朱 雷 趙 彤 王欣茹 蔣昕彧 候利波 孔祥會

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453007)

Rab蛋白是Ras樣蛋白超家族中最大的分支,到目前為止,已經(jīng)在人類基因組中成功鑒定到70多個Rab基因[1,2]。Rab蛋白在進(jìn)化上相對保守,它們在結(jié)構(gòu)上均含有高度保守的G結(jié)構(gòu)域(Guanine-base binding motifs)和PM結(jié)構(gòu)域(Phosphate/magnesiumbinding motifs)及高度可變的N端和C端[3]。研究表明大多數(shù)Rab蛋白在真核生物細(xì)胞的囊泡運輸過程中發(fā)揮重要作用,作為Rab蛋白家族的重要成員,Rab5和Rab6在吞噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[4—7]。

在高等哺乳動物細(xì)胞中,Rab5存在3種亞型(Rab5A、Rab5B和Rab5C),3種亞型在細(xì)胞定位相互重疊,并且功能也密切相關(guān)。雖然具有多種細(xì)胞功能,Rab5最主要的功能是調(diào)節(jié)早期吞噬過程中吞噬小體和內(nèi)吞小體的融合[8]。研究表明,在人類巨噬細(xì)胞早期吞噬過程中Rab5會迅速富集到早期吞噬體上,并發(fā)揮對外源異物吞噬的調(diào)控作用。使用抗體中和胞質(zhì)Rab5蛋白后,吞噬小體與核內(nèi)小體的融合明顯減少,而過表達(dá)Rab5則可以增強(qiáng)吞噬小體與溶酶體的融合。使用干擾技術(shù)抑制Rab5基因的正常表達(dá)后,細(xì)胞吞噬能力會受到顯著影響[9,10]。其次,Rab5還參與調(diào)控細(xì)胞骨架的構(gòu)建,并且這種調(diào)節(jié)并不需要PI3-K、Ras、Rac和Cdc42等分子的參與。需要注意的是Rab5調(diào)控的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致細(xì)胞偽足的形成和遷移,并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞吞噬作用[11]。此外,Rab5還參與了胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。在外界信號刺激下,Rab5可以調(diào)節(jié)APPL1和APPL2從核內(nèi)體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,并進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和其他細(xì)胞功能[12]。值得注意的是,近期研究表明Rab5也參與了水生動物的先天免疫。大黃魚(Larimichthys crocea)在受到副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)感染后,其脾臟中的Rab5基因的表達(dá)量達(dá)到對照組的24倍。Rab5可以通過誘導(dǎo)TNFα和IL-6的表達(dá)來提高大黃魚的炎癥反應(yīng)[13]。凡納濱對蝦(Litopenaeus Vannamei)感染傳染性皮下和造血壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus,WSSV)后,Rab5在對蝦組織中發(fā)生明顯的表達(dá)變化。進(jìn)一步的研究表明,Rab5可以與IHHNV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1相互作用[14]。

Rab6是多種膜運輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)控因子,特別是在高爾基體的反向運輸途徑中。在其他效應(yīng)分子的參與下,Rab6還可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬、有絲分裂和先天免疫反應(yīng)[1,15]。Rab6在小鼠(Mus musculus)單核-巨噬細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的過程中發(fā)揮了積極作用[16]。有報道表明Rab6參與調(diào)控日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)血淋巴細(xì)胞抗菌和抗病毒吞噬作用,且血淋巴細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)與Rab6的表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)。此外,Rab6可以與WSSV囊膜蛋白VP466相互作用,形成的Rab6-VP466復(fù)合物可以通過與肌動蛋白的相互作用調(diào)控血淋巴細(xì)胞的吞噬作用[6,7]。研究人員在果蠅(Drosophila melanogaster)S2細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果,推測無脊椎動物中Rab6在吞噬中的調(diào)控作用是相對保守的[6]。

