懷宙陽,董冰子,鄧玉杰,尹藝蓉,信芳杰,李成乾

(1 青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院保健科，山東 煙臺 264000； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科； 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)

Ghrelin是一種包含28個氨基酸的腦腸肽，主要由胃底X/A樣細胞分泌產(chǎn)生，是生長激素促分泌素受體(GHS-R)的內(nèi)源性配體[1-2]。GHS-R包括GHS-R1a和GHS-R1b兩種亞型。其中GHS-R1a活性較高，是Ghrelin最主要的內(nèi)源性受體，也是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)最主要的亞型[3]。GHS-R1a主要表達于胰島β細胞、垂體促生長激素細胞、下丘腦、海馬、腹側(cè)被蓋區(qū)、黑質(zhì)和中縫背核[4-7]。Ghrelin的主要功能是促進生長激素釋放、食物攝取和脂肪沉積[8-10]。除此之外，Ghrelin還可以通過抑制胰島素分泌和調(diào)節(jié)糖異生/糖原分解來調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。Ghrelin信號通路已越來越被認為在肥胖、胰島素抵抗和糖尿病中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，而且多項研究表明其調(diào)節(jié)作用似乎獨立于Ghrelin對食物攝入的影響[11-12]。目前關(guān)于Ghrelin及其受體在肥胖及糖代謝中的作用并未被完全闡明，有研究表明Ghrelin可增加胰島β細胞數(shù)量并促進胰島素的分泌[13-14]，亦有研究表明Ghrelin可抑制葡萄糖刺激下的胰島素分泌[15-17]。Ghrelin及其受體在糖代謝中的作用尚存在爭議。本研究旨在通過制備GHS-R1a基因敲除(KO)小鼠模型，探討GHS-R1a對高脂飲食小鼠體質(zhì)量、腹部脂肪及糖代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

雌性野生型(WT)C57BL/6小鼠購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(中國北京)。從上海南方模式生物研究中心獲得C57BL/6背景下的GHS-R1aKO小鼠(GHSR-/-，GHS-R1a外顯子1和2缺失)，在擴大群體前與C57BL/6小鼠回交7代以上[18-19]。小鼠飼養(yǎng)條件：環(huán)境溫度25 ℃，12 h晝夜循環(huán)光照(7:00-19:00進行光照)，濕度50%～60%，自由運動、飲水及進食。選取6周齡WT雌性C57BL/6小鼠10只，隨機分為普通飲食(脂肪質(zhì)量分數(shù)為0.10)組(WT RD組，n=5)和高脂飲食(脂肪質(zhì)量分數(shù)為0.60)組(WT HFD組，n=5)；選取6周齡GHS-R1aKO雌性C57BL/6小鼠10只，隨機分為普通飲食組(KO RD組，n=6)和高脂飲食組(KO HFD組，n=4)。小鼠的處理規(guī)程經(jīng)青島大學(xué)動物保護與使用委員會認證，本研究符合《實驗室護理及使用指南》的指導(dǎo)方針。

1.2 觀察指標(biāo)及測定方法

從6周齡到15周齡，每周在同一時間(上午9:00-10:00)測量體質(zhì)量。于16周齡時行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)：22:00至次日6:00禁食，收集各組小鼠的尾靜脈血，應(yīng)用美國強生公司生產(chǎn)的穩(wěn)步血糖儀測定空腹血糖(即0 min血糖)，按照1.5 mg/kg劑量給予葡萄糖腹腔注射，測定注射后15、30、60、120 min血糖。17周齡時，將小鼠安樂死后取出肝臟及腹內(nèi)白色脂肪組織，同時取血分離血清。取出的腹內(nèi)脂肪稱質(zhì)量后在室溫下置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定過夜，然后脫水并包埋在石蠟中，石蠟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。每只小鼠腹內(nèi)脂肪石蠟切片在20倍光學(xué)顯微鏡下隨機選取10個不同視野，應(yīng)用Image J軟件根據(jù)脂肪細胞輪廓范圍計算每個脂肪細胞面積，最后取平均值得到單個脂肪細胞面積。計算腹內(nèi)脂肪比例：腹內(nèi)脂肪比例=腹內(nèi)脂肪質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)。并采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測各組小鼠血清胰島素水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 高脂飲食對KO小鼠體質(zhì)量的影響

