王曉孟,屈鳳祥,王丹,趙敏,徐琳

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 產(chǎn)科； 2 兒科)

多囊卵巢綜合征(PCOS)為一種常見內(nèi)分泌紊亂和代謝性疾病，其患病率為5%～10%[1]。PCOS臨床表現(xiàn)為高雄激素血癥、稀發(fā)排卵和無排卵、胰島素抵抗、肥胖、血脂紊亂等[2]。超過50%的PCOS病人表現(xiàn)為肥胖，肥胖可使胰島素抵抗進(jìn)行性發(fā)展，從而加重高雄激素血癥。而肥胖型PCOS女性存在更為嚴(yán)重的內(nèi)分泌激素紊亂和代謝功能異常[3]。Ghrelin是從胃組織中分離出的生長(zhǎng)素釋放肽，主要來自胃黏膜A或X/A樣細(xì)胞[4-6]，在正常組織中表達(dá)，其作用除了促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放，還可調(diào)節(jié)能量代謝并影響胰腺的內(nèi)分泌功能和葡萄糖代謝。研究表明，Ghrelin基因多態(tài)性與PCOS病人代謝緊密相關(guān)[7]。目前關(guān)于PCOS的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明多種遺傳和環(huán)境因素在其發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[8]。本研究對(duì)Ghrelin基因多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性進(jìn)行探討，以期為PCOS的個(gè)性化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2017年12月—2018年7月，選擇我院婦產(chǎn)科確診的PCOS病人230例作為研究對(duì)象(PCOS組)，所有病人均符合2003年鹿特丹制定的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。另選擇同期與PCOS組年齡匹配、因輸卵管因素就診的月經(jīng)規(guī)則、基礎(chǔ)體溫雙相不孕癥婦女163例作為對(duì)照組。所有參與者3個(gè)月內(nèi)無其他激素類藥物應(yīng)用史并排除糖尿病、高血壓以及內(nèi)分泌、肝腎、心腦血管等疾病。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得研究對(duì)象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1標(biāo)本收集 采集受試對(duì)象月經(jīng)周期第3～6天外周靜脈血3 mL，月經(jīng)不規(guī)律者在B超檢查未見優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)采血，將血標(biāo)本置于EDTA抗凝管中，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA的提取 使用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer 3軟件針對(duì)目的基因全長(zhǎng)進(jìn)行特異性多重引物設(shè)計(jì)，引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4多重PCR擴(kuò)增目的基因及測(cè)序 PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。根據(jù)多重PCR重?cái)?shù)確定稀釋小試樣本數(shù)，然后在Illumina HiSeq PE150(Pair end 150bp)平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測(cè)序(翼和生物有限公司，上海)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡和睪丸素(T)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、促黃體生成素(LH)、腰臀比(WHR)、促卵泡激素(FSH)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.486～12.252,P<0.001)。 見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 Ghrelin基因多態(tài)性分布

PCOS組與對(duì)照組Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.584,OR=1.439,95%CI=1.026～2.020，P<0.05)。兩組等位基因分布頻率比較差異亦有顯著意義(χ2=4.337，OR=1.420,95%CI=1.020～1.976，P<0.05)。Hardy-Weinberg遺傳平衡分析顯示，基因rs55821288位點(diǎn)等位基因頻率達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。見表2。

2.3 基因模型分析

加性遺傳模型分析顯示，AA基因型者PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯低于GG基因型者(χ2=6.920，OR=4.025,95%CI=1.331～12.178，P<0.05)；隱性遺傳模型分析顯示，GG基因型者PCOS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于GA+AA基因型者(χ2=6.481，OR=3.786,95%CI=1.269～11.295，P<0.05)；而顯性遺傳模型分析顯示，GG+GA基因型與AA基因型PCOS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組rs55821288位點(diǎn)等位基因、基因型及遺傳模型分布比較(例(χ/%))

3 討 論

目前研究顯示，Ghrelin與多種疾病有關(guān)系，包括肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征和癌癥等[11-14]。此外，Ghrelin可能影響PCOS病人高雄激素分泌和顆粒細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[15]。目前，關(guān)于Gh-relin基因多態(tài)性與PCOS的關(guān)系尚不清楚。雖然尚未發(fā)現(xiàn)Ghrelin基因位點(diǎn)與PCOS發(fā)病機(jī)制直接相關(guān)，但Ghrelin在PCOS病人代謝或PCOS發(fā)病機(jī)制中的作用不容忽視[16]。越來越多的研究表明，PCOS的風(fēng)險(xiǎn)是由SNPs的協(xié)同和加性效應(yīng)引起的。Ghrelin基因具有異質(zhì)性，在不同的種族中具有不同的位點(diǎn)。眾所周知，環(huán)境和遺傳因素可以共同影響疾病的發(fā)展和發(fā)生。為了更好地闡明Ghrelin基因多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性，研究Ghrelin基因在不同人群中的表達(dá)具有重要意義。

Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)位于第4內(nèi)含子，有A和G兩種等位基因。目前關(guān)于rs55821288位點(diǎn)與PCOS關(guān)系的報(bào)道較少。本文研究了Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)多態(tài)性與PCOS的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PCOS組和對(duì)照組rs55821288位點(diǎn)等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律，樣本具有代表性；兩組Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)G和A基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，等位基因G的PCOS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于等位基因A，提示G等位基因可能是PCOS發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素。

綜上所述，Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)多態(tài)性與PCOS的發(fā)生有關(guān)，等位基因G可能是PCOS的易感基因。本文研究局限性：①本研究樣本量較?。虎谘芯恐辉谥袊鴿h族人群中進(jìn)行，為了確定Ghrelin基因rs55821288位點(diǎn)與PCOS發(fā)病的相關(guān)性，還需要進(jìn)一步研究?jī)?nèi)含子區(qū)域各基因位點(diǎn)之間的相互關(guān)聯(lián)是否導(dǎo)致了不同種族PCOS的發(fā)生。本文結(jié)果可為PCOS的基因預(yù)測(cè)和靶向治療提供一定的理論依據(jù)。