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)又名小龍蝦,是我國重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種。然而,隨著養(yǎng)殖密度的增加,人工養(yǎng)殖克氏原螯蝦不斷遭受各種疾病侵襲[17—19]。在前期的研究中,我們克隆了克氏原螯蝦Rab5(PcRab5)和Rab6(PcRab6)基因,廣泛存在于克氏原螯蝦的各個組織中,且在血淋巴細(xì)胞和鰓中的表達(dá)量較高。WSSV和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,兩者在肝胰腺、鰓和腸道的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著變化。在PcRab5和PcRab6表達(dá)受抑制后,感染了WSSV和嗜水氣單胞菌的克氏原螯蝦死亡率受到明顯影響[20]。這些研究均表明甲殼動物Rab5和Rab6可能參與調(diào)節(jié)血淋巴細(xì)胞吞噬功能和對抗原的免疫響應(yīng)。在此基礎(chǔ)上,本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了兩者的原核表達(dá)載體,制備了多克隆抗體,并進(jìn)一步研究了其對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響。實驗結(jié)果可為進(jìn)一步研究克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6的免疫學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用克氏原螯蝦購自河南省鶴壁市養(yǎng)殖基地,體重為25—30 g,實驗前暫養(yǎng)1周,水溫控制在20℃左右,養(yǎng)殖過程中每天換1次水,每次換2/3。實驗前選取體表無傷,行動活潑的個體進(jìn)行實驗。

1.2 實驗試劑

pET-B2m質(zhì)粒與表達(dá)載體(含有his和B2m標(biāo)簽)購自武漢金開瑞生物工程有限公司;DNA聚合酶、內(nèi)切酶和瓊脂糖購自TaKaRa公司;DNA Marker 購于大連寶生物工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒和IPTG購自天根生物技術(shù)公司;硝酸纖維素膜、弗式完全佐劑、弗式不完全佐劑和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Sigma公司;FITC標(biāo)記的熒光微球(1 μm)購自美國Polysciences公司。

1.3 目的基因的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6基因[20]的序列特點,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PcRab5和PcRab6的特異性引物(表1),以克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR獲得目的基因片段。使用SalI與BamH I雙酶切載體pET-B2m,隨后使用同源重組技術(shù)構(gòu)建帶GFP標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-B2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選陽性克隆進(jìn)行PCR檢測和送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,采用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析,以判斷目的基因是否正確插入載體。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab. 1 Primers used for PCR amplification

1.4 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

將驗證正確的陽性表達(dá)菌接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)(取部分菌液作為對照),37℃震蕩培養(yǎng)至A600約0.6,向其中加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度0.5 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),37℃震蕩培養(yǎng)4h。取上述菌液2 mL,12000 r/min離心20min,收集沉淀。菌體沉淀以40 μL 1×loading buffer重懸裂解,隨后使用SDS-PAGE對總菌體、沉淀和上清進(jìn)行檢測。驗證外源基因顯著表達(dá)后,將菌液接入2000 mL的LB液體培養(yǎng)基中按照上述方法進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),隨后使用上述方法進(jìn)行離心、收集、破碎(200 W、工作3s、暫停3s、時間10min)和檢測。

1.5 蛋白純化和抗體制備

使用Ni-NTA柱對原核蛋白進(jìn)行純化。大致過程如下: 使用0.22 μm濾膜過濾蛋白溶液,以1 mL/min的速度在Ni-NTA柱中上樣蛋白溶液,隨后使用6 mol/L鹽酸胍緩沖液(pH 8.0)沖洗柱子,并使用G250檢測不變色時停止(流出液不含蛋白)。分別以不同濃度的咪唑的洗脫液(20、60、200和500 mmol/L)洗脫,分段收集洗脫液至G250檢測液不變色。隨后,使用去離子水沖洗柱料。使用SDS-PAGE電泳檢測收集的洗脫液,隨后,使用分步透析法對融合蛋白進(jìn)行復(fù)性,蛋白依次經(jīng)過6、3、2、1 mol/L(375 μmol/L谷胱甘肽和400 μmol/L L-精氨酸)、0.5 mol/L(375 μmol/L谷胱甘肽和400 μmol/L L-精氨酸)和0 mol/L鹽酸胍透析,每次透析約12h。選取4只6月齡以上的日本大耳兔進(jìn)行4次免疫制備抗體,制備抗體之前使用注射器從耳靜脈抽取約10 mL血液作為陰性對照。將蛋白濃度調(diào)至400 μg/mL,抽取1 mL蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻至乳白色,隨后四點注射大耳兔。初次免疫間隔2周后,抽取1 mL蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻至乳白色,隨后四點注射大耳兔。第3和第4次免疫方法同第2次免疫,第4次免疫10d后,從耳靜脈抽血。

