王 瑩，曾祥輝，黃 芳，黃大川，鄧 慧

（邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽(yáng) 422000）

0 引言

迷迭香（Rosmarinius officinalis L.）屬雙子葉植物綱、唇形科，原產(chǎn)歐洲地區(qū)和非洲北部地中海沿岸［1］，是一種天然、安全、無(wú)毒、耐高溫且高效的抗氧化劑，活性成分主要為鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸［2-3］，其彌補(bǔ)了BHA、BHT和TBHQ等人工抗氧化劑具有潛在毒性和副作用的缺陷［4］，成為食品、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一［5-6］。因此，優(yōu)化迷迭香中抗氧化劑的提取工藝與活性研究具有重要的意義。

迷迭香抗氧化成分的提取多采用溶劑提取法，一般是用乙醇作為有機(jī)溶劑在10:1的液料比（mL/g）下提取 2 h得到［7］。JACOTET 等［8］采用超聲波和微波法提取迷迭香中的抗氧化成分，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)利用超聲波來(lái)輔助提取能夠增加鼠尾草酸和熊果酸的提取率，該方法耗時(shí)短，但容易破壞提取物中的活性成分。本文采用乙醇浸提法，以一種最簡(jiǎn)單、盡量不破壞有效成分的提取方法對(duì)迷迭香抗氧化成分進(jìn)行工藝優(yōu)化提取，再對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性研究，進(jìn)一步為迷迭香研究提供理論參考。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試驗(yàn)材料

迷迭香陰干葉；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品、迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品（大連美侖生物有限公司，純度≥98%）；2，2-連氨基-雙-二銨鹽（ABTS，如吉生物科技，純度≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，如吉生物科技，純度≥97%）；無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、過(guò)硫酸鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵和三氯乙酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VELOCITY 14R型離心機(jī)（Dynamica Scientific Ltd.）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市中天儀器科技有限公司）；U3000型高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；UV-1780型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（SHIMADZU）；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 試驗(yàn)方法

稱取一定量的迷迭香粉末于錐形瓶中，按照單因素或者響應(yīng)面試驗(yàn)所設(shè)定的條件向瓶中加入一定濃度和液料比的乙醇溶液，在室溫下提取一定時(shí)間，離心抽濾后得迷迭香抗氧化成分提取液，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、冷凍干燥后得到迷迭香抗氧化成分粗提取物粉末。

2.1 單因素試驗(yàn)

設(shè)定乙醇濃度 60%，液料比 20：1（mL/g），浸提時(shí)間6天，其他條件固定，分別考察乙醇濃度（20%，40%，60%，80%，100%）、液料比［10：1，15：1，20：1，25：1，30：1（mL/g）］和浸提時(shí)間（2，4，6，8，10天）對(duì)迷迭香抗氧化成分得率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過(guò)上述單因素試驗(yàn)得出各自條件下最佳的乙醇濃度、液料比和浸提時(shí)間，對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與編碼水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素表Tab.1 Table of Box-Behnken test factors

3 測(cè)定方法

3.1 迷迭香抗氧化成分的測(cè)定

參照GB 1886.172—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 迷迭香提取物》，采用王瑩等［9］的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）測(cè)定迷迭香抗氧化成分（以鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸計(jì)）。

式中C1——試樣溶液中鼠尾草酸濃度，mg/mL；

C2——試樣溶液中鼠尾草酚濃度，mg/mL；

C3——試樣溶液中迷迭香酸濃度，mg/mL；

V——試樣溶液定容體積，mL；

M——試樣的質(zhì)量，mg。

3.2 ABTS自由基清除率測(cè)定

參考BKHAIRIA等［10］的方法，取2.0 mL不同濃度梯度樣品溶液，分別加入2.0 mL ABTS工作液，置于室溫避光反應(yīng)30 min，在734 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度值（ABS）的測(cè)定。

式中AS——樣品反應(yīng)組吸光度值；

AB——陰性對(duì)照組吸光度值；

A0——空白對(duì)照組吸光度值。

3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考慕鈺文等的方法［11-12］，取2.0 mL不同濃度梯度樣品溶液，分別加入2.0 mL DPPH工作液，置于室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度值的測(cè)定，計(jì)算如式（2）所示。

3.4 OH自由基清除率測(cè)定

參考DONG等［13］的方法，取1.0 mL不同濃度梯度樣品溶液，分別加入1.0 mL FeSO4溶液、1.0 mL水楊酸溶液和1.0 mL H2O2溶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，在510 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，計(jì)算如式（2）所示。

