鄭娟娟,刁瑋，田婷婷,王喆,王宏偉,李靜,

(青島大學,山東 青島 266071 1 醫(yī)學部醫(yī)學檢驗系； 2 附屬醫(yī)院檢驗科)

西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)最早由KREGER-VAN RIJ[1]在1965年報道，曾用名西弗念珠菌(Candidaciferrii)、類西弗念珠菌(Candidaallociferrii)和西弗毛滴蟲(Trichomonascusciferrii)，屬于子囊菌類酵母。子囊菌的形態(tài)特征差別很大，其共同特征是有性生殖形成子囊孢子，是一類非常少見的機會致病性真菌[2-3]。目前，國內(nèi)外在病人指甲、痰液、腦脊液、腹膜透析液、外耳道分泌物和血液標本中均有西弗射盾子囊霉的檢出報道，在貓耳分泌物、六堡茶中也有分離成功的報道[4-7]。青島大學附屬醫(yī)院近10年共檢出西弗射盾子囊霉8株。本文從臨床特點、形態(tài)學、培養(yǎng)特性及藥敏試驗結果等方面對8株西弗射盾子囊霉進行分析，以期為臨床少見病原菌感染檢出和用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2011年1月—2021年1月，青島大學附屬醫(yī)院共檢出西弗射盾子囊霉陽性病人8例。男性3例，女性5例；年齡35～64歲，其中年齡41～64歲者7例。2011—2015年檢出2例，2016—2021年檢出6例。標本來自血液內(nèi)科1例，耳鼻喉科6例，眼科1例；標本類型為血液1例，耳分泌物6例，眼分泌物1例。其中1例病人診斷為急性淋巴細胞白血病(M2型)，住院期間有反復發(fā)熱癥狀，血培養(yǎng)檢出西弗射盾子囊霉；1例病人因“左眼疼痛伴流淚、視物不清”就診，眼拭子培養(yǎng)出西弗射盾子囊霉；6例病人因“外耳流膿”入院，耳分泌物培養(yǎng)檢出西弗射盾子囊霉。8例病人均根據(jù)藥敏結果給予抗感染治療和對癥治療，出院3個月后隨訪，癥狀好轉(zhuǎn)，未見明顯并發(fā)癥。

1.2 試劑與儀器

所用MH平板(Mueller-Hinton agar plate)、血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板以及沙保弱培養(yǎng)基平板，VITEK 2 Compact梅里埃全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)及酵母菌鑒定卡(YST)，ATB Fungus 3真菌藥敏試劑條、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜VITEK MS、比濁儀DensiCHEK Plus，均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3 菌種鑒定與藥敏試驗

嚴格按照細菌培養(yǎng)標準化操作規(guī)程對送檢標本進行處理和常規(guī)培養(yǎng)，將標本分別接種于MH平板和血瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀態(tài)。取菌落涂片后進行革蘭染色顯微鏡檢，高倍鏡(1 000倍)下觀察。選單菌落轉(zhuǎn)種科瑪嘉顯色平板及沙保弱培養(yǎng)基平板，分別置35 ℃及28 ℃培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)，并涂片進行革蘭染色鏡檢。按操作規(guī)程配制2.0濁度的菌液，用VITEK 2 Compact配套酵母菌鑒定卡(YST)進行菌種鑒定，另外取菌涂布VITEK MS靶板進行質(zhì)譜儀鑒定；同時用ATB Fungus 3酵母菌藥敏測試條，對菌液進行體外藥敏試驗，按說明書操作。

2 結 果

2.1 菌落特征

菌落在MH平板、血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板、沙保弱培養(yǎng)基平板中均能生長，且在28 ℃和35 ℃條件下均生長良好。血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)24 h后可見表面光滑呈乳白色的圓形小菌落，在培養(yǎng)3 d后，菌落呈鑲嵌生長，質(zhì)地硬，不易研碎(圖1A)；沙保弱培養(yǎng)基平板28 ℃培養(yǎng)1周，菌落呈淡黃色，中心呈菜花狀，邊緣有粗糙褶皺的大菌落；科瑪嘉顯色平板培養(yǎng)24 h，可見圓形光滑藍色小菌落，延長培養(yǎng)時間，邊緣逐漸變白，呈現(xiàn)中心藍色、邊緣白色的“小蘑菇”狀，繼續(xù)培養(yǎng)，菌落開始變粗糙，邊緣不整并出現(xiàn)腦回狀溝槽(圖1B)。28 ℃條件下較35 ℃生長緩慢，菌落形態(tài)較小。

A：血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)3 d；B：科瑪嘉顯色平板35 ℃培養(yǎng)4 d。

2.2 革蘭染色檢查

菌落涂片革蘭染色鏡檢，可見革蘭陽性酵母樣孢子及細長菌絲，孢子為單細胞、卵圓形、沿菌絲排列生長(圖2A、B)。

A：血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)3 d；B：血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)5 d。1 000倍。

2.3 質(zhì)譜檢測

取血瓊脂平板上的單個菌落涂布于VITEK MS靶板上，加入0.5 μL甲酸，自然干燥后再加入1.0 μL基質(zhì)液(4-羥基-2-甲基肉桂酸)，自然干燥后采用VITEK MS儀進行該菌的蛋白指紋圖譜檢測，結果鑒定為西氟射盾子囊霉，置信度為99.9%。并重復實驗，重復鑒定符合率100%。