基因型、飲食方式、周齡對小鼠6～15周齡體質(zhì)量的影響不存在交互作用(F=0.62～2.03，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，相同周齡時4組小鼠體質(zhì)量比較差異均無顯著性(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同周齡時各組小鼠體質(zhì)量比較

基因型和飲食方式對15周齡較6周齡小鼠體質(zhì)量變化量的影響不存在交互作用(F=0.24，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，WT HFD組的體質(zhì)量變化量明顯高于WT RD組(F=6.99，P<0.05)，而KO HFD組與KO RD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 高脂飲食對KO小鼠脂肪組織的影響

基因型和飲食方式對小鼠腹內(nèi)脂肪質(zhì)量、腹內(nèi)脂肪比例的影響存在交互作用(F=5.85、6.55，P<0.05)，對肝臟質(zhì)量的影響也不存在交互作用(F=2.54，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，WT HFD組小鼠腹內(nèi)脂肪質(zhì)量、腹內(nèi)脂肪比例均顯著大于KO HFD組(F=4.79、6.39，P<0.05)，而WT RD組與KO RD組比較差異均無顯著性(P>0.05)。4組小鼠肝臟質(zhì)量比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

基因型和飲食方式對脂肪細胞面積的影響不存在交互作用(F=4.04，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，KO HFD組小鼠脂肪細胞面積較WT HFD組小(F=12.30，P<0.01)，而WT RD組和KO RD組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化量及腹內(nèi)脂肪指標(biāo)的比較

A：WT RD組；B：KO RD組；C：WT HFD組；D：KO HFD組。HE染色，20倍。

2.3 高脂飲食對KO小鼠糖代謝的影響

基因型和飲食方式對IPGTT血糖的影響不存在交互作用(F=1.09，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示，WT HFD組小鼠的空腹血糖水平顯著高于KO HFD組(P<0.01)，而WT RD組和KO RD組比較差異無顯著性(P>0.05)；WT HFD組小鼠注射后15 min血糖顯著高于WT RD組和KO RD組(P<0.05)；4組小鼠注射后30 min血糖水平比較差異無顯著性(P>0.05)；WT HFD組小鼠注射后60 min血糖水平顯著高于KO RD組(P<0.05)；4組小鼠注射后120 min血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

WT RD組與WT HFD組比較，*P<0.05；KO RD組與WT HFD組比較，#P<0.05；KO HFD組與WT HFD組比較，&P<0.05。

基因型和飲食方式對小鼠IPGTT曲線下面積(AUC)的影響不存在交互作用(F=2.18，P>0.05)。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示，WT HFD組明顯高于KO HFD組(F=6.40，P<0.05)，而WT RD組與KO RD組差異無顯著性(P>0.05)；WT HFD組明顯高于WT RD組(F=7.80，P<0.05)，而KO HFD組與KO RD組差異無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠IPGTT-AUC、空腹胰島素水平比較

基因型和飲食方式對空腹胰島素水平的影響存在交互作用(F=19.98，P<0.01)。單獨效應(yīng)分析顯示，WT HFD組小鼠空腹胰島素水平顯著高于KO HFD組(F=26.88，P<0.01)，而WT RD組和KO RD組比較差異無顯著性(P>0.05)；WT HFD組空腹胰島素水平顯著高于WT RD組(F=25.30，P<0.01)，而KO HFD組和KO RD組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

