王 芳，李 峰

（西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院 藥學(xué)部，陜西 西安 710010）

自2019 年12 月份以來，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）已波及210 多個國家和地區(qū)，影響70多億人口。此病傳染性強(qiáng)、傳播速度快，屬我國中醫(yī)“瘟疫”“疫病”范疇，病因為感受“疫戾”之氣。輕度患者會出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難、呼吸窘迫綜合征或膿毒癥休克等癥[1]。防疫期間，國家衛(wèi)生健康委員會及國家中醫(yī)藥管理局印發(fā)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》從試行第三版到第八版中都將中醫(yī)治療法納入其中[2]。已有治療結(jié)果表明，相比于西醫(yī)治療組，中醫(yī)治療組在治療COVID-19 上有顯著療效，尤其在普通型轉(zhuǎn)重型及危重型發(fā)生率和死亡率指標(biāo)的對比上優(yōu)越性明顯[3-4]，進(jìn)而證明了中醫(yī)藥在防疫中發(fā)揮了重要作用。

二妙方是中國古代經(jīng)典的一種中草藥配方，載于元代醫(yī)家朱丹溪的《丹溪心法》，并記錄在《中國藥典》之中，它是由黃柏和蒼術(shù)組成的清熱祛濕劑[5]。黃柏、蒼術(shù)的配伍使用是臨床上的常用藥對[6]，是治療濕熱下注的基礎(chǔ)方。黃柏味苦、性寒，寒以清熱，苦以燥濕。蒼術(shù)味苦、性溫，燥濕健脾。中醫(yī)診斷COVID-19 主要以濕毒郁肺、疫毒閉肺及濕熱蘊(yùn)毒為主，由此設(shè)想二妙方是否對COVID-19 有效?因此對其化學(xué)成分及作用機(jī)制展開研究。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥研究提供了新的思路，從分子水平上對藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全方位的探索和預(yù)測，從理論上解決了中藥成分復(fù)雜難以切入研究的根本問題[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)理論的整體觀念、辨證論治相一致[8]。

因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探索二妙方對治療COVID-19 的潛在作用機(jī)制，為二妙方進(jìn)一步臨床應(yīng)用于COVID-19 提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 二妙方活性成分的篩選

本研究借助TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分別檢索關(guān)鍵詞“黃柏”“蒼術(shù)”，經(jīng)過設(shè)置OB ≥30%且DL ≥0.18 進(jìn)行篩選[9]，得到黃柏、蒼術(shù)的生物活性成分。

1.2 二妙方活性成分作用靶點的收集

通過Pubchem Cid 獲得Canonical SMILES 結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)化學(xué)式輸入到SwissTargetPrediction 靶點預(yù)測平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/），獲得每一活性成分的潛在作用靶點。

1.3 二妙方抗COVID-19 相關(guān)靶點收集

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）對COVID-19 相關(guān)靶點進(jìn)行收集，將收集到的疾病靶點與“1.2”項下獲得的成分作用靶點取交集，最終獲得二妙方抗COVID-19 的相關(guān)作用靶點。

1.4 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將收集到的上述各類靶點導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù) 庫（https://string-db.org/）， 物 種 選 擇“Homo sapiens”，獲得靶蛋白互作數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點的通路分析

為了更深入地了解上述篩選得到的靶點蛋白基因的功能及在信號通路中的作用，將篩選到的靶點導(dǎo) 入DAVID 數(shù) 據(jù) 庫（https://david.ncifcrf.gov/），限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱（OFFICIAL_GENE_SYMBOL），進(jìn)行GO 和KEGG通路富集分析，并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.6 分子對接預(yù)測

從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載黃柏和蒼術(shù)的所有化合物結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載ACE2 受體和3CLpro 的三維結(jié)構(gòu)。活性成分和蛋白結(jié)構(gòu)通過Pymol和AutoDockTools 進(jìn)行修飾[10]。結(jié)合能可用于評價化合物與目標(biāo)物的結(jié)合程度。結(jié)合能小于-5 kJ/mol，表明目標(biāo)物與組分具有一定的結(jié)合活性[11]。

2 結(jié)果

2.1 二妙方活性成分的篩選結(jié)果

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“黃柏”“蒼術(shù)”分別獲得140 和49 個化學(xué)成分。采用了OB ≥30%和DL ≥0.18 作為活性成分的篩選條件，結(jié)果見表1。

表1 黃柏和蒼術(shù)的46 個活性成分Tab.1 46 active components of Huangbo and Cangzhu

2.2 二妙方抗COVID-19相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫活性成分的Pubchem Cid 查詢相關(guān)的潛在靶點，共有517 個。從Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選得到259 個COVID-19 疾病靶點，與517 個成分靶點取交集，得到39 個重合靶點，即為黃柏-蒼術(shù)治療新型冠狀病毒肺炎的相關(guān)靶點，主要靶點如MAPK1、MAPK3、EGFR、CXCL8、CASP3、MAPK8、JAK1、MAPK14、BCL2L1 等，見圖1。

圖1 二妙方治療新型冠狀病毒肺炎的靶點圖Fig. 1 An interactive network of pathogenic targets of COVID-19 and putative targets of Ermiao Fang

