蒲利云，王國福，楊明秋，汪 坤，李丙順，沈銘輝，夏光遠(yuǎn)，劉洪濤

( 海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570206)

斧文蛤(Deshayes)，屬軟體動(dòng)物門，雙殼綱(Bivalvia)，簾蛤科(Veneridae)，文蛤?qū)?)，為暖水性經(jīng)濟(jì)貝類。在我國主要分布在廣東、廣西、海南和臺(tái)灣沿海，常埋棲于潮下帶至水深20 m左右的砂質(zhì)海底。斧文蛤成體個(gè)體大，肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的青睞,是我國東南沿海一帶經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高、具有廣闊養(yǎng)殖開發(fā)前景的貝類。市面上出現(xiàn)的斧文蛤資源主要來源于天然海區(qū)的捕撈，由于過度捕撈及無繁殖保護(hù)措施等因素影響，其自然資源量急劇下降，但市場需求卻在不斷增加。

目前，國內(nèi)外對(duì)斧文蛤的研究主要集中在系統(tǒng)分類學(xué)、分子標(biāo)記篩選與群體遺傳、營養(yǎng)和受精生物學(xué)等方面的，而有關(guān)繁殖生物學(xué)的研究僅見邵艷卿等和張炯明等開展的斧文蛤生殖周期及早期發(fā)育和人工育苗試驗(yàn)，其他相關(guān)報(bào)道較少。因此，開展斧文蛤親本的促熟與催產(chǎn)技術(shù)研究，填補(bǔ)斧文蛤促熟技術(shù)的空白，為斧文蛤種質(zhì)資源保護(hù)、穩(wěn)定生產(chǎn)人工苗種和苗種規(guī)?；庇峁┝嘶A(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斧文蛤親本 2021年4月 15日，在海南省馮家灣海域捕獲斧文蛤，挑選殼長3.0～8 cm，體重5～30 g，殼表鮮艷、完整、雙殼閉合有力的個(gè)體作為親本，共1 200個(gè)。解剖觀察，成熟的斧文蛤親本卵巢呈淡黃色，精巢呈乳白色。

1.1.2 培育餌料 以人工培養(yǎng)的角毛藻()、鹽藻()、亞心形扁藻()及等單胞藻活餌料為主，輔以人工配合餌料綠藻粉、螺旋藻粉及干酵母片等。

1.1.3 親本培育池 本試驗(yàn)在海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊海科研基地進(jìn)行，室外培育水泥池規(guī)格為10 m×1.5 m×1m(長×寬×深)，池底鋪有細(xì)沙厚度約20 cm，備有充氣石。水泥池上方遮蓋帆布，可防雨防曬，用黑布在四邊圍起可調(diào)節(jié)水泥池亮度。

1.1.4 培育用水處理 從養(yǎng)殖基地岸邊向海里約200 m處區(qū)域設(shè)置取水口抽水，抽上來的海水，經(jīng)兩次沉淀、砂濾后直接用于親本培育。

1.2 方法

1.2.1 室外水泥池促熟培育法 斧文蛤親本運(yùn)抵基地后洗刷干凈，分別按照40、60、80、100和120個(gè)/m的密度進(jìn)行促熟培育，待培育30 d后比較其成活率和最終的成熟率。培育池水深為0.6～0.8 m，連續(xù)充氣。單胞藻類活餌料每天投喂2次，人工配合餌料每天投喂3次。單胞藻類活餌料日投餌量按不同培育密度分別為20、30、40、50及60萬cells/mL，綠藻粉和螺旋藻粉日投餌量分別為8、12、16、20及24 mg/L；干酵母片日投喂量控制在1～5 mg/L。每天觀察親本活動(dòng)及死亡情況，及時(shí)清理排泄物和死亡的個(gè)體，日換水量為50%～70%，每5～7 d倒池1次。每隔7 d檢查親本性腺的變化情況。親本培育的水溫變化為25.5～30.5 ℃，海水比重在1.020～1.022之間，溶解氧保持在4 mg/L以上，pH值保持在7.8～8.2之間。

1.2.2 人工催產(chǎn)方法

將親本從培育池中撈出，并置于陰涼的地方干露刺激。

將親本放入小容量的玻璃缸或水桶中，注入海水并用加熱棒加熱，使水溫升高約為3 ℃，再用準(zhǔn)備好的冰袋降至常溫，反復(fù)連續(xù)2～3次的刺激。

利用藻液進(jìn)行刺激，即把親本放入容積約為500 L塑料盆中，注入120萬cells/mL金藻()及100萬cells/mL亞心形扁藻液，約40 min后，藻液顏色逐漸變清，且排放大量有條狀的糞便。

