陳 婷，錢博文，唐 樑，黃玉宇，沈夕坤，成旭東

(南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 藥學部，江蘇 蘇州 215009)

益胃湯源自《溫病條辨》[1]，由沙參、玉竹、地黃、麥冬4 味中藥組成，主治陽明溫病，適用胃陰損傷證?，F(xiàn)代研究表明，益胃湯對慢性萎縮性胃炎[2]、消化性潰瘍[3-4]、脾胃虛弱[5]、糖尿病[6]等有顯著的臨床療效。標準湯劑[7]系遵循中醫(yī)藥理論，經(jīng)規(guī)范化煎煮，適用固-液分離技術(shù)后適當濃縮制得的一類湯劑，可以用作標準參照物來對其它劑型與臨床湯劑的一致性進行評價。但傳統(tǒng)湯劑有不便攜帶、不耐貯存、口感差等缺點，為了解決傳統(tǒng)湯劑的固有缺點，中藥配方顆粒應運而生。中藥配方顆粒是將飲片經(jīng)過一定加工步驟后制得的一種單味藥材新劑型，與臨床常見的經(jīng)典湯劑相比，具有調(diào)劑使用攜帶方便、便于辨證施治、靈活組方的特點，發(fā)展二十多年來越來越受到臨床醫(yī)患認可。但自二十世紀九十年代我國開始研究配方顆粒以來，學界對此的爭議就從未停止，其重點就在于分煎后合并的中藥配方顆粒與合煎的傳統(tǒng)湯劑在藥效物質(zhì)基礎和臨床療效上是否一致[7]。截至目前，未有文獻對益胃湯標準湯劑與配方顆粒一致性進行評估，本研究希望借助HPLC 指紋圖譜相似度，結(jié)合聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析[8-9]，比較配方顆粒及標準湯劑中化學成分的差異，以期為其生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；KDC-140HR 型超速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Milli-Q Synthesis108 型超純水儀（美國密理博公司）；KQ-100VDE 型超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；AG285 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑與藥物

毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201713，純度：98.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck 公司），磷酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材及顆粒

中藥飲片共4 味藥，各3 批，南沙參（批號：2019100501、2019090941、20190601），玉竹（批號：19111066-1、19111066-2、19111066-3），地黃（批號：19302、191111、191101），麥冬（批號：20031037-1、20031037-2、20031037-3）。配方顆粒得率與飲片一一對應，南沙參配方顆粒得率分別為49.78%、44.53%、43.41%（批號：1912222、1912223、1912224），玉竹得率均為83.80%（批號：1912113、1912114、1912115），地黃得率分別為69.33%、57.33%、62.67%（批號：1912204、1912205、1912206），麥冬得率均為90.00%（批號：2003110、2003111、2003112），以上飲片與配方顆粒均由江陰天江藥業(yè)提供。隨機組合平行制備標準湯劑10 批，記為S1-S10，相對應的配方顆粒，記為P1-P10。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫（0 ～ 12 min，3%→10%A；12 ～ 45 min，10%→25%A ；45 ～ 58 min，25%→80%A，58 ～60 min，80%→1%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：334 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 標準湯劑制備 將各單味藥隨機組合成共10 批組方，按益胃湯處方量（南沙參9 g，麥冬15 g，生地15 g，玉竹4.5 g） 稱取藥材43.5 g，加10 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后改用文火，煎煮30 min，濾過，剩余藥渣加8 倍量水，煎煮15 min，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，得標準湯劑。

2.2.2 配方顆粒湯劑的制備 分別稱取與飲片批號相對應的10 批配方顆粒組方，根據(jù)各味藥材配方顆粒的得率，分別稱取相應重量的配方顆粒，加適量溫水溶解至無明顯殘渣，定容至100 mL 容量瓶，得配方顆粒湯劑。