2.3 GO 與KEGG 富集分析結(jié)果

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進(jìn)行GO 分析，共富集69 個生物學(xué)過程和功能（P＜ 0.05），其中包括生物過程（BP）45 個，細(xì)胞成分（CC）8 個，分子功能（MF）16 個，根據(jù)-Log10（P）校正后進(jìn)行排序，各類前10 的通路見圖2。

圖2 39 個潛在作用靶點的GO 功能富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of the 39 targets of Ermiao Fangtreating COVID-19

通過KEGG 通路分析得到98 個（P＜ 0.05）包含52 個疾病通路和46 個信號通路，其中，與肺損傷、病毒感染相關(guān)的疾病通路有10 個，包括：Non-small cell lung cancer、Small cell lung cancer、Hepatitis B、Hepatitis C、Viral carcinogenesis、Influenza A、Epstein-Barr virus infection、HTLV-I infection、Tuberculosis、Herpes simplex infection。 信 號 通 路中已報道與肺炎相關(guān)的信號通路有HIF-1 signaling pathway[12]、Toll-like receptor signaling pathway[13]、T cell receptor signaling pathway[14]、TNF signaling pathway[15]、ErbB signaling pathway[16]等。排名前20的通路見圖3。其中，關(guān)鍵靶點富集較多的是TNF信號通路（圖4A）和ErbB 信號通路（圖4B）。眾所周知這兩條通路對炎癥免疫的影響很大，提示了黃柏-蒼術(shù)可能通過抗炎作用治療COVID-19。

圖3 39 個潛在作用靶點的KEGG 通路富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of the 39 targets of Ermiao Fang treating COVID-19

圖4 TNF 信號通路和ErbB 信號通路Fig. 4 TNF and ErbB pathway

2.4 分子對接預(yù)測

通過模擬槲皮素和漢黃芩素這兩種有效成分分別與新冠病毒潛在藥物靶點ACE2（PDB ID: 1r42）和3CLpro （PDB ID: 6lu7）對接。如圖5 所示，槲皮素對ACE2 （結(jié)合能為-8.1kJ/mol）和3CLpro （結(jié)合能為-6.6 kJ/mol）具有較強(qiáng)的結(jié)合能力；漢黃芩素對ACE2（結(jié)合能為-7.7 kJ/mol） 和3CLpro（結(jié)合能為-6.7 kJ/mol） 也是如此。對接模式的預(yù)測可為藥物靶點的進(jìn)一步研究提供重要參考。

圖5 槲皮素、漢黃芩素分別與ACE2 和3CLpro 的分子對接模式Fig. 5 Molecular docking patterns of Quercentin and Wogonin with ACE2 and 3CLpro

3 討論

根據(jù)中醫(yī)理論，COVID-19 致病因素為濕毒，核心病機(jī)為濕毒壅肺、阻遏氣機(jī)[11]。結(jié)合各地不同版本診療方案,可以得知COVID-19 的中醫(yī)治療原則圍繞“濕、熱/寒、毒”，注重解表、化濕、清熱解毒[17]。目前，蒼術(shù)在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中醫(yī)辨證治療處方中應(yīng)用廣泛，如寒濕郁肺方、濕熱蘊(yùn)肺方、濕毒郁肺方、寒濕阻肺方、化濕敗毒方等[2]。而黃柏、蒼術(shù)匹配，共奏清熱燥濕之效，進(jìn)而有效改善COVID-19 癥狀。

本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法系統(tǒng)地分析了二妙方多組分-多靶點-多途徑調(diào)控COVID-19 疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制。通過篩選，活性成分中作用最顯著的是槲皮素、小檗堿、漢黃芩素。研究表明，槲皮素對SARS-CoV 復(fù)制具有明顯的抑制作用[18]。WU W 等[19]研究表明，槲皮素對多種流感病毒（H1N1、H3N2）具有抑制作用，阻斷其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并對流感病毒的血凝素蛋白存在較高的親和力，從而抑制病毒引起的溶血反應(yīng)。另有研究表明，槲皮素可減輕脂多糖對肺成纖維細(xì)胞的損害，機(jī)制可能是通過下調(diào)miR-221 的表達(dá)并抑制NF-κB 和JNK通路的激活[20]。小檗堿緩解流感病毒引起的炎癥病變，可能是通過線粒體自噬誘導(dǎo)減少ROS 生成，從而限制NLRP3 炎癥小體的激活[21]。小檗堿能夠明顯抑制病毒感染引起的Th1/Th2 和Th17/Treg 比值的升高以及炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[22]。漢黃芩素通過調(diào)控NF-κB/MAPK 信號通路來改善完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[23]，還能夠有效抑制HBV 的復(fù)制[24]。

由PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，MAPK1、3、8、14 均屬于絲裂原活化蛋白激酶MAPK 家族成員。MAPK 信號通過主要通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （ERK 1/2）、c-jun N 端激酶（JNK）/應(yīng)急激活的蛋白激酶（SAPK）、P38MAPK、ERK5/BMK1（BMKl）這四種信號傳導(dǎo)路徑參與細(xì)胞生長、分化、凋亡等多種生理過程[25]。MAPK 級聯(lián)激活是多種信號通路的中心。研究表明，抑制MAPK 信號通路后，可抑制甲型流感的復(fù)制，也可通過白介素調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體抗病毒的免疫功能，更能減少細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和成纖維細(xì)胞增殖影響肺纖維化進(jìn)程[26]。EGFR 是一種細(xì)胞表面糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互黏附。EGFR 的表達(dá)是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟之一。EGFR 下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：一條是Ras/ Raf/ MEK/ERK-MAPK 通路，而另一條是PI3K/Akt/mTOR 通路。研究表明， 補(bǔ)肺益氣方顯著抑制慢性阻塞性肺病大鼠的粘液高分泌，可能與調(diào)控EGFR/PI3K/mTOR 通路有關(guān)[27]。IL-8 主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移，促進(jìn)機(jī)體發(fā)育、組織修復(fù)，發(fā)揮抗炎、免疫應(yīng)答、機(jī)體免疫應(yīng)答等過程[28]。有研究認(rèn)為，COVID-19 感染患者存在的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴是導(dǎo)致重癥發(fā)展的重要因素，病毒感染誘發(fā)了細(xì)胞因子風(fēng)暴，機(jī)體失衡的細(xì)胞因子系統(tǒng)是造成肺炎及肺損傷的重要原因[29]。黃柏-蒼術(shù)對于化學(xué)趨化因子CXCL8 的調(diào)控有助于抑制機(jī)體遭受COVID-19 感染引起的炎癥因子風(fēng)暴和過度激活的免疫反應(yīng)，這對于病毒感染機(jī)體誘發(fā)的炎癥早期的調(diào)控較為關(guān)鍵，而在后期可能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，這種雙向調(diào)節(jié)作用對于改善COVID-19 病毒引起的相關(guān)癥狀具有積極意義。

CASP3、BCL2L1 是細(xì)胞凋亡途徑中重要的因子，在影響 RNA 病毒的復(fù)制以及在治療肺炎的過程中起關(guān)鍵作用[30]。研究證明病毒在感染時可通過調(diào)控外源性死亡受體和內(nèi)源性線粒體凋亡途徑促進(jìn)自身的復(fù)制和增殖，調(diào)控凋亡途徑中相關(guān)基因的表達(dá)可能是一種潛在有效的抗病毒方法[31]。

在GO 富集分析的過程中，黃柏-蒼術(shù)藥對干預(yù)COVID-19 的生物學(xué)途徑豐富且復(fù)雜。由KEGG 通路富集分析可知，主要涉及VEGF、HIF-1、ErbB、TNF、Toll 樣受體等信號通路。臨床上COVID-19 重癥患者會發(fā)展為急性肺損傷，是由肺腔上皮中的炎癥單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放，包括IL-6、IL-1 和TNF-α，這些因子在免疫性相關(guān)肺炎中發(fā)揮重要作用[32]。槲皮素是活性成分中的核心成分，研究表明已顯示出抑制TNF-α 和NF-κB 的作用[33]。與槲皮素相似，小檗堿、漢黃芩素也可以抑制TNF-α[34]。表皮生長因子受體 （EGFR）是一個巨大的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體（HER） 家族，該家族由ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 組成[35]，EGFR 等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發(fā)生。研究表明，抑制ErbB 信號通路可減輕中性粒細(xì)胞炎癥從而改善慢性阻塞性肺病[36]。此外，VEGF 信號通路與ARDS 的發(fā)展有密切關(guān)系，VEGF信號通路主要控制人體血管的新生，VEGF 及其受體參與ARDS 的血管滲透性調(diào)節(jié)導(dǎo)致肺水腫，因此VEGF 也是ARDS 的重要治療靶點[37]。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路在在抗病毒、介導(dǎo)能量代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成等方面也發(fā)揮了重要作用，會引起細(xì)胞的缺氧反應(yīng)，可能與COVID-19 患者普遍缺氧的臨床癥狀相關(guān)[38]。

最后，采用分子對接方法對二妙方中主要有效成分作用于ACE2 和3CLpro 的結(jié)合能進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示槲皮素和漢黃芩素對ACE2 和3CLpro 都有良好的結(jié)合能力。

4 討論

本研究運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，檢索出二妙方的活性成分及潛在靶點，以及COVID-19 的相關(guān)靶點，得到成分-疾病共同靶點39 個，再對這些靶點進(jìn)行GO 及KEGG 信號通路富集分析，預(yù)測出主要的活性成分小檗堿、槲皮素、漢黃芩素等，主要 通 過 調(diào) 節(jié)MAPK1、MAPK3、EGFR、CXCL8、CASP3、MAPK8、JAK1、MAPK14、BCL2L1 等靶點，調(diào)控TNF、ErbB 等信號通路來減輕過度炎癥與免疫反應(yīng)、抗病毒、調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)肺血管滲透性，減輕肺損傷，從而達(dá)到治療COVID-19 的目的。但其仍具有一定的局限性，有待進(jìn)一步驗證。