孫永紅,別俊,何群育,郭奇遇

(南充市中心醫(yī)院,四川 南充 637000 1 腫瘤科； 2 口腔科)

食管癌侵襲性強，男性的估計發(fā)病率是女性的3倍，總體5年生存率僅為20%左右[1]。因此，仍需要探索有效篩查、診斷和治療食管癌的新方法。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種單鏈不具有編碼蛋白質功能的RNA，其長度在200～100 000 nt之間[2]，如ELFN1-AS1、FAM83A-AS1等均可促進食管癌的進展[3-4]。轉錄因子7樣蛋白2(TCF7L2)是Wnt信號通路的關鍵分子，并可以調控β連環(huán)蛋白1(CTNNB1)的轉錄[5]，研究已經發(fā)現TCF7L2-SATB1通路與食管癌病人不良預后有關[6-7]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是一種蛋白酶，研究表明約有82%的食管癌組織表達COX-2，并且參與食管癌的起源和發(fā)展[8]。前期研究發(fā)現的一種新型的LncRNA TMEM9B-AS1，主要在結腸和腎臟表達[9]。但是，其對食管癌的影響和作用機制尚不清楚，目前仍無相關報道。因此，本研究旨在探討TMEM9B-AS1在體外對食管癌細胞侵襲和增殖能力的影響，以及介導TCF7L2-SATB1途徑對食管癌細胞COX-2和CTNNB1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人食管癌細胞KYSE510(ATCC?CRL-9609)以及96孔和24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司，美國)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)。TMEM9B-AS1過表達、沉默質粒以及相應的陰性對照(NC)(吉瑪公司，中國)，Lipofectamine?2000(Invitrogen公司，美國)。Trizol試劑(Aidlab公司，中國)，RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國)，BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國)，PCR儀(ABI7900，ABI公司，美國)。一抗以及山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721，美國Abcam公司)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)，ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)，Matrigel膠和Transwell裝置(Corning公司，美國)。光學顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組和轉染 將KYSE510細胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中，內含有體積分數0.10牛血清、0.1 g/L鏈霉素和100 kU/ L青霉素。細胞在含體積分數0.05 CO2、37 ℃和95%濕度下培養(yǎng)。將KYSE510分為對照組(A組)、TMEM9B-AS1組(B組)和siTMEM9B-AS1組(C組)，分別轉染NC質粒、TMEM9B-AS1質粒以及siTMEM9B-AS1質粒。按試劑盒說明書利用Lipofectamine?2000進行轉染，轉染條件為7 ℃和體積分數0.05 CO2，48 h后收集細胞進行后續(xù)研究，分別進行定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測、細胞計數(CCK-8)檢測、轉移小室(Transwell)實驗及蛋白質印跡(Western blot)實驗。

1.2.2RT-qPCR檢測TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA表達 使用RNeasy Mini試劑盒提取細胞總RNA，然后將其逆轉轉錄為cDNA。使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95 ℃、2 min， 94 ℃、20 s，58 ℃、 20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx 3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內參對照，計算TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2以及CTNNB1的mRNA相對表達水平。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖活力 將100 μL的細胞懸浮液添加到96孔板中，孵育48 h和72 h后，將體積為10 μL的CCK-8溶液添加到每個孔中并孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm波長處每個孔的光密度(OD)值。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲能力 將基質膠Matrigel(1∶8稀釋)加入24 孔板-Transwell 裝置的上室，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。 將 600 μL 完全培養(yǎng)液填充到裝置的下室。將細胞(密度為5×107/L)在無血清培養(yǎng)液中于37 ℃培養(yǎng) 24 h進行饑餓處理。消化后，向上室中加入 100 μL 細胞溶液(密度為5×108/L)。培養(yǎng)24 h后，洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用體積分數0.95乙醇固定，1 g/L結晶紫室溫染色20 min。隨機取5個400倍視野進行細胞計數。

1.2.5Western blot檢測TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白的表達 細胞裂解后通過離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)收集總蛋白。采用SDS-PAGE分離每個樣品中等量(50 μg)的蛋白質，并將其轉移到PVDF膜上。室溫下將膜浸入50 g/L脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。隨后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光試劑顯像，采用Quantum One軟件分析條帶灰度值并計算TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組食管癌細胞TMEM9B-AS1的表達