3.5 Fe3+還原力測(cè)定

參考黎克純等［14］的方法，取1.0 mL不同濃度梯度樣品溶液，分別依次加入2.5 mL磷酸二氫鈉溶液和鐵氰化鉀溶液，50 ℃水浴反應(yīng) 20 min；加入2.5 mL三氯乙酸溶液，離心處理10 min取上清液2.5 mL；加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 三氯化鐵溶液，置于室溫反應(yīng)10 min；在700 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度值的測(cè)定。

式中AS——樣品反應(yīng)組吸光度值；

A0——空白對(duì)照組吸光度值。

3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，通過(guò)Excel繪圖。

4 結(jié)果與分析

4.1 單因素試驗(yàn)

如圖1所示，隨著乙醇濃度的不斷增大，抗氧化成分得率逐漸上升；當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，抗氧化成分得率達(dá)到最大；之后隨著乙醇濃度的增大，抗氧化成分得率先呈現(xiàn)略微的下降趨勢(shì)，進(jìn)而大幅度的下降?？赡苁怯捎谝恍┤鯓O性物質(zhì)溶出量的增加，導(dǎo)致酚類物質(zhì)向乙醇溶劑擴(kuò)散速度減緩［15］。故乙醇濃度為60%時(shí)最佳。

圖1 各因素對(duì)迷迭香抗氧化成分得率的影響Fig.1 Effects of various factors on the yields of antioxidant components in rosemary

在乙醇濃度和浸提時(shí)間固定不變的情況下，隨著液料比的增大，迷迭香抗氧化成分得率先減小隨后逐漸增高；直到液料比為25 mL/g時(shí)，抗氧化成分得率達(dá)到最大值；之后呈現(xiàn)大幅度的下降趨勢(shì)。這是由于液料比增大，溶劑的滲透和有效成分的溶解進(jìn)行較快，達(dá)到一定的量后，較高的液料比會(huì)導(dǎo)致傳質(zhì)推動(dòng)力增加［16］，使得抗氧化成分得率下降。故液料比為25 mL/g時(shí)最佳。

在乙醇濃度和液料比固定不變的情況下，隨著浸提時(shí)間的增加，抗氧化成分得率呈現(xiàn)大幅上升的趨勢(shì)；直到浸提時(shí)間為4天時(shí)，抗氧化成分得率達(dá)到最大值；之后隨著浸提時(shí)間的增加，抗氧化成分的得率出現(xiàn)大幅度的下降；接著呈現(xiàn)略微的上升趨勢(shì)，趨于平緩。這可能是由于浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致酚類物質(zhì)易分解損耗［17］，得到的抗氧化成分反而減少，不利于提取。故浸提時(shí)間為4天時(shí)最佳。

4.2 Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)

4.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

乙醇濃度、液料比和浸提時(shí)間對(duì)迷迭香抗氧化成分得率的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.2 Design scheme of response surface test

對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析與模型的擬合，因變量與各自變量之間的關(guān)系可由如下二次多項(xiàng)式方程表示：

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗氧化成分得率的二次多項(xiàng)式模型方差分析Tab.3 Variance analysis of quadratic polynomial model for yields of antioxidant components

該回歸模型極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），決定系數(shù)R2=0.992 3，校正決定系數(shù)Adj-R2=0.982 4，可知模型具有很好的預(yù)測(cè)能力。A，B，BC，A2，B2，C2在此模型中的影響均為顯著（p＜0.05），根據(jù)F值的大小可以推斷，各因素的影響順序?yàn)橐掖紳舛龋疽毫媳龋窘釙r(shí)間。

4.2.2 兩因素間的交互作用分析

由表3可知，液料比與浸提時(shí)間的交互作用對(duì)抗氧化成分得率有顯著影響（p＜0.05）。由回歸方程得出的交互作用響應(yīng)面如圖2所示，乙醇濃度和液料比對(duì)抗氧化成分提取量的影響顯著，而浸提時(shí)間對(duì)抗氧化成分提取量的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖2 各自變量之間的交叉作用對(duì)迷迭香中抗氧化成分得率的影響Fig.2 The effect of the cross-action between the respective variables on the yields of antioxidant components in rosemary