2.2.3 單味藥材湯劑的制備 按照各單味藥所占比例，分別稱取南沙參、麥冬、生地、玉竹，按照“2.2.1”項下方法制備，得單味藥材湯劑。

2.2.4 共煎配方顆粒湯劑的制備 根據(jù)各味藥材配方顆粒的得率，分別稱取3 批相應質(zhì)量的配方顆粒，加入500 mL 蒸餾水，文火煎煮30 min，定容至100 mL 容量瓶。

2.3 供試品溶液的制備

依次精密吸取標準湯劑、配方顆粒湯劑、共煎配方顆粒湯劑、單味藥材湯劑各5 mL 于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲處理（180 W，45 kHz，20 ℃）15 min，補足失重，以10 000 r/min 離心5 min，取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。標準湯劑供試品溶液記為S1-S10，配方顆粒供試品溶液記為P1-P10，共煎配方顆粒供試品溶液記為G1-G3，單味藥材湯劑供試品溶液分別為地黃、玉竹、沙參、麥冬藥材供試品溶液。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，加入甲醇超聲溶解，并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為16.4 μg/mL的對照品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖。以毛蕊花糖苷為參照峰，計算得共有峰相對保留時間的RSD 值小于0.55%，相對峰面積的RSD值小于3.12%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面積RSD 為0.78%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 稱取同一批次樣品6 份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以毛蕊花糖苷為參照峰，計算得共有峰相對保留時間的RSD 值小于0.43%，相對峰面積的RSD 值小于3.11%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面積的RSD 為0.97%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液S1，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖。以毛蕊花糖苷為參照峰，計算得共有峰相對保留時間的RSD 值小于0.43%，相對峰面積的RSD 值小于4.11%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面積的RSD 為1.27%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液（1、2、4、6、8 和10 mL），加甲醇稀釋配制成6 個系列濃度的毛蕊花糖苷對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以毛蕊花糖苷對照品濃度X（μg/mL）及峰面積Y進行線性回歸，繪制得標準曲線Y= 15.947X+ 7.623 1，r= 0.999 5，表明毛蕊花糖苷在1.64 ～ 16.4 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密量取6 份已測含量的同一批益胃湯標準湯劑溶液（S1）2.5 mL，精密加入毛蕊花糖苷（34.7 μg/mL）標準品1 mL，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算毛蕊花糖苷的平均加樣回收率為99.01%，RSD 為1.71%。

2.6 益胃湯指紋圖譜的建立及共有峰的確定

2.6.1 樣品測定與指紋圖譜的建立 按“2.1”項下色譜條件，分別測定S1-S10、P1-P10、G1-G3 和對照品溶液，并記錄色譜圖。將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”分析，分別以S1、P1、G1 為參照峰，時間窗為0.1 min，多點校正法自動匹配分析，Mark 峰匹配，用中位數(shù)法自動生成標準湯劑、配方顆粒及共煎配方顆粒的色譜疊加圖及相對應的對照圖譜，見圖1-3。

圖1 10 批益胃湯標準湯劑的指紋圖譜與對照圖譜Fig. 1 Fingerprint and control atlas R of 10 batches of Yiweitang standard decoction

圖2 10 批益胃湯配方顆粒的指紋圖譜與對照圖譜Fig. 2 Fingerprint and control atlas R of 10 batches of Yiweitang formula granule

圖3 3 批益胃湯共煎配方顆粒的指紋圖譜與對照圖譜Fig. 3 Fingerprint and control atlas R of 3 batches of Yiweitang co-decocted formula granule