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞TMEM9B-AS1的表達水平分別為1.00±0.08、4.27±0.45和0.32±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(F=38.035，P<0.001)。提示轉染實驗成功。

2.2 TMEM9B-AS1對食管癌細胞增殖活力影響

結果表明，各組食管癌細胞不同時間的增殖活力比較，差異有統(tǒng)計學意義(F48 h=7.391，F72 h=19.190，P<0.05)。析因設計的方差分析結果顯示，不同時間和不同組別對食管癌細胞增殖活力均有影響，且二者存在交互效應，差異均具有統(tǒng)計學意義(F時間=4.347，F組別=18.681，F時間×組別=6.528，P<0.001)。兩兩比較的結果顯示，TMEM9B-AS1組的細胞增殖活力顯著高于對照組(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組細胞增殖活力則顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 TMEM9B-AS1對食管癌細胞的增殖活力影響

2.3 TMEM9B-AS1對食管癌細胞侵襲能力影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組癌細胞的浸入數分別為186.45±8.75、314.79±15.42和96.21±7.38，差異有顯著性(F=30.268，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞的侵襲能力顯著升高，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖1。

A：對照組；B：TMEM9B-AS1組；C：siTMEM9B-AS1組。

2.4 TMEM9B-AS1對食管癌細胞TCF7L2以及SATB1表達影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(FmRNA=42.658、49.318，F蛋白=35.154、37.489，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖2和表2。

A：對照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表2 TMEM9B-AS1對食管癌細胞TCF7L2-SATB1途徑影響

2.5 TMEM9B-AS1對食管癌細胞CTNNB1和COX-2表達影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(FmRNA=54.309、56.084，F蛋白=36.448、42.738，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖3和表3。

A：對照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表3 TMEM9B-AS1對食管癌細胞中CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達影響

3 討 論

食管癌發(fā)病率逐年升高，但是目前尚無治療食管癌的有效手段[10-11]。由于食管癌細胞早期可侵入黏膜下層或者轉移至遠處器官，許多病人在術后短時間內就會出現腫瘤局部復發(fā)或遠處轉移[12-13]。由于食管癌病人術后生存率低、預期生存期短、預后差[14]，因此，探究食管癌發(fā)病機制具有重大意義。

LncRNA是近年來的研究熱點，參與腫瘤的發(fā)生和進展。LncRNA具有許多生物學功能，首先，作為轉錄因子的組成部分，可以通過調控原癌基因和抑癌基因的轉錄參與食管癌細胞的增殖和轉移[15-17]。在轉錄后水平上，LncRNA可以通過調節(jié)mRNA的剪切水平調控基因的表達，如LncRNA DGCR5通過SRSF1介導的Mcl-1選擇性剪接參與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生[18]。此外，LncRNA也可通過競爭性內源RNA形式調控微小RNA，最終調控mRNA表達，如LINC00460通過靶向miR-1224-5p促進食管癌轉移潛能和上皮間質轉化[19]。本研究主要分析新LncRNA TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。編碼LncRNA TMEM9B-AS1的基因位于11號染色體(NC_000011.10)，轉錄本為389個堿基，表達于多種組織和器官，以結腸和腎臟為主。本研究利用質粒轉染的方式分別構建了TMEM9B-AS1沉默和過表達的細胞模型，結果顯示，在TMEM9B-AS1的水平升高后，食管癌細胞增殖和侵襲能力顯著升高；而TMEM9B-AS1的水平降低后，細胞食管癌增殖和侵襲能力顯著降低。本文體外水平研究顯示TMEM9B-AS1具有促進食管癌細胞增殖和遷移的作用，說明其可能參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

