梁泰帥，趙肖瓊

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，山西 太原 030001；2. 太原工業(yè)學(xué)院 環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWild.或卵葉遠(yuǎn)志Polygala sibiricaL.的干燥根，主要以干燥的根皮入藥，并以筒粗、肉厚、去凈木心者為佳，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫的功效[1]。山西是全國(guó)遠(yuǎn)志藥材產(chǎn)量最大的省份，能夠供應(yīng)市場(chǎng)80%左右的遠(yuǎn)志，其中，運(yùn)城市聞喜縣、新絳縣是傳統(tǒng)栽培遠(yuǎn)志的主產(chǎn)區(qū)[2]。Cu是環(huán)境中被廣泛關(guān)注的重金屬污染物之一[3]。近年來，由于工業(yè)含Cu2+“三廢”的肆意排放以及農(nóng)業(yè)含Cu2+殺蟲劑和除草劑的過度使用[4]，使得土壤Cu 污染問題日趨加重，據(jù)統(tǒng)計(jì)山西省土壤中重金屬Cu 的平均含量為土壤環(huán)境背景值的1.35 倍[5]，在一定程度上影響著遠(yuǎn)志藥材的安全生產(chǎn)以及遠(yuǎn)志產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

褪黑素（MT）普遍存在于各類高等植物體內(nèi)，是一種新型的植物生理調(diào)節(jié)激素，能夠通過誘導(dǎo)防御基因表達(dá)、提升抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)能力等機(jī)制，增強(qiáng)植物對(duì)干旱、強(qiáng)光、高鹽等非生物脅迫的耐性[6]。然而目前鮮見關(guān)于MT 緩解遠(yuǎn)志Cu 脅迫的報(bào)道，因此本試驗(yàn)以遠(yuǎn)志種子為材料，探討外源不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、MDA含量、類黃酮含量及其合成關(guān)鍵酶活性的影響，為藥材安全生產(chǎn)過程中合理使用化學(xué)調(diào)控手段增強(qiáng)藥用植物植株對(duì)Cu 脅迫的耐受性提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

遠(yuǎn)志種子購自山西省運(yùn)城市新絳縣永信中藥材種植專業(yè)合作社，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)劉恩荔副教授鑒定為遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWild.的種子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 Cu 脅迫處理濃度的篩選 選擇大小一致、顆粒飽滿的遠(yuǎn)志種子，置于2%的NaClO 浸泡消毒15 min，蒸餾水洗凈后繼續(xù)用蒸餾水浸種24 h，晾干種子表面水分后均勻擺放于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，然后分別加入20 mL 濃度分別為0（蒸餾水）、5、25、50、100、200、400 mg/L 的CuSO4溶液，每皿50 粒，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，置于25 ℃、光照12 h 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以種子發(fā)芽長(zhǎng)度超過1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄種子發(fā)芽情況，培養(yǎng)9 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，每皿隨機(jī)取5 株幼苗測(cè)量其苗高、根長(zhǎng)和鮮重，烘干至恒重后再測(cè)定幼苗干重。

1.2.2 MT 浸種和Cu 脅迫處理 遠(yuǎn)志種子按照“1.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)，先用濃度分別為0（蒸 餾 水）、5、25、50、100、200、400 μmol/L 的MT 浸種24 h，隨后向培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入20 mL 濃度為100 mg/L 的CuSO4溶液（依據(jù)“1.2.1”項(xiàng)下方法篩選結(jié)果），以蒸餾水浸種和培養(yǎng)發(fā)芽為CK，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，第5 天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第9 天計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，每皿隨機(jī)取5 株幼苗測(cè)量其苗高、根長(zhǎng)、鮮重和干重。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

按照趙停等[7]的方法統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)。采用梁泰帥等[8]的方法測(cè)定幼苗的丙二醛（MDA）、類黃酮含量及類黃酮合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A 連接酶（4CL）的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cu 脅迫處理對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