4.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面法得到乙醇浸提法提取迷迭香抗氧化成分最佳工藝條件：乙醇濃度66.688%、液料比 25.839：1（mL/g）和浸提時(shí)間3.967天，在此條件下的抗氧化成分得率為5.584 %。根據(jù)實(shí)際操作略作調(diào)整，在乙醇濃度65%、液料比26：1（mL/g）和浸提時(shí)間4天條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得抗氧化成分得率為5.418%，與理論值十分接近。

4.3 迷迭香提取物的抗氧化活性

由圖3（a）可以看出，迷迭香粗提取物和VC對(duì)照組對(duì)ABTS自由基都具有較好的清除率。在一定范圍內(nèi)，增大粗提取物濃度可以明顯提高對(duì)ABTS自由基的清除率，在0.02 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基清除率為15.07%；當(dāng)濃度增大至0.20 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率也隨之增加到85.56%，在這個(gè)范圍內(nèi)增幅極顯著；在達(dá)到0.20 mg/mL后繼續(xù)增大粗提取物濃度，ABTS自由基清除率變化極小。經(jīng)數(shù)據(jù)處理得出，迷迭香粗提取物清除ABTS自由基的IC50值為0.081 mg/mL，VC對(duì)照組清除ABTS自由基的IC50值為 0.037 mg/mL，迷迭香抗氧化物質(zhì)清除ABTS自由基的能力稍弱于VC對(duì)照組，屬于抗氧化活性較強(qiáng)的一類物質(zhì)。

圖3 迷迭香提取物及對(duì)照品的抗氧化活性能力Fig.3 Antioxidant activity of rosemary extract and its reference substance

迷迭香粗提取物和VC對(duì)照組對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加一直穩(wěn)步上升，清除率由濃度為0.02 mg/mL的12.56%增長(zhǎng)至濃度為0.40 mg/mL時(shí)的56.11%，增幅明顯。通過(guò)比較可以看出，VC趨勢(shì)線遠(yuǎn)高于迷迭香粗提取物趨勢(shì)線，經(jīng)計(jì)算得出粗提取物清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度為0.280 mg/mL，VC對(duì)照組清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度為0.046 mg/mL，迷迭香粗提取物對(duì)DPPH 自由基具有較好的清除活性，但弱于VC對(duì)照組。

如圖3（b）所示，迷迭香粗提取物濃度為0.02 mg/mL時(shí)，OH自由基清除率僅只有3.27%；當(dāng)迷迭香粗提取物濃度增加至0.40 mg/mL時(shí)，清除率上升到47.44%。在迷迭香粗提取物濃度由0.20 mg/mL增加至0.40 mg/mL的過(guò)程中，OH自由基清除率無(wú)明顯變化。計(jì)算得出迷迭香粗提取物清除OH自由基的IC50值為0.360 mg/mL，VC對(duì)照組清除OH自由基的IC50值為0.049 mg/mL。由于迷迭香粗提取物中含有大量雜質(zhì)，在相同濃度下，VC對(duì)照組所表現(xiàn)出的對(duì)OH自由基的清除能力明顯強(qiáng)于迷迭香粗提取物。

對(duì)Fe3+還原力進(jìn)行測(cè)定實(shí)則是對(duì)樣品的供應(yīng)電子能力進(jìn)行檢測(cè)，吸光值越大，還原力越強(qiáng)。由圖可知，不同質(zhì)量濃度的迷迭香粗提取物和VC對(duì)照組均對(duì)Fe3+具有一定的還原能力。迷迭香粗提取液在濃度從0.02 mg/mL增加至0.40 mg/mL時(shí)，其ABS值從0.065增加至0.915，一直呈現(xiàn)上升狀態(tài)。雖然在相同質(zhì)量濃度下VC對(duì)照組對(duì)Fe3+的還原力比迷迭香粗提取物更強(qiáng)，但未經(jīng)純化和富集處理的迷迭香粗提取物仍舊呈現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)Fe3+還原力也不斷增大。

5 結(jié)語(yǔ)

本文建立乙醇浸提法提取迷迭香抗氧化成分的最佳工藝條件，在乙醇濃度65%、液料比26：1（mL/g）和浸提時(shí)間4天的條件下，測(cè)得抗氧化成分得率為5.418%，模型預(yù)測(cè)能力較好。在迷迭香粗提取物所測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ABTS、DPPH、OH自由基清除能力以及Fe3+還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，其中對(duì)ABTS、DPPH、OH自由基的 IC50值分別為 0.081，0.280，0.360 mg/mL。迷迭香粗提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。該研究可為迷迭香天然抗氧化成分的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。