為進一步分析TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制，我們檢測了TCF7L2-CTNNB1途徑以及COX-2和SATB1蛋白的表達。TCF7L2蛋白參與Wnt信號通路，并通過序列特異性方式與其啟動子結合來調節(jié)下游MYC基因的表達，其可調控CTNNB1的轉錄激活[5,20-21]。BAHRAMIAN等[22]收集腫瘤組織和鄰近組織研究發(fā)現，TCF7L2在食管癌和胃癌中顯著表達，可能在功能上參與癌癥細胞的增殖、凋亡和血管生成通路。TCF7L2在食管鱗狀細胞癌細胞中通過ERK1/2依賴性途徑調控促癌基因轉錄，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展[23-24]。以上研究表明TCF7L2過表達可能對食管癌的發(fā)生具有促進作用。而CTNNB1基因是編碼β-catenin蛋白的基因，其是促進食管癌細胞增殖、轉移的重要細胞內信號通路，抑制該通路也是治療食管癌的重要思路[25-27]。在哺乳動物中，TCF7L2可以和β-catenin通過DNA結合位點進行結合，共同控制和調控Wnt信號通路。此外，SATB1是一種核基質附著區(qū)結合蛋白，參與調控染色質的合成，在哺乳動物細胞中，SATB1直接與β-catenin相互作用，并通過與其啟動子結合來調節(jié)Wnt靶標的表達[28-30]。并通過調控全局染色質調節(jié)眾多基因的表達，研究已經顯示SATB1通過上調FN1和PDGFRB在食管癌中發(fā)揮原癌基因的作用[31]。同時，COX-2蛋白對食管癌也具有促進作用，研究顯示miR-128的甲基化沉默通過提高COX-2的表達促進食管癌的發(fā)展[32]。以上4種分子TCF7L2-SATB1途徑，COX-2和CTNNB1均對食管癌細胞增殖、遷移以及發(fā)生發(fā)展具有促進作用。本研究結果顯示，在食管癌細胞內過表達TMEM9B-AS1，可以明顯促進食管癌細胞中TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA和蛋白表達，而抑制TMEM9B-AS1在食管癌細胞內過表達則可以促進上述指標的mRNA和蛋白表達水平。Wnt/β-catenin信號通路在各種類型的癌癥中通過調節(jié)COX-2基因的表達來影響疾病的發(fā)展[33]。因此，COX-2是Wnt/β-catenin信號通路下游的分子。

本文研究結果表明，TMEM9B-AS1很可能是通過TCF7L2-SATB1途徑來抑制或者促進下游分子COX2的表達以及減少CTNNB1與TCF7L2的結合，從而影響食管癌細胞的增殖和侵襲能力，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。CARROSSINI等[34]研究結果顯示，COX-2表達和食管癌病人異位脂肪量呈顯著正相關，并在腺癌中檢測到共定位，但在食管鱗狀細胞癌中未檢測到。CONG等[35]在食管鱗狀細胞癌中檢測到48.3%的SATB1表達量，而正常組織只有7.8%，但分析結果顯示SATB1表達與臨床病理學特征沒有顯著相關性。但SATB1高表達病人的生存期明顯短于SATB1低表達者，因此，高SATB1表達是食管鱗狀細胞癌病人的獨立預后因素，并且可作為其靶向治療的潛在分子。后續(xù)臨床研究應關注到COX-2和SATB1表達在兩種類型癌癥中的差別。

綜上所述，上調TMEM9B-AS1表達可以通過TCF7L2-SATB1途徑，提高COX-2和CTNNB1的表達，并增強食管癌細胞增殖和侵襲的能力。但目前研究僅僅在體外細胞水平驗證了TMEM9B-AS1在食管癌中的作用，仍缺乏組織水平和動物模型的體內驗證，尤其是在轉基因工具鼠中的驗證效果更有說服力。其次，食管癌呈現出兩種主要的組織學亞型(腺癌和鱗狀細胞癌)，兩種亞型在病理學和分子機制方面均存在很大差異，因此應研究分子以及信號通路在不同類型食管癌中的表達差異。再者關于4種分子TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1在食管癌細胞里互相作用機制仍未探究，因此未來研究應重點關注和解決TMEM9B-AS1在食管癌機制和治療中的臨床意義，其促癌的作用仍需要進行體內研究，調控TCF7L2-SATB1途徑的分子機制也需要進一步研究和探索。