機體中，L-蘋果酸參與蘋果酸天冬氨酸轉(zhuǎn)運過程，具有轉(zhuǎn)移還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型輔酶I(NADH)的作用

。此外,L-蘋果酸對機體有較多有益的生理功能，如運動過程中降低血清肌酸激酶水平，減少骼肌損傷

；減少脂質(zhì)過氧化增強機體抗氧化能力

；預(yù)防老年性癡呆等

。L-蘋果酸作為低熱量的酸味食品添加劑廣泛應(yīng)用于各類食品等的生產(chǎn)加工，可保持食品的口感和色澤

。秀麗隱桿線蟲作為一種實驗?zāi)Ｊ缴铮子谂囵B(yǎng)、遺傳操作簡單，通體透明便于觀察。更重要的是，哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的許多核心代謝通路在線蟲中相當保守，包括脂肪酸合成、延伸、去飽和和β-氧化，以及神經(jīng)肽、5 -羥色胺和胰島素信號通路等。本研究通過外源添加L-蘋果酸探索其在秀麗隱桿線蟲脂代謝過程中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-蘋果酸，上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、c-DNA合成試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；qPCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR Green，北京聚合美生物科技有限公司；尼羅紅、油紅染料，美國Sigma-Aldrich公司；

-6：GFP和

-7：GFP線蟲，由云南生物資源保護與利用國家重點實驗室饋贈。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司；酶標儀，美國BioTek儀器有限公司；PCR儀，德國Biometra公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；低溫高速離心機，美國貝克曼公司；震蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；旋渦混合器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司。

由表8可知隨著染色溫度的增加，棉條表觀深度K/S值提高，但溫度超過70℃以后，K/S值減小。這是由于溫度升高，染料加速擴散，上染速率提高，同時染料水解速率提高，但在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度提高，染料上染速率大于水解速率，但是當超過合適溫度時，染料的水解速率大于上染速率，所以上染率降低，棉條得色淺，因此選擇染色溫度70℃為宜。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng) 使用大腸桿菌OP50菌株作為食物源，將其均勻涂于線蟲生長的培養(yǎng)基(NGM)上。將同步化后的800～1 000條左右的L1的線蟲接種于涂布了OP50的NGM平板上，20 ℃培養(yǎng)2 d至產(chǎn)1～3顆卵的成蟲期備用。

1.3.7 qPCR分析 收集L4期線蟲，按寶生物工程(大連)有限公司的RNA提取試劑盒的步驟提取線蟲的總RNA，并測定其含量。按天根生化科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟來合成cDNA，反應(yīng)體系：SYBR green mix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH

O 10 μL，使用羅氏熒光定量PCR儀進行定量。我們以

-1為內(nèi)參基因，用2

計算基因轉(zhuǎn)錄水平差異，引物序列見附表。

1.3.3 油紅O(ORO)染色 500 mg ORO粉溶于100 mL異丙醇，制成母液避光密封保存?zhèn)溆?。使用前以去離子水按3∶2比例稀釋異丙醇油紅O母液，震蕩2 h使其充分溶解，用0.2 μm微孔濾膜過濾雜質(zhì)制備為工作液，錫箔紙包裹避光冰箱儲存?zhèn)溆?。以PBST(含0.01% Triton)將攜帶1～3個蟲卵的成蟲輕洗于1.5 mL離心管中，反復(fù)清洗3次至澄清狀態(tài)無菌。以560 g離心1 min去掉上清，留100 μL重懸，加入600 μL 40%異丙醇在室溫下震蕩孵育3 min，560 g離心1 min，去上清，留100 μL重懸。加入600 μL ORO工作液混勻，將樣品在室溫下避光旋轉(zhuǎn)孵育2 h，560 g 離心1 min，去上清留100 μL。加入600 μL PBST重懸，在避光條件下旋轉(zhuǎn)孵育30 min去除多余ORO染色劑，560 g離心1 min，留50 μL上清液。取15 μL線蟲懸浮液置于載玻片上，相同曝光時間進行白光拍照。實驗重復(fù)3次，每個組拍攝不少于20條。

