìn)行觀察。

1.3.2 田間抗蟲鑒定 在不用任何藥劑防治的情況下，于每年稻縱卷葉螟高發(fā)期，田間調(diào)查其危害情況及引起的白穗發(fā)生情況，并統(tǒng)計(jì)白穗率。

1.3.3 雙抗材料的農(nóng)藝性狀 聚合Cry1Ab/Ac和ALS、Cry1C和ALS、Cry2A和ALS基因的雙抗水稻新品系按小區(qū)種植，小區(qū)面積5 m2。同時(shí)種植華恢1號(hào)、T1C－19、T2A－1、潤(rùn)農(nóng)11、圣稻22、華粳5作為對(duì)照。所有供試水稻材料均種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)基地，5月4日播種，6月4日插秧，正常大田管理。農(nóng)藝性狀調(diào)查分為抽穗期、株高、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒重和穗長(zhǎng)，具體方法參考?水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)?[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。不同材料均值的多重比較利用R軟件包multcomp和Tukey測(cè)驗(yàn)進(jìn)行分析。圖片采用PowerPoint 2007繪制，后期采用Adobe Photoshop CS5進(jìn)行加工。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗水稻新品系選育過(guò)程

以聚合ALS和Cry1Ab/Ac的雙抗水稻新品系選育為例，具體選育過(guò)程如圖1所示。以攜帶純合基因ALS的粳型顯性核不育系為起點(diǎn)，通過(guò)和攜帶純合基因Cry1Ab/Ac的秈稻華恢1號(hào)雜交一次，引入抗蟲基因。雜交后代的F1單株均攜帶了雜合的ALS和Cry1Ab/Ac基因以及50%粳稻遺傳背景，且可育單株和不育單株以1∶1的比例分離；以不育的F1單株為母本，以黃淮區(qū)的主栽粳稻品種A(潤(rùn)農(nóng)11)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約75%。在雜交后代FA1群體中，基因ALS和Cry1Ab/Ac發(fā)生了分離；通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇，挑選攜帶兩個(gè)基因的陽(yáng)性不育單株為母本，以黃淮區(qū)主栽粳稻品種B(圣稻22)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約87.5%。繼續(xù)挑選攜帶兩個(gè)基因的陽(yáng)性不育FB1單株為母本，以黃淮區(qū)主栽粳稻品種C(華粳5)為父本雜交一次，提升后代單株的粳稻遺傳背景至約93.75%。在雜交后代FC1群體中，挑選兩個(gè)基因陽(yáng)性且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的可育單株，連續(xù)自交至F6世代；在連續(xù)自交的過(guò)程中，每個(gè)世代均進(jìn)行兩個(gè)基因的選擇和農(nóng)藝性狀選擇。最終，在F6世代單株中，挑選兩個(gè)目標(biāo)基因純合、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株作為攜帶ALS和Cry1Ab/Ac的雙抗水稻新品系。

圖1 攜帶ALS和Cry1Ab/Ac雙抗水稻新品系的選育過(guò)程示意圖

根據(jù)上述選育過(guò)程，最終得到聚合Cry1Ab/Ac與ALS基因的水稻品系2個(gè):1A1、1A2；聚合Cry1C與ALS的水稻品系2個(gè):1C1、1C2；聚合Cry2A與ALS的水稻品系2個(gè):2A1、2A2(圖2)。

圖2 基因ALS(A)、Cry1Ab/Ac(B)、Cry1C(C)、Cry2A(D)的分子標(biāo)記檢測(cè)

2.2 雙抗水稻新品系的抗除草劑評(píng)價(jià)

在噴施除草劑后，水稻生長(zhǎng)緩慢，葉色加深。1周后不含抗除草劑ALS等位基因的水稻開始出現(xiàn)凋萎和死亡，先從新葉枯死，隨后老葉也逐漸枯死，15 d后基本全部死亡；而抗除草劑水稻開始恢復(fù)并正常生長(zhǎng)(圖3)。

圖3 田間抗除草劑鑒定

2.3 雙抗水稻新品系的抗蟲性

由表2可知，雙抗新品系的白穗率介于0.20%~0.50%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于3個(gè)主栽品種(約39%)，與3個(gè)抗蟲親本的白穗率(約0.20%)相當(dāng)，表明新品系的抗蟲性得到明顯提高。

表2 親本與雙抗株系稻縱卷葉螟危害情況

2.4 雙抗水稻新品系的農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)

由表3可知，在抽穗期方面，聚合Cry1Ab/Ac和ALS基因的新品系1A1和1A2與主栽品種圣稻22一致，聚合Cry2A和ALS基因的新品系2A1和2A2與主栽品種華粳5一致，聚合Cry1C和ALS基因的新品系1C1和1C2比主栽品種圣稻22長(zhǎng)約2 d。在株高方面，新品系1A1和1A2、2A1和2A2分別與主栽品種華粳5和圣稻22一致，而新品系1C1和1C2比主栽品種圣稻22高約2 cm。在每穗實(shí)粒數(shù)方面，6個(gè)新品系均顯著低于3個(gè)主栽品種。在千粒重方面，新品系1A1、1C2和2A1顯著低于3個(gè)主栽品種，新品系1C1和2A2與主栽品種潤(rùn)農(nóng)11一致，新品系1A2介于主栽品種華粳5和潤(rùn)農(nóng)11之間。在穗長(zhǎng)方面，新品系1A2、1C2和2A1與主栽品種圣稻22相差不大，新品系1C1介于主栽品種潤(rùn)農(nóng)11和圣稻22之間?；?個(gè)性狀的綜合考量，6個(gè)新品系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)均接近于主栽品種。

表3 潤(rùn)農(nóng)11、圣稻22、華粳5及6個(gè)雙抗新品系主要農(nóng)藝性狀

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，水稻由播種、插秧的傳統(tǒng)方式逐步向直播等輕簡(jiǎn)栽培方式轉(zhuǎn)變。在直播稻田中容易發(fā)生雜草，危害農(nóng)作物生長(zhǎng)，尤其是與直播相伴的雜草危害已經(jīng)嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[22，23]。本研究將抗除草劑品種金粳818來(lái)源的ALS等位基因應(yīng)用于雙抗水稻新品系的選育，相比于目前的主栽品種潤(rùn)農(nóng)11、圣稻22和華粳5，新品系對(duì)除草劑咪唑乙鹽酸表現(xiàn)出很好的抗性。該結(jié)果為ALS等位基因在抗除草劑品種的培育過(guò)程中的應(yīng)用提供了重要的理論支持，并進(jìn)一步證實(shí)了該基因的廣闊應(yīng)用前景。

利用Bt基因能夠增強(qiáng)植物對(duì)螟蟲的抗性，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外多年的研究和商業(yè)化種植中得到了充分證明[24－26]。本研究將轉(zhuǎn)基因秈稻材料攜帶的3個(gè)抗蟲基因引入黃淮稻區(qū)的粳稻育種群體中，Cry1Ab/Ac、Cry1C、Cry2A基因及其介導(dǎo)的抗性在所有雜交和自交獲得的轉(zhuǎn)基因株系中均能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，并表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗蟲能力。該結(jié)果為抗螟蟲粳稻的培育提供了理論基礎(chǔ)。

本研究利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法，將抗除草劑基因ALS和3個(gè)抗蟲基因?qū)刖荆⑦x育出6個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系。相比于目前黃淮稻區(qū)的主栽品種，6個(gè)水稻新品系在保證產(chǎn)量的前提下，顯著提高了除草劑抗性和螟蟲抗性，為黃淮稻區(qū)水稻的直播和綠色種植提供了重要的材料基礎(chǔ)。