遠(yuǎn)志種子發(fā)芽率及幼苗苗高、根長(zhǎng)、鮮重、干重均隨著Cu 脅迫濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)Cu 脅迫濃度為5 mg/L 時(shí)，發(fā)芽率等指標(biāo)較CK 均增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)Cu 脅迫濃度為100 mg/L 時(shí)，發(fā)芽率、苗高、根長(zhǎng)、鮮重及干重較CK 分別下降了36.26%、45.70%、41.20%、43.69%和43.57%（P＜0.05），明顯抑制了遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)；而當(dāng)Cu 脅迫濃度為200 和400 mg/L時(shí)，發(fā)芽率等指標(biāo)較CK 的下降率均超過了50%（Cu脅迫濃度為200 mg/L 時(shí)的發(fā)芽率除外），嚴(yán)重抑制了遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，見表1。因此，選定100 mg/L作為遠(yuǎn)志種子及幼苗耐受Cu 脅迫的敏感濃度。

表1 不同濃度Cu 脅迫處理對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響（±s，n = 3）Tab. 1 Effects of different concentrations of Cu stress on seed germination and seedling growth of Polygala tenuifolia（±s，n = 3）

表1 不同濃度Cu 脅迫處理對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響（±s，n = 3）Tab. 1 Effects of different concentrations of Cu stress on seed germination and seedling growth of Polygala tenuifolia（±s，n = 3）

注：同列字母完全不同，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），下表同。

處理 發(fā)芽率 / % 苗高 / cm 根長(zhǎng) / cm 鮮重 / mg 干重 / mg CK 60.67 ± 5.03ab 0.50 ± 0.02a 3.45 ± 0.10a 48.90 ± 1.11a 4.67 ± 0.40a Cu（5 mg/L） 63.33 ± 1.15a 0.52 ± 0.01a 3.64 ± 0.07a 50.43 ± 0.65a 4.87 ± 0.21a Cu（25 mg/L） 56.67 ± 1.15b 0.47 ± 0.02b 3.24 ± 0.11b 42.33 ± 1.08b 3.87 ± 0.21b Cu（50 mg/L） 46.67 ± 1.15c 0.37 ± 0.01c 2.61 ± 0.15c 31.77 ± 1.19c 3.37 ± 0.12c Cu（100 mg/L） 38.67 ± 3.06d 0.27 ± 0.01d 2.03 ± 0.19d 27.53 ± 1.03d 2.63 ± 0.12d Cu（200 mg/L） 30.67 ± 1.15e 0.22 ± 0.02e 1.47 ± 0.06e 20.03 ± 1.10e 1.93 ± 0.15e Cu（400 mg/L） 23.33 ± 2.31f 0.13 ± 0.02f 1.14 ± 0.08f 12.43 ± 0.71f 0.93 ± 0.15f F 110.549 310.174 214.689 630.959 134.897 P 0.003 0.000 0.000 0.000 0.002

2.2 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)的影響

與單一的Cu 脅迫相比，MT 浸種能夠不同程度促進(jìn)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志種子的萌發(fā)，且發(fā)芽勢(shì)等指標(biāo)均隨著MT 濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)MT浸種濃度為100 μmol/L 時(shí)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較單一的Cu 脅迫分別明顯增加了52.00%、46.55%、54.56% 和144.52%（P＜0.05），增幅最大，見表2。

表2 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)的影響（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seed germination of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

表2 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)的影響（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seed germination of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

處理 發(fā)芽勢(shì) / % 發(fā)芽率 / % 發(fā)芽指數(shù) 活力指數(shù)CK 54.67 ± 2.31a 60.67 ± 5.03a 8.42 ± 0.59a 28.97 ± 1.13a Cu 33.33 ± 2.31f 38.67 ± 3.06e 5.10 ± 0.22f 10.35 ± 1.09f Cu+MT（5 μmol/L） 38.67 ± 3.06e 42.67 ± 1.15de 5.74 ± 0.07e 12.85 ± 0.51e Cu+MT（25 μmol/L） 40.67 ± 3.06de 46.00 ± 2.00d 6.28 ± 0.19d 16.16 ± 0.46d Cu+MT（50 μmol/L） 44.67 ± 3.06cd 50.67 ± 2.31c 7.09 ± 0.15c 20.74 ± 0.55c Cu+MT（100 μmol/L） 50.67 ± 2.31ab 56.67 ± 1.15ab 7.89 ± 0.11b 25.30 ± 1.07b Cu+MT（200 μmol/L） 47.33 ± 3.06bc 55.33 ± 2.31b 7.28 ± 0.37c 22.15 ± 1.61c Cu+MT（400 μmol/L） 40.67 ± 1.15de 44.67 ± 2.31d 6.02 ± 0.17de 16.79 ± 0.46d F 20.948 24.581 48.119 131.993 P 0.003 0.000 0.000 0.000