2.4 VITEK 2 Compact酵母菌鑒定卡(YST)鑒定

按儀器的標準操作規(guī)程操作和判定結果。取血瓊脂平板上的單個菌落配制2.0濁度的菌液，放入VITEK2 Compact酵母菌鑒定卡，然后置VITEK 2 Compact中，經(jīng)18～22 h鑒定結果為西氟射盾子囊霉，準確度99.9%。

2.5 藥敏試驗

按標準操作規(guī)程用ATB Fungus 3酵母菌藥敏測試條檢測8株菌對常見抗真菌藥物的敏感性，結果以最低抑菌濃度(MIC)表示，其藥物敏感率分別為伏立康唑(MIC≤1.0 mg/L)100%，兩性霉素B(MIC≤0.5 mg/L)86%，氟康唑(MIC≤64.0 mg/L)38%，5-氟胞嘧啶(MIC≤32.0 mg/L)43%，伊曲康唑(MIC≤2.0 mg/L)12%。

3 討 論

本文總結分析了青島大學附屬醫(yī)院近10年西弗射盾子囊霉的檢出情況，作為臨床罕見機會致病菌，其檢出率近年有增加趨勢。分析原因可能與以下幾點有關。①腫瘤、血液病等疾病發(fā)生率的增高和移植、抗生素、糖皮質(zhì)激素等治療手段的大量使用，損傷機體屏障和免疫力，使機會致病性真菌感染率明顯增加。從國內(nèi)外文獻報道可以看出，合并西弗射盾子囊霉感染的病人，其臨床病程長短不一，但在高齡、惡性腫瘤及服用免疫抑制劑等免疫力低下病人中檢出率更高[5,8-9]。②臨床對真菌感染的關注度增高，增加了樣品送檢，提高了檢出率。③實驗室真菌檢測技術手段的發(fā)展提高了檢出率。分析本研究中的6例慢性中耳炎病人，結合張繼東等[10]和賀文芳等[11]報道的病例，我們發(fā)現(xiàn)西弗射盾子囊霉相關慢性化膿性中耳炎主要臨床表現(xiàn)為外耳道奇癢，常搔刮至皮膚破損后方可解癢，以致出現(xiàn)耳道流膿，膿液呈黃色，稀薄略帶臭味，多伴耳鳴，治療不及時可導致鼓膜穿孔引起聽力下降。對于合并西弗射盾子囊霉感染的中耳炎，外科手術可取得比較理想的治療效果。

西弗射盾子囊霉在MH平板、血瓊脂平板和沙保弱培養(yǎng)基平板等臨床常用培養(yǎng)基上均可生長，且在28 ℃和35 ℃均生長較好。特征最明顯的是，該菌在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)中心藍色、邊緣白色的腦回狀菌落，易于觀察。根據(jù)菌落形態(tài)及對該菌鏡檢可以初步判斷病人為真菌感染，結合文獻報道西弗射盾子囊霉可同化利用大多數(shù)碳水化合物和氨基酸等的生化反應特性，可與其他真菌進行鑒別[12-13]。這有利于進一步的真菌鑒定和抗真菌藥物的藥敏試驗，為臨床治療爭取時間和提供藥敏依據(jù)。有條件的醫(yī)院還可以用現(xiàn)代分子檢測技術快速鑒別該真菌。

國外學者PFALLER等[14]的一項持續(xù)10年的關于念珠菌屬對氟康唑和伏立康唑藥物敏感性監(jiān)測的研究顯示，分離出的西弗射盾子囊霉對氟康唑的敏感率為50%，對伏立康唑的敏感率為50%。SOKI等[15]分離出對氟康唑耐藥的菌株。本文西弗射盾子囊霉的藥敏情況為，伏立康唑敏感率最高，其次是兩性霉素B，伊曲康唑敏感率最低。因此，臨床用藥時在排除用藥禁忌后，可優(yōu)先考慮伏立康唑，為臨床有效治療爭取時間。真菌耐藥機制主要為膜通透性降低使細胞內(nèi)藥物濃度降低，藥物作用靶酶增多、缺失或者結構改變以及細胞壁合成障礙等[16]。本研究中2015年檢出菌株對氟康唑敏感，2020年檢出菌株則出現(xiàn)耐藥，是否與培養(yǎng)過程有關或基因突變引起尚需深入研究。

總而言之，西弗射盾子囊霉是一種非常少見的機會致病性真菌，主要見于免疫力低下病人，在中青年及免疫力正常人群中偶見合并感染[17-18]。因此，對于就診病人，應詳細詢問病史、服藥史，對于發(fā)熱原因不明病人，應做分泌物培養(yǎng)、血培養(yǎng)甚至骨髓培養(yǎng)，必要時可聯(lián)系實驗室延長培養(yǎng)時間。另外，臨床實驗室應加強對該菌的認識，及時準確地分離鑒定該菌，并積極開展抗真菌藥物的敏感試驗，以便為臨床醫(yī)師早期合理選擇抗真菌藥物提供參考，從而有助于正確治療和有效控制真菌感染，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。