1.6 抗體效價檢測

首先,將抗原稀釋至2 μg/mL,并加入至96 孔酶標(biāo)反應(yīng)板中(100 μL/孔),包被過夜。次日棄去孔內(nèi)液體,PBST洗3次。向孔內(nèi)加入200 μL 5%的BSA溶液,封閉2h。將血清按1∶2 K、1∶4 K、1∶8 K、1∶16 K···1∶32768 K進(jìn)行倍比稀釋,并加入酶標(biāo)板中,孵育1h。洗滌后,加入HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶5000),37℃孵育40min。加入新鮮配制的底物溶液,避光孵育5—20min。加入終止液,隨后用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光值。

1.7 抗體特異性檢測

首先,將PcRab5和PcRab6的原核表達(dá)蛋白稀釋至10 ng/μL,并分別進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜中。轉(zhuǎn)移結(jié)束后使用5%的封閉液封閉4h,PBST洗滌3次后,將膜放置于一抗稀釋液中(1∶2000),孵育2h。PBST洗滌3次,浸泡于HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)中,孵育1h,最后使用ECL曝光。

1.8 抗體純化

使用10倍柱床體積的去離子水沖洗ProteinG柱,隨后使用0.02 mol/L 磷酸緩沖液(PB)和0.3 mol/L NaCl沖洗柱子,流速控制在1 mL/min。使用0.02 mol/L PB溶液稀釋抗血清,0.22 μm濾膜過濾上柱,流速控制在5—7s/滴。分別使用PB溶液和0.1 mol/L甘氨酸(pH 3.0)沖洗柱子至無蛋白流出為止(G250不變藍(lán))。使用飽和碳酸鈉溶液將洗脫物調(diào)節(jié)至pH中性,使用超濾管進(jìn)行超濾。最后,使用PBS(0.01 mol/L,pH=7.4)透析過夜,第2天換新PBS液一次,再次透析4—6h后,使用SDS-PAGE鑒定并測定抗體濃度后分裝于EP管,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9 克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬能力驗證

為了驗證克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞對熒光微球的吞噬能力,使用預(yù)冷的血淋巴抗凝劑(336 mmol/L氯化鈉,27 mmol/L檸檬酸鈉,9 mmol/L EDTA,115 mmol/L 葡萄糖,pH 7.2),從克氏原螯蝦圍心腔處抽取血淋巴。然后,400×g離心10min獲得血淋巴細(xì)胞,將血淋巴細(xì)胞離心洗滌后使用改良的L-15培養(yǎng)基重懸,并在12孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。然后向其中加入熒光微球(細(xì)胞∶微球=1∶20),孵育1h,每隔20min輕輕搖晃1次。在孵育結(jié)束后,將細(xì)胞懸液加在3 mL葡萄糖墊溶液(含3% BSA 和4.5% D-葡萄糖的BSA,pH 7.4)上方,4℃,100×g離心10min,去除未被吞噬的微球,PBS洗滌3次。隨后,分別使用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析血淋巴細(xì)胞吞噬活性。在流式細(xì)胞術(shù)中,將FL1-H(代表細(xì)胞熒光強(qiáng)度大小)設(shè)置為橫坐標(biāo),將Count(代表細(xì)胞數(shù)量)設(shè)置為縱坐標(biāo),每個樣品分析1×104個細(xì)胞。