打開誘導(dǎo)池排水閥門，用小型抽水泵往池壁處橫向沖水，并控制好水流壓力，使水能均勻地流過誘導(dǎo)池池底并對(duì)親本進(jìn)行刺激。

解剖數(shù)個(gè)達(dá)到成熟期的親本取其精子及卵子加入誘導(dǎo)池中，以刺激其它待排放的親本。

1.2.3 分組 根據(jù)以上五種催產(chǎn)方法，設(shè)計(jì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)空白組，Ⅰ組:陰干刺激1.5 h；Ⅱ組:陰干刺激1.5 h+溫度刺激；Ⅲ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h。Ⅳ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h+流水刺激；Ⅴ組:陰干刺激1 h+溫度刺激+藻液刺激1 h+流水刺激+精卵誘導(dǎo)；空白組為置于水體環(huán)境條件較為穩(wěn)定的室內(nèi)水泥池中讓其自行排放，不采用陰干、溫度、藻液、流水及精卵等方法刺激。

1.2.4 產(chǎn)卵孵化 于5月16日挑選出已經(jīng)達(dá)到成熟期、外殼完整無破損，閉殼有力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組親本為100個(gè)，用濃度為10×10的KMnO浸泡約5～10 min，再用過濾海水沖洗干凈，并置于產(chǎn)卵池待其排放。當(dāng)產(chǎn)卵完成后，及時(shí)移出親本，再經(jīng)過約3次洗卵，除去多余精液后，移入孵化池內(nèi)進(jìn)行孵化。觀察并記錄下不同實(shí)驗(yàn)組親本的開始排放時(shí)間，比較其排放率、受精率及從受精卵發(fā)育至D型幼蟲時(shí)出現(xiàn)的畸形率(下稱幼蟲畸形率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室外水泥池促熟培育

斧文蛤親本經(jīng)過30 d五種不同培育密度的營養(yǎng)強(qiáng)化、催熟培育，其最終的成活率及其成熟率的情況詳見表1，親本培育成活率最高的為94.15%，最低的僅為75.33%；而親本成熟率最高的為86.55%，最低的僅為62.46%。由此得出，在幾種不同的培育密度中，培育密度效果最好的是40個(gè)/m，而培育效果最差的密度為120個(gè)/m，并且隨著密度的增大，培育親本的成活率和成熟率均在逐漸地下降。此外，密度為40～80個(gè)/m的范圍時(shí)，其成活率及成熟率均比較接近。5月15日，解剖成熟的親本進(jìn)行觀察，其性腺非常飽滿，精巢呈乳白色，而卵巢則呈淡黃色，有手指輕輕一壓溢出大量游離的精子和卵子。在高分辨率的顯微鏡下觀察，精子細(xì)胞大多數(shù)已發(fā)育為成熟的精子，精子游動(dòng)頻繁，活力較為旺盛；而大多數(shù)卵黃形成后期卵母細(xì)胞已發(fā)育變成成熟的卵母細(xì)胞，卵子形狀正常。通過比較得出，利用室外水泥池對(duì)斧文蛤親本進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化培育，促使性腺發(fā)育成熟是可行的，并且培育密度控制在40～80個(gè)/m范圍時(shí)，均可獲得較好的培育效果。

表1 不同培育密度條件下最終的成活率及其成熟率的比較

2.2 親本人工誘導(dǎo)排放

斧文蛤親本在不同刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的作用下，被誘導(dǎo)后的開始排放時(shí)間、排放率、受精率及幼蟲畸形率的具體變化情況見表2。從空白組開始，五個(gè)實(shí)驗(yàn)組伴隨著刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的加強(qiáng)及增加，親本從誘導(dǎo)后至精卵開始排放所需要的時(shí)間越短，排放率也逐漸增加，而受精率則下降，幼蟲畸形率也不斷地增加。這充分說明空白組的親本由于沒有外部因素的刺激，屬于自然排放，只有性腺達(dá)到游離狀態(tài)時(shí)才能排放精卵；Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組試驗(yàn)組采用陰干、溫度及藻液一種或多種刺激方法的組合，大部分達(dá)到排放期的親本均能排放精子和卵子，從刺激后到精卵開始排放需要的時(shí)間較長，但由于排放的精子和卵子成熟度較好，因此，獲得比較高的受精率，且出現(xiàn)的幼蟲畸形率也比較低；而Ⅳ試驗(yàn)組增加了流水刺激的步驟，Ⅴ組又在Ⅳ組強(qiáng)度的基礎(chǔ)上再增加了異性產(chǎn)物刺激，隨著刺激強(qiáng)度和步驟的增加，處于成熟期和部分尚未達(dá)到成熟的性腺都排放出精卵，雖然排放率提高了，但排放的精子和卵子由于成熟度不夠，因此，造成受精率的降低，且幼蟲畸形率則相應(yīng)地增高。