2.3 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗生長(zhǎng)的影響

與單一的Cu 脅迫相比，MT 浸種能夠不同程度促進(jìn)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗的生長(zhǎng)，且苗高、根長(zhǎng)、鮮重和干重均隨著MT 濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)MT 浸種濃度為100 μmol/L 時(shí)，苗高、根長(zhǎng)、鮮重和干重較單一的Cu 脅迫分別明顯增加了63.41%、58.22%、54.96%和49.37%（P＜0.05），增幅最大，見表3。

表3 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗生長(zhǎng)的影響（±s，n = 3）Tab. 3 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seedling growth of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

表3 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗生長(zhǎng)的影響（±s，n = 3）Tab. 3 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seedling growth of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

處理 苗高 / cm 根長(zhǎng) / cm 鮮重 / mg 干重 / mg CK 0.50 ± 0.02a 3.45 ± 0.10a 48.90 ± 1.11a 4.67 ± 0.40a Cu 0.27 ± 0.01e 2.03 ± 0.19g 27.53 ± 1.03f 2.63 ± 0.12d Cu+MT（5 μmol/L） 0.30 ± 0.02e 2.24 ± 0.11f 29.77 ± 1.35e 2.87 ± 0.21d Cu+MT（25 μmol/L） 0.34 ± 0.02d 2.57 ± 0.10e 32.43 ± 0.91d 3.23 ± 0.12c Cu+MT（50 μmol/L） 0.37 ± 0.01c 2.93 ± 0.14cd 37.53 ± 1.03c 3.63 ± 0.12b Cu+MT（100 μmol/L） 0.45 ± 0.02b 3.21 ± 0.09b 42.67 ± 0.51b 3.93 ± 0.21b Cu+MT（200 μmol/L） 0.43 ± 0.02b 3.04 ± 0.10bc 42.43 ± 0.71b 3.93 ± 0.15b Cu+MT（400 μmol/L） 0.37 ± 0.02c 2.79 ± 0.05d 37.43 ± 0.65c 3.77 ± 0.06b F 77.610 52.187 174.498 32.409 P 0.000 0.000 0.002 0.000

2.4 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗MDA含量及類黃酮代謝的影響

與單一的Cu 脅迫相比，MT 浸種能夠不同程度降低Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗的MDA 含量并增加類黃酮含量及其合成關(guān)鍵酶的活性，MDA 含量隨著MT 濃度的增加呈先降低后升高趨勢(shì)，而類黃酮含量及PAL、C4H、4CL 活性均隨著MT 濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)MT 浸種濃度為100 μmol/L 時(shí)，MDA 含量較單一的Cu 脅迫明顯降低了39.30%（P＜0.05），降幅最大；而類黃酮含量及PAL、C4H、4CL 活性較單一的Cu 脅迫分別明顯增加了28.10%、32.01%、40.81%、85.78%（P＜0.05），增幅最大，見表4。

表4 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗MDA 含量及類黃酮代謝的影響（±s，n = 3）Tab. 4 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on MDA contents and flavonoids metabolism of Polygala tenuifolia under Cu stress （±s，n = 3）

表4 不同濃度MT 浸種對(duì)Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗MDA 含量及類黃酮代謝的影響（±s，n = 3）Tab. 4 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on MDA contents and flavonoids metabolism of Polygala tenuifolia under Cu stress （±s，n = 3）