3 討 論

Ghrelin和其主要受體GHS-R1a通過作用于胰島以及胰島素作用的外周組織和大腦參與糖代謝[20]，但其機制尚未完全闡明。SUN等[21]在ob/ob小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，敲除Ghrelin組小鼠血糖較對照組降低，葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌增多，同時外周組織的胰島素敏感性提高。但MA等[22]在ob/ob小鼠中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GHS-R敲除組小鼠胰島素水平更低，血糖更高，糖耐量異常的程度更重。與上述研究不同，本研究的雌性肥胖小鼠模型是由高脂飲食誘導(dǎo)的。本研究結(jié)果顯示，在高脂飲食下，KO小鼠的空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著低于WT小鼠，且IPGTT-AUC顯著低于WT小鼠；在普通飲食下，WT小鼠和KO小鼠的上述指標(biāo)未見明顯差異。提示GHS-R1a敲除可以抵抗高脂負荷引起的血糖升高，并增強胰島素敏感性。而ZIGMAN等[23]的研究并未在高脂飲食和雌性小鼠中比較血糖和胰島素水平，其結(jié)果僅顯示，普通飲食下雄性GHS-R敲除小鼠血糖和空腹胰島素水平較WT小鼠降低。

葡萄糖代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)可誘發(fā)胰島素分泌，而線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是β細胞ROS的負調(diào)控因子，Ghrelin的缺失降低了胰腺中UCP2 mRNA的表達，增強了葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌[24-26]。已有研究結(jié)果表明，Ghrelin通過調(diào)節(jié)胰腺UCP2表達和胰島素敏感性維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)[21]。MA等[22]在GHS-R敲除的ob/ob小鼠模型發(fā)現(xiàn)，GHS-R敲除損害了胰島細胞功能，而GHS-R的缺失上調(diào)了胰腺中陰性的細胞調(diào)節(jié)因子(如UCP-2、SREBP-1c、ChREBP和MIF-1)，下調(diào)了陽性的細胞調(diào)節(jié)因子(如HIF-1、FGF-21和PDX-1)。本研究結(jié)果提示，GHS-R敲除對肥胖導(dǎo)致的血糖升高有保護作用，并可以增加胰島素敏感性，其具體機制還有待進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)WT小鼠的15周齡較6周齡體質(zhì)量變化量顯著高于普通飲食WT小鼠，而高脂飲食喂養(yǎng)KO小鼠體質(zhì)量變化量與普通飲食KO小鼠比較差異無顯著性，提示GHS-R敲除可能可以改善高脂飲食引起的肥胖。在本研究中，普通飲食下KO小鼠和WT小鼠的腹內(nèi)脂肪質(zhì)量、腹內(nèi)脂肪比例均未見明顯差異，而高脂飲食下WT小鼠腹內(nèi)脂肪質(zhì)量、腹內(nèi)脂肪比例均顯著大于KO小鼠，提示GHS-R1a敲除可以抵抗高脂飲食負荷引起的脂肪增加。脂肪組織表達豐富的GHS-R1a，有研究表明，GHS-R敲除減少了白色脂肪組織中的葡萄糖和脂質(zhì)攝取，抑制了脂肪的生成，可改善肥胖[27-29]。但MA等[22]研究結(jié)果顯示，GHS-R敲除ob/ob小鼠與GHS-R未被敲除ob/ob小鼠相比，體質(zhì)量及體脂含量差異并無顯著性，提示瘦素對體質(zhì)量及脂肪的影響可能大于Ghrelin通過GHS-R介導(dǎo)的對體質(zhì)量及脂肪的影響。今后課題組將進一步探索在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠和ob/ob小鼠中Ghrelin對糖脂代謝的作用。RASINENI等[30]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇誘導(dǎo)的血清Ghrelin水平升高，可以促進脂肪釋放游離脂肪酸，抑制脂聯(lián)素并促進白細胞介素-6、趨化因子配體2等細胞因子的分泌，導(dǎo)致肝臟脂肪變性。本研究沒有顯示KO小鼠和WT小鼠在肝臟脂肪沉積程度上有差異。這可能與本研究小鼠數(shù)量較少有關(guān)，今后我們將增加小鼠數(shù)量，進一步探討在GHS-R1a敲除小鼠模型中高脂飲食對肝臟脂肪沉積的影響。

綜上所述，小鼠GHS-R1a敲除可以抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和腹部脂肪堆積，改善胰島素敏感性和糖耐量異常，這為針對Ghrelin/GHS-R1a通路治療肥胖和糖耐量異常提供了一定的理論依據(jù)。