3.2.5 避免生理鹽水沖洗氣管插管 生理鹽水滴注到氣管插管造成管壁生物膜沖入肺內(nèi)，易形成感染。研究認為，生理鹽水沖洗氣管插管沒有起到稀釋痰液的作用，反而使肺的氧合下降，血壓及心率增快，顱內(nèi)壓增高及發(fā)生VAP風(fēng)險增大［47］。

ECDSA是數(shù)字簽名算法（DSA）的其中一個例子。和非對稱加密算法（RSA）進行對比，在相同的安全強度下，ECDSA可以使用的密鑰更短，從而節(jié)省網(wǎng)絡(luò)和存儲空間，具有較高的研究價值[5]。

秀麗隱桿線蟲體脂主要儲存于腸上皮細胞和腸道中，ORO和NR染色法能客觀地展示秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪

。采用ORO染色、NR染色和TG含量測定3種方法對線蟲體內(nèi)脂肪進行分析。將同步化后500條左右L1線蟲分別加至含L-蘋果酸0、200、500、1 000 μg/mL的NGM平板，培養(yǎng)至攜帶1～3個蟲卵的成蟲，進行ORO染色和NR染色。其中NR染色表明，與對照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲脂肪顆粒數(shù)量減少(圖1A)；脂肪顆粒體積減小(圖1A)，由1.66 μm分別減小至1.43、1.17、1.05 μm(圖1C)(

<0.05)。ORO染色表明，與對照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲脂肪含量分別降至83.33%、87.67%、76.67%(圖1B、D)(

<0.05)。同時，根據(jù)TG含量的測量結(jié)果，與對照組(0 μg/mL)相比，200 、500 、1 000 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲TG含量分別降至0.49、0.61、0.82倍(圖1E)(

<0.05)。綜上所述，外源添加200、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲，脂肪顆粒的數(shù)量減少、體積減小，降低體內(nèi)脂肪含量。

1.3.2 脂肪酸測定 培養(yǎng)線蟲至產(chǎn)1～3顆卵的成蟲期，用單蒸水洗脫5～10個培養(yǎng)皿的線蟲至8 mL GC專用玻璃管中，置于冰上沉淀。單蒸水清洗2次，待蟲體沉淀后去除上清。液氮速凍保存于-80 ℃冰箱。加入1 mL酯化液，70 ℃水浴鍋酯化1～2 h，冷卻后加入1.5 mL雙蒸水和200 μL正己烷，劇烈震蕩。4 000 r/min離心2 min后分2層，上層有機相為酯化脂肪酸。取上層有機相80 μL置于GC玻璃瓶中(加入襯管)，上機檢測

。

外源添加L-蘋果酸降低了C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0的比值，硬脂酰輔酶a去飽和酶(SCD)是將棕櫚酸C16：0和硬脂酸C18：0分別轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸C16：1n-7和油酸C18：1n-9的關(guān)鍵酶

，接下來檢測L-蘋果酸對線蟲3個SCD基因

-5、

-6、

-7的影響。qPCR結(jié)果顯示，與對照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸飼養(yǎng)線蟲，

-5基因mRNA相對水平分別下調(diào)為0.71、0.59、0.46倍(

<0.05)(圖3)；

-6基因mRNA相對水平分別下調(diào)為0.79、0.64、0.57倍(

<0.05)(圖3)；

-7基因mRNA相對水平分別下調(diào)為0.84、0.69、0.63倍(

<0.05)(圖3)。此外，檢測了L-蘋果酸對SCD基因轉(zhuǎn)錄因子

-1的影響，與對照組(0 μg/mL)相比，200 、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸飼養(yǎng)線蟲

-1 基因mRNA相對水平分別下調(diào)為0.74、0.62、0.50倍(

<0.05)(圖3)，表明L-蘋果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1的表達，從而下調(diào)

-5、

-6和

-7基因的轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 外源添加L-蘋果酸可減少秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量

1.3.6 FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光強度觀察 將同步化后孵化的

-6：GFP、

-7：GFP L1線蟲轉(zhuǎn)移至含L-蘋果酸0、200、500、1 000 μg/mL 的NGM培養(yǎng)皿中，在標準條件下培養(yǎng)至攜帶1～3個蟲卵的成蟲。M9洗下后吸取15 μL制片，在熒光顯微鏡下使用FITC/GFP通道觀察。

2.2 外源添加L-蘋果酸對脂肪酸含量的影響

將同步化后500條左右L1線蟲分別加至含L-蘋果酸0、200、500 μg/mL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)線蟲至攜帶1-3個蟲卵的成蟲，分別收集5-10個培養(yǎng)皿的線蟲測定各類脂肪酸含量。與對照組(0 μg/mL)相比，200 μg/mL L-蘋果酸飼養(yǎng)線蟲后，脂肪酸含量C15 iso由3.42%降至2.8%、C17 iso由5.5%降至4.29%、C20：5n-3由17.00%降至9.77%(

<0.05)，脂肪酸含量C16：0由3.4%增至4%、C17 Δ由6.13%增至7.23%、C19 Δ含量由8.10%增至8.59%(

<0.05)，脂肪酸含量C14：0由0.95%變?yōu)?.92%、C16：1n-7由3.47%變?yōu)?.44%、C17：0由1.24%變?yōu)?.45%、C18：0由5.56%變?yōu)?.94%、C18：1n-9由2.66%變?yōu)?.00%、C18：1n-7由25.96%變?yōu)?0.23%、C18：2n-6由5.34%變?yōu)?.35%、C18：3n-6由1.88%變?yōu)?.02%、C20：3n-6由3.17%變?yōu)?.12%、C20：4n-6由1.64%變?yōu)?.62%、C20：4n-3由4.44%變?yōu)?.20%，含量無明顯變化(

>0.05)(圖2)。500 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲后，C15 iso由3.42%降至2.40%、C16：1n-7由3.48%降至2.28%、C17 iso由5.50%降至3.83%、C18：2n-6由5.35%降至4.62%、C18：1n-9由2.66%降至1.53%、C20：4n-6由1.62%降至1.15%、C20：4n-3由4.44%降至3.81%、C20：5n-3由17.00%降至13.55%(

<0.05)，脂肪酸C17 Δ由6.13%增至11.85%、C18：0由5.67%增至6.37%、C19 Δ由8.10%增至9.83%(

<0.05)，脂肪酸C14：0由0.95%變?yōu)?.94%、C16：0由3.40%變?yōu)?.50%、C17：0由1.24%變?yōu)?.51%、C18：1n-7由25.96%變?yōu)?8.51%、C18：3n-6由1.88%變?yōu)?.05%、C20：3n-6由3.17%變?yōu)?.88%，含量無明顯變化(

>0.05)(圖2A-C)。此外，與對照組(0 μg/mL)相比，200、500 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲后C16：1n-7/C16：0由1.02降至0.86和0.65(

<0.05)(圖2D)；C18：1n-9/C18：0的比例由0.47變?yōu)?.50(

>0.05)和0.24(

<0.05)，C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低。脂肪中的單不飽和脂肪酸棕櫚油酸C16：1n-7和油酸C18：1n-9是生物合成甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等的重要底物。C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低，表明L-蘋果酸抑制了硬脂酸C18：0向油酸C18：1n-9的轉(zhuǎn)化，同時抑制了棕櫚酸C16：0向棕櫚油酸C16：1n-9的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲脂肪儲存減少。

(1)徹底性與相當性相結(jié)合的原則。非法集資犯罪涉案財物的處置首先應(yīng)遵循徹底性原則，使被追繳的涉案財物數(shù)量最大化。同時，應(yīng)綜合考慮涉案財物的利用方式、使用頻度、價值大小、與非法集資行為的關(guān)聯(lián)程度等因素，兼顧集資人、被集資人、利害關(guān)系人、國家等各方利益，防止涉案財產(chǎn)處置的范圍被不當擴大。

2.3 外源添加L-蘋果酸對線蟲脂代謝通路基因表達的影響

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及分析 使用GraphPad 8.4.0版本軟件對數(shù)據(jù)進行作圖和統(tǒng)計學(xué)分析，

檢驗進行兩兩比較，單因素方差分析進行組間比較，以

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.5 甘油三酯檢測 用PBS緩沖液將攜帶1～3個蟲卵的成蟲從生長板上洗下，收集于無菌的1.5 mL EP管中，清洗至肉眼無菌。超聲細胞破碎儀對線蟲進行破碎勻漿處理(冰水浴、超聲功率150 W、時間3 min)，破碎勻漿后以2 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的EP管中待測。按照甘油三酯檢測試劑盒說明，使用96孔板進行檢測，在空白孔里加入10 μL蒸餾水和1 000 μL的工作液，標準孔里加入校準品10 μL和1 000 μL工作液，各個樣本孔中加入樣本10 μL和1 000 μL工作液，混勻后在37 ℃避光孵育10 min，酶標儀，波長510 nm，測定各孔OD值。每個組平行測定3次，取OD值得均值計算甘油三酯的含量。同時以BCA法測定各組樣本蛋白的濃度。

1.3.4 尼羅紅(NR)染色 100 mg NR粉溶于200 mL丙酮，避光攪拌2 h，-20 ℃冰箱密封儲存?zhèn)溆?。使用前? μL儲備液溶于1 mL 40%異丙醇中制備為工作液。PBST(含0.01% Triton)將攜帶1～3個蟲卵的成蟲輕洗于1.5 mL離心管中，反復(fù)清洗3次至肉眼澄清無菌，以560 g離心1 min去除上清液。加入100 μL 40%異丙醇，并在室溫下震蕩孵育3 min，再以560 g離心1 min，去上清。加入600 μL的尼羅紅工作液混勻，室溫下避光旋轉(zhuǎn)孵育2 h。560 g離心1 min去上清，加入600 μL PBST進行重懸，避光旋轉(zhuǎn)孵育30 min以去除多余NR染色劑，560 g離心1 min，留50 μL上清液重懸。取15 μL線蟲懸浮液置于載玻片上，使用FITC/GFP通道，相同曝光時間進行成像。實驗重復(fù)3次，每個組拍攝不少于20條。

世界腕表不僅得到精英階層們爭相追捧，也深受各國政要們的喜愛。日內(nèi)瓦人民更是以世界時表作為禮物，饋贈予那些在第二次世界大戰(zhàn)中為和平而戰(zhàn)的軍事領(lǐng)袖。這些藝術(shù)與科學(xué)融合的作品，得到了領(lǐng)導(dǎo)人們極高的贊譽。

2.4 外源添加L-蘋果酸fat-6：GFP、fat-7：GFP線蟲熒光強度的影響

確定L-蘋果酸降低

-5、

-6、

-7、

-1 mRNAs后，進一步檢測

-6：GFP、

-7：GFP線蟲熒光強度變化。與對照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋果酸喂養(yǎng)線蟲，

-6：GFP、

-7：GFP熒光強度減弱(圖4A、4B)，

-6：GFP熒光強度分別下降為對照組的0.68、0.58和0.36倍(

<0.05)(圖4C)，

-7：GFP熒光強度分別下降為對照組的0.75、0.38和0.28倍(

<0.05)(圖4D)。進一步證實L-蘋果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1表達，進而降低fat-5、fat-6、fat-7蛋白表達，抑制硬脂酸C18：0向油酸C18：1n-9的轉(zhuǎn)化，同時抑制了棕櫚酸C16：0向棕櫚油酸C16：1n-7的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲脂肪儲存的減少。

3 結(jié)論

線蟲基因組共包含3個SCD基因

-5、

-6和

-7

，其中

-5主要將棕櫚酸(C16：0)轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(C16：1n-7)，而

-6和

-7均將硬脂酸(C18：0)轉(zhuǎn)化為油酸(C18：1n-9)

。

-1編碼了秀麗隱桿線蟲的哺乳動物SREBP同源基因，SREBP是脂肪酸、膽固醇和其他脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子

。在線蟲中，

-49與PPAR

和

-1(SREBP的同源基因)序列相似調(diào)控SCD基因

-5、

-6和

-7的表達。

-1的突變導(dǎo)致油酸(C18：1n-9)與硬脂酸(C18：0)的比例下降

。研究發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪和甘油三酯，使得脂肪酸含量發(fā)生變化，C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低。其機制為L-蘋果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1表達，進而降低

-5、

-6、

-7基因表達，抑制硬脂酸、棕櫚酸向油酸和棕櫚油酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲脂肪儲存的減少。

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