表2 不同誘導(dǎo)方法作用下親本的排放率、受精率及其幼蟲畸形率的比較

通過比較得出，采用陰干刺激1h+溫度刺激+藻液刺激1 h組合誘導(dǎo)時(shí)，只有發(fā)育到排放期的親本才排放精卵，且排放的精卵細(xì)胞成熟度好，受精率較高，幼蟲畸形率則比較低。

3 討論

3.1 室外水泥池促熟培育

通過斧文蛤親本室外水泥池的培育結(jié)果得出，40個(gè)/m的培育密度的成活率和成熟率均為最高，120個(gè)/m的培育密度的成活率和成熟率均為最低，通過不同密度的比較得出，親本的成活率和成熟率隨著密度的增加而在不斷地降低。其原因主要有，首先，由于培育密度的增加，單位水體親本數(shù)量的增加及餌料投喂的增多，造成代謝產(chǎn)物及食物殘?jiān)牧恳苍谠黾?，加劇了培育水體的亞硝酸和氨氮量含量在不斷地增加而造成部分親本的死亡，而降低培育的成活率；其次，親本在培育期間，由于親本個(gè)體性腺發(fā)育階段的不同步性，有個(gè)別率先發(fā)育至排放期的親本自然排放了精卵，產(chǎn)生異性產(chǎn)物刺激作用，促使其附近的其他達(dá)到成熟期的親本排放精卵，而影響親本最終的培育成熟率，且與密度低的培育池相比，密度較高的培育環(huán)境更容易發(fā)生該刺激作用。因此，高密度的培育池會(huì)出現(xiàn)較低成熟率。

梁飛龍等、謝玉坎分別進(jìn)行了大珠母貝()、翡翠貽貝()親本室內(nèi)水泥池促熟培育，利用小球藻(sp.)、巴夫藻()、扁藻、混合藻等為培育餌料進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，均獲得了預(yù)期的效果。筆者前期利用室外水泥池，進(jìn)行古蚶和長肋日月貝等雙殼貝類親本的促熟培育，以鹽藻、扁藻、角毛藻等單胞藻餌料為主，輔以螺旋藻粉、綠藻粉等人工配合餌料，也獲得了預(yù)期的促熟效果。而本次培育斧文蛤也獲得預(yù)期的效果。

因此，利用室外水泥池促熟斧文蛤親本，其效果是非常顯著的。

3.2 親貝誘導(dǎo)排放

陰干刺激、溫度刺激、藻液刺激、流水刺激、異性產(chǎn)物刺激等誘導(dǎo)方法，作為大部分雙殼貝類誘導(dǎo)精卵排放的最常用方法。一般情況下，使用多種方法組合比單一種方法誘導(dǎo)的效果要好。

本研究利用性腺發(fā)育至成熟期的斧文蛤親本，進(jìn)行了幾種不同組合的催產(chǎn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著刺激強(qiáng)度和誘導(dǎo)步驟的加強(qiáng)及增加，斧文蛤親本從誘導(dǎo)后至精卵開始排放所需要的時(shí)間越短，排放率也逐漸增加，而受精率則下降，幼蟲畸形率也相應(yīng)地提高了。這充分說明了斧文蛤親本在多步驟、高強(qiáng)度的刺激作用下，促使一部分未發(fā)育至成熟期的精卵也排放出來，造成一些精卵不能受精或受精質(zhì)量較差，或部分受精后胚胎發(fā)育不能正常進(jìn)行或部分發(fā)育后變畸形等。與黃海立等對(duì)珠母貝親貝、張志強(qiáng)對(duì)馬氏珠母貝的催產(chǎn)研究及其筆者前期開展古蚶和長肋日月貝研究的結(jié)果一致。