1.10 PcRab5和PcRab6對克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬活性影響

實驗方法參照文獻(xiàn)[9,21],并進(jìn)行一些修改。將健康克氏原螯蝦平均分成6組,每組3個平行,分別命名為PBS對照組(A)、BSA對照組(B)、PcRab5蛋白過表達(dá)組(C)、PcRab5免疫抑制組(D)、PcRab6蛋白過表達(dá)組(E)和PcRab6免疫抑制組(F)。其中,A組注射200 μL PBS,而B、C、D、E和F組分別注射200 μL 0.1 mg的BSA、PcRab5蛋白、PcRab6抗體、PcRab6蛋白和PcRab6抗體。在注射4h后,使用預(yù)冷的血淋巴抗凝劑,從各組克氏原螯蝦圍心腔處抽取血淋巴。然后,離心獲得血淋巴細(xì)胞,離心洗滌后在12孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。隨后參照上述方法使用流式細(xì)胞數(shù)分析各組克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬活性情況。

1.11 數(shù)據(jù)的處理與分析

實驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD;n=3)。用SPSS 25.0軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(Oneway analysis of variance,ANOVA),當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為有顯著性差異,隨后利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 PcRab5、PcRab6表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

分別以構(gòu)建的pET-B2m-PcRab5和pET-B2m-PcRab6為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,獲得的目的片段與預(yù)期大小均符合。隨后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測序,結(jié)果表明PcRab5和PcRab6已經(jīng)正確插入至表達(dá)載體中。

2.2 重組蛋白表達(dá)

使用SDS-PAGE分析PcRab5和PcRab6的陽性克隆菌株小量誘導(dǎo)表達(dá)情況,結(jié)果顯示PcRab5和PcRab6的陽性克隆菌株均在67 kD處出現(xiàn)明顯的加粗條帶,大小與預(yù)期大小一致。隨后,對陽性菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo),并使用SDS-PAGE進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示加粗蛋白質(zhì)條帶主要出現(xiàn)在菌體沉淀中,且染色較深,說明重組蛋白質(zhì)主要以包涵體的形式存在。

2.3 重組蛋白的純化

對PcRab5和PcRab6的表達(dá)菌進(jìn)行收集、破碎、Ni-NTA柱純化和超濾后,經(jīng)稀釋后使用SDSPAGE電泳檢測,結(jié)果表明PcRab5和PcRab6均在67 kD處有一條明顯的條帶,與預(yù)期大小一致,且無明顯雜帶,純度較高,可以用來免疫大耳兔制備多克隆抗體。

2.4 兔抗血清效價和特異性檢測

采用ELISA檢測抗體效價,結(jié)果表明PcRab5的兔多克隆抗體效價為1∶2048K(圖1A),而Rab6的多克隆抗體效價超過1∶512K(圖1B)。以上實驗結(jié)果表明,重組的PcRab5和PcRab6蛋白均誘導(dǎo)了大耳兔產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫反應(yīng),獲得了效價較高的抗體。

圖1 克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6多克隆抗體效價檢測Fig. 1 Titer of polyclonal antibody against Rab5 or Rab6 of Procambarus clarkii

采用Western Blot檢測PcRab5和PcRab6多抗血清特異性,結(jié)果顯示,PcRab5多抗血清可以識別原核表達(dá)的PcRab5,PcRab6多抗血清可以識別原核表達(dá)的PcRab6。以上實驗結(jié)果表明,制備的PcRab5和PcRab6抗血清中抗體可以分別與PcRab5和PcRab6蛋白相互作用,且特異性較強(qiáng)。

2.5 抗體純化

使用Protein G親和層析柱對PcRab5和PcRab6的抗血清進(jìn)行純化,并使用SDS-PAGE檢測,結(jié)果表明純化的PcRab5和PcRab6多抗均出現(xiàn)兩條明顯的條帶,其中較大的條帶為55 kD左右,較小的條帶約為25 kD左右,片段大小與兔抗體的重鏈與輕鏈大小相一致,且未見明顯雜帶。純化后抗體濃度約為10 mg/mL,純度為90%以上,實驗結(jié)果為開展抗體相關(guān)實驗奠定基礎(chǔ)。