處理 MDA /（μmol/g） 類黃酮 / （mg/g） PAL / （U/g） C4H /（U/g） 4CL / （U/g）CK 2.25 ± 0.12g 4.17 ± 0.25e 0.12 ± 0.01f 0.22 ± 0.01e 0.63 ± 0.04f Cu 5.85 ± 0.17a 6.33 ± 0.23d 0.28 ± 0.01e 0.33 ± 0.01d 0.88 ± 0.04e Cu+MT（5 μmol/L） 5.42 ± 0.08b 6.53 ± 0.36cd 0.29 ± 0.01de 0.35 ± 0.01d 0.94 ± 0.05e Cu+MT（25 μmol/L） 4.93 ± 0.07c 6.99 ± 0.21bc 0.31 ± 0.01c 0.38 ± 0.02c 1.24 ± 0.05c Cu+MT（50 μmol/L） 4.22 ± 0.11d 7.18 ± 0.33b 0.34 ± 0.01b 0.44 ± 0.01b 1.43 ± 0.05b Cu+MT（100 μmol/L） 3.55 ± 0.10f 8.11 ± 0.21a 0.37 ± 0.01a 0.47 ± 0.01a 1.63 ± 0.03a Cu+MT（200 μmol/L） 3.77 ± 0.11e 7.68 ± 0.23a 0.34 ± 0.01b 0.43 ± 0.01b 1.33 ± 0.03c Cu+MT（400 μmol/L） 4.37 ± 0.15d 6.75 ± 0.29bcd 0.30 ± 0.01cd 0.40 ± 0.01c 1.08 ± 0.10d F 280.877 58.259 178.542 138.101 110.167 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

種子萌發(fā)期和幼苗生長(zhǎng)期是植物生長(zhǎng)周期中最為關(guān)鍵的兩個(gè)階段，也是對(duì)重金屬Cu 等非生物逆境脅迫較為敏感的時(shí)期，其生長(zhǎng)發(fā)育的好壞直接關(guān)系到最終藥材質(zhì)量的優(yōu)劣[9]。張鶴山等[10]研究發(fā)現(xiàn)Cu脅迫對(duì)白三葉種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)存在“低促高抑”效應(yīng)，即低濃度Cu 促進(jìn)種子萌發(fā)及根系生長(zhǎng)，而高濃度Cu 抑制種子萌發(fā)及根系生長(zhǎng)。本試驗(yàn)也得到類似結(jié)果，Cu 脅迫濃度為5 mg/L 時(shí)遠(yuǎn)志種子發(fā)芽率、苗高、根長(zhǎng)、鮮重及干重較CK 均增加，Cu 脅迫濃度超過5 mg/L 時(shí)明顯抑制了種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)。MT 浸種能夠不同程度減輕Cu 脅迫對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的傷害，并以100 μmol/L MT 的緩解效果最佳，這與劉仕翔等[11]在水稻方面和李冬等[12]在豌豆方面的研究結(jié)果相似。

重金屬脅迫能夠破壞植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)平衡而生成過量的活性氧，從而引發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化，膜脂過氧化產(chǎn)生的MDA 含量越高表示細(xì)胞膜受損傷越嚴(yán)重[13]。類黃酮是植物體內(nèi)主要的次生代謝產(chǎn)物，本身具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠捕捉細(xì)胞內(nèi)的活性氧，減輕氧化損傷[14]；PAL、C4H 和4CL 是類黃酮合成途徑的3 個(gè)關(guān)鍵酶，活性均受光、水分、溫度、重金屬等環(huán)境因素的影響[8]。本試驗(yàn)中，Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗MDA 含量、類黃酮含量及其合成途徑3 個(gè)關(guān)鍵酶活性均明顯提升；100 μmol/L MT 浸種能夠進(jìn)一步明顯提高Cu 脅迫下遠(yuǎn)志幼苗的類黃酮含量及其合成途徑3 個(gè)關(guān)鍵酶的活性，而明顯降低MDA 含量，說明MT 浸種能夠通過正調(diào)控Cu 脅迫下PAL、C4H和4CL 的活性促進(jìn)幼苗體內(nèi)黃酮類化合物的含量，從而提升幼苗的抗氧化能力。

4 結(jié)論

外源適宜濃度（100 μmol/L）MT 浸種能夠通過正調(diào)控類黃酮含量來維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而提升遠(yuǎn)志種子和幼苗對(duì)Cu 脅迫的耐受性。因此，MT 浸種能夠作為一種有效手段用于緩解遠(yuǎn)志幼苗培育過程面臨的Cu 脅迫問題。但植物抗逆機(jī)能的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)十分復(fù)雜的生化反應(yīng)過程，由于本試驗(yàn)所測(cè)定的指標(biāo)有限，MT 增強(qiáng)遠(yuǎn)志耐Cu 脅迫的深層機(jī)理有待通過組學(xué)聯(lián)用技術(shù)深入研究。