2.6.2 相關(guān)性研究 通過與對照品比對，指認15號峰為毛蕊花糖苷，因其峰面積較大，出峰時間適中，分離度良好，故以此為參照峰，見圖4。10 批標準湯劑S1-S10 具有15 個特征峰，10 批配方顆粒P1-P10 有20 個特征峰，3 批共煎配方顆粒湯劑中也存在20 個特征峰，共煎后對成分的變化影響不大。在10 批標準湯劑中，均未檢測出2、4 號峰，部分批次可檢測出5、7、9 號峰，可能在高溫過程中會發(fā)生成分間絡合、吸附、沉淀、分解等，引起成分溶出量的減少[10]。經(jīng)相似度評價軟件計算，S1-S10 的相似度為0.952 ～ 0.989，P1-P10 的相似度為0.981 ～0.990，說明標準湯劑組、配方顆粒組及共煎顆粒組的組間相似性較高。將標準湯劑的對照圖譜、P1-P10 及G1-G3 導入相似度評價軟件進行比較，經(jīng)計算，P1-P10、G1-G3 與標準湯劑的共有模式的相似度為0.962 ～ 0.996。傳統(tǒng)的相似度評價表明配方顆粒和湯劑相似度良好，無法找出差異信息，具有局限性，因此本研究希望通過結(jié)合化學模式識別方法，全面評價益胃湯標準湯劑和配方顆粒的差異性。

圖4 標準湯劑、配方顆粒劑、共煎顆粒劑共有模式及標準品HPLC 色譜圖Fig. 4 HPLC of standard decoction, formula granule, co-decocted formula granule and reference

2.6.3 特征峰的歸屬 分別吸取單味藥、配方顆粒供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件，獲得相應的色譜圖，通過比較光譜吸收與保留時間，對指紋圖譜中的20 個特征峰進行歸屬。結(jié)果特征峰數(shù)量最多的藥材是地黃：1、3、11、13、14、15、16、17、18、19、20 號峰均為地黃特征峰；排名第二的是沙參：2、3、4、5、7、9、12、14、17 號峰均為沙參特征峰，其次是麥冬和玉竹，20 個特征峰均為處方中各藥材的峰，具體見圖5 及表1。與標準湯劑的色譜峰相比，共煎湯劑可能會引起沙參、玉竹部分成分的降解或轉(zhuǎn)化。

表1 各峰歸屬情況Tab. 1 Attribution of peaks

圖5 單味藥及配方顆粒供試品溶液HPLC 色譜圖Fig. 5 HPLC of test solution of single Chinese medicine and formula granules

2.6.4 毛蕊花糖苷含量的比較 運用t檢驗評價益胃湯標準湯劑和配方顆粒中毛蕊花糖苷的含量差異。S1-S10 中毛蕊花糖苷平均含量為16.61 μg/mL，P1-P10 中毛蕊花糖苷平均含量為13.72 μg/mL，S1-S10 與P1-P10 比較有差異（P＜ 0.05），且S1-S10的毛蕊花糖苷含量更高，說明復方煎煮過程中，因各成分之間會相互增溶，可能會導致毛蕊花糖苷的溶出度增加。

2.7 化學模式識別分析

2.7.1 聚 類 分 析（CA） 以S1-S10、P1-P10 及G1-G3 共計23 批樣品的共有峰峰面積為變量，標準化處理后進行聚類熱圖分析，見圖6，每一行代表一個樣本，每一列代表一個特征峰。總體來看，縱向樣品聚類可將23 批樣品分為2 類，標準湯劑S1-S10聚為一類，配方顆粒P1-P10 及G1-G3 聚為一類；橫向特征峰聚類顯示15、11、13 號峰峰面積相對較高。聚類熱圖能有效區(qū)分益胃湯標準湯劑與配方顆粒。

圖6 聚類熱圖Fig. 6 Clustering heat map

2.7.2 主成分分析（PCA） PCA 將復雜數(shù)據(jù)降維分析，直觀呈現(xiàn)數(shù)據(jù)間的分類信息，在中藥質(zhì)量評價中被廣泛地運用[11]。為綜合評價益胃湯配方顆粒與標準湯劑的差異及引起差異的物質(zhì)基礎成分，將S1-S10 和P1-P10、G1-G3 的共有峰面積標準化后，采用SIMCA（Version14.1）軟件進行PCA 分析。從20 個變量中提取出5 個變量，累計方差貢獻值為84.575%，見表2。根據(jù)主成分載荷矩陣，推測多個成分都會對益胃湯標準湯劑和配方顆粒差異性產(chǎn)生影響，見表3。色譜峰2、3、5、6、17 在主成分1 中的權(quán)重較大，15、18 號峰在主成分2 中貢獻值較大。提取前2 個主成分做PCA 得分圖，見圖7，可知23批供試品可被分為2 大類，其中，S1-S10 分布在第2、3 象限且較為分散，而P1-P10、G1-G3 均分布在第1、4 象限，且較為集中。結(jié)果表明，共煎配方顆粒組與配方顆粒組無差別，與標準湯劑組差別較大。

圖7 PCA 得分圖Fig. 7 PCA score chart

表2 特征值與方差貢獻率Tab. 2 Feature value and variance contribution rate

表3 載荷矩陣Tab. 3 Load matrix table

2.7.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA） 為進一步分析標準湯劑和配方顆粒間的差異性，采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進行有監(jiān)督的分析[11]。關(guān)鍵參數(shù)R2X= 0.533，R2Y= 0.709，Q2= 0.637，均大于0.5，說明預測模型有較強的預測及擬合能力，見圖8。由OPLS-DA 圖可知23 批樣本被顯著分為2 類，與PCA 的結(jié)果一致，見圖9。各變量以變量投影重要度（VIP）大小進行排序，見圖10。以VIP ＞1 為標準，確認2、5、3、4、6、17、10、12 號峰為區(qū)分益胃湯標準湯劑與配方顆粒的標志性成分，對分類結(jié)果有顯著影響，各成分有待采用LC-MS 等技術(shù)明確具體的化學成分。

圖8 模型驗證圖Fig. 8 Model verification diagram

圖9 OPLS-DA 得分圖Fig. 9 OPLS-DA score chart

圖10 VIP 值Fig. 10 VIP value

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本方法考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-0.05%甲酸水等流動相系統(tǒng)，并根據(jù)組方藥材的主要化學成分設定了334、254、280、203、265、245、270 nm，7 個波長進行篩選檢測，結(jié)果表明在乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫條件下，以334 nm 作為檢測波長，基線穩(wěn)定，色譜峰數(shù)量多、峰形好、分離度高，能夠滿足指紋圖譜對色譜峰的要求。

3.2 標準湯劑與配方顆粒差異性分析

本研究建立了益胃湯標準湯劑和配方顆粒的指紋圖譜，利用“整體性”及“模糊性”特點，全面反映內(nèi)在化學特征。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件比較S1-S10、P1-P10及G1-G3 指紋圖譜，P1-P10 與G1-G3 在特征峰的種類、數(shù)目及含量上差別不大，標準湯劑S1-S10 與配方顆粒相比未檢測出2、4 號峰，部分樣品缺5、7、9 號峰。標準湯劑組的組內(nèi)相似度相對較低，說明各批次標準湯劑的差異較大，可能與藥材本身質(zhì)量及煎煮工藝不穩(wěn)定有關(guān)。配方顆粒組與標準湯劑組相比，組內(nèi)相似度明顯上升，說明配方顆粒的制劑方法良好，制劑工藝穩(wěn)定，質(zhì)量較為穩(wěn)定。益胃湯標準湯劑組與配方顆粒組相似度較高，因此為了尋找差異性信息，本研究結(jié)合CA、PCA 及OPLS-DA，全面評價配方顆粒及湯劑。CA、PCA 及OPLS-DA 能顯著地將二者區(qū)分開來，結(jié)合2、5、3、4、6、17、10、12號峰的VIP 值大于1，說明這8 種成分為標準湯劑和配方顆粒的主要差異性成分。

4 結(jié)論

本研究建立了益胃湯HPLC 指紋圖譜，通過相似度評價與化學模式識別方法，對二者指紋圖譜的有效信息進行充分提取及分析，全面評價標準湯劑與配方顆粒的差異，為配方顆粒生產(chǎn)工藝優(yōu)化及質(zhì)量監(jiān)督工作提供參考。但本研究僅從體外化學成分層面對兩者進行比較太過局限，因此課題組后期將從入血成分及相應的藥效學層面深入探討，以獲取標準湯劑與配方顆粒的差異規(guī)律。