2.6 克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞對熒光微球的吞噬能力

本實驗使用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡驗證克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞對熒光微球的吞噬活性。流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果表明分離的血淋巴細(xì)胞雜質(zhì)少,可以用于吞噬實驗(圖2A)。進(jìn)一步分析表明血淋巴細(xì)胞可以吞噬熒光微球,且能吞噬微球的細(xì)胞比例約為20%(圖2B),熒光顯微鏡實驗結(jié)果表明在血淋巴細(xì)胞內(nèi)部觀察到熒光信號,表明其可吞噬熒光微球(圖2C)。

圖2 克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞對熒光微球的吞噬能力檢測Fig. 2 Detection of phagocytosis ability of haemocytes of Procambarus clarkii against fluorescent microspheres

2.7 PcRab5、PcRab6對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響

研究表明PcRab5和PcRab6蛋白在調(diào)控細(xì)胞吞噬功能方面發(fā)揮重要作用,為研究克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響,本實驗將PcRab5和PcRab6原核表達(dá)蛋白和抗體分別注射至健康螯蝦體內(nèi),并使用流式細(xì)胞術(shù)研究其對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響(圖3)。結(jié)果表明,相對于PBS對照組,注射PcRab5蛋白的螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬率上升至約33.6%(P＜0.05),而注射PcRab6原核蛋白的血淋巴細(xì)胞吞噬率升至約28.5%(P＜0.05)。雖然PcRab5蛋白注射組血淋巴細(xì)胞吞噬水平高于PcRab6蛋白注射組,但是兩組之間并不存在顯著性差異。與此同時,當(dāng)健康對蝦分別注射PcRab5和PcRab6蛋白多克隆抗體時,其血淋巴細(xì)胞吞噬率明顯下降,并分別降至13.1%(P＜0.05)和13.9%(P＜0.05),且兩組也不存在顯著性差異(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響Fig. 3 The representative histograms of different treatment on the phagocytic activity of haemocytes

圖4 不同處理對血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響檢測Fig. 4 Effect of different treatments on phagocytic activity of haemocytes

3 討論

3.1 PcRab5和PcRab6的原核表達(dá)和抗體制備

Rab5和Rab6均是Rab蛋白家族中的重要成員,幾乎存在于所有真核生物中,主要功能是參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞內(nèi)各個細(xì)胞器之間的囊泡運輸過程[1,2]。除此之外,這兩個蛋白還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡等。因此,Rab5和Rab6的結(jié)構(gòu)和功能受到廣泛關(guān)注。本實驗使用同源重組技術(shù)構(gòu)建了原核表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和抗體制備,并以此研究了其對克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響。

Rab蛋白通常以單體形式存在,分子量介于20—30 kD,因此被稱為小G蛋白。在前期研究中,本課題組克隆得到克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6基因,兩個基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量均為23 kD左右[19]。本實驗構(gòu)建PcRab5和PcRab6的原核表達(dá)載體時,偶聯(lián)了GFP標(biāo)簽(分子量約為27 kD),再加上pETB2m表達(dá)載體自帶的his和B2m標(biāo)簽(分子量約為17 kD),因此,原核表達(dá)的分子量應(yīng)約為67 kD。但是,陽性菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測目的條帶分子量與理論大小略有差異,造成這一現(xiàn)象的原因可能是不同蛋白之間的電荷效應(yīng)造成的[22,23]。隨后,采用SDS-PAGE對純化的原核表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示其分子量與理論大小基本保持一致。原核表達(dá)蛋白通常以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在,其中,可溶性形式一般具有活性功能,而包涵體常被認(rèn)為是高級結(jié)構(gòu)錯誤折疊而失去活性。然而,研究發(fā)現(xiàn)包涵體中的蛋白大部分也具有活性功能,并且經(jīng)純化和復(fù)性后,可以用于抗體制備和其他方面的研究[24]。另外,原核表達(dá)的融合蛋白純化后使用分步透析法進(jìn)行復(fù)性,蛋白需經(jīng)過不同濃度的鹽酸胍依次透析,每次透析約12h,融合蛋白復(fù)性后具有良好的溶解性,且注射進(jìn)螯蝦體內(nèi)后顯著影響其血淋巴細(xì)胞的吞噬活性,而無關(guān)蛋白BSA沒有影響,這說明原核表達(dá)的Rab5和Rab6具有良好的蛋白活性,且與血淋巴細(xì)胞的吞噬變化密切相關(guān)。本研究使用原核表達(dá)的PcRab5和PcRab6蛋白免疫兔子,獲得了抗體效價高和特異性好的多克隆抗體,并且純化后的抗體濃度均在10 mg/mL以上,這為在體外水平對其研究提供了保障。

3.2 PcRab5和PcRab6對克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬的影響分析

目前,關(guān)于Rab5和Rab6在吞噬中的作用研究多數(shù)集中在高等哺乳動物中。在人體巨噬細(xì)胞中的研究表明,當(dāng)使用抗體中和胞質(zhì)Rab5后,吞噬小體與核內(nèi)小體的融合明顯減少,并且吞噬效率也會下降。向細(xì)胞系中加入外源活化的Rab5蛋白,吞噬會恢復(fù)至正常水平[9,10]。同樣,小鼠胸腺細(xì)胞在進(jìn)行吞噬時,Rab5在吞噬體中的活性也是不斷增加的,而Rab5表達(dá)缺陷細(xì)胞的吞噬活性存在明顯滯后和效率低下的現(xiàn)象,表明Rab5在小鼠胸腺細(xì)胞吞噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。在果蠅(Drosophila melanogaster)S2細(xì)胞系中,使用基因干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)技術(shù)干預(yù)Rab6的正常表達(dá)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab6表達(dá)受抑制后細(xì)胞吞噬效率下降,而過表達(dá)Rab6后血淋巴細(xì)胞吞噬效率升高。而且,使用Rab6蛋白拯救干擾的Rab6基因其吞噬恢復(fù)正常水平[6]。在甲殼動物中,關(guān)于Rab蛋白的研究較少,斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)Rab5可以通過參與血淋巴細(xì)胞內(nèi)黃頭病毒(Yellow head virus,YHV)的早期轉(zhuǎn)運過程從而在該病毒感染的早期階段發(fā)揮作用[26]。傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)感染凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)后Rab5蛋白在肝胰腺中出現(xiàn)顯著的表達(dá)變化,并且Rab5可以與IHHNV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1相互作用[14]。采用RNAi技術(shù)干擾日本囊對蝦Rab6基因的正常表達(dá)后,其血淋巴細(xì)胞對副溶血性弧菌吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著下降[7]。同樣,通過與肌動蛋白、肌球蛋白及WSSV囊膜蛋白VP466等形成復(fù)合物,Rab6基因可以調(diào)控日本囊對蝦血淋巴細(xì)胞抗病毒吞噬作用[6]。為了進(jìn)一步厘清Rab5和Rab6在甲殼動物細(xì)胞吞噬中的作用,本文檢測了這兩個蛋白對克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬活性的影響。結(jié)果表明,在體內(nèi)加入外源的PcRab5或PcRab6蛋白后,克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞的吞噬活性均有顯著提升。將純化的PcRab5和PcRab6多克隆抗體注射進(jìn)螯蝦體內(nèi)后,其血淋巴細(xì)胞的吞噬活性出現(xiàn)顯著下調(diào)。研究結(jié)果表明,克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6蛋白參與了血淋巴細(xì)胞的吞噬功能,并發(fā)揮了積極作用。此外,PcRab5蛋白注射組和PcRab6蛋白注射組之間的吞噬率,以及PcRab5抗體封閉組與PcRab6抗體封閉組之間的吞噬率不存在顯著性差異。實驗結(jié)果表明,外源PcRab5與PcRab6蛋白可能對血淋巴細(xì)胞吞噬活性發(fā)揮相近的影響效果。

雖然PcRab5蛋白注射組血淋巴細(xì)胞吞噬水平高于PcRab6蛋白注射組,但是兩組之間并不存在顯著性差異。與此同時,當(dāng)健康對蝦分別注射PcRab5、PcRab6蛋白多克隆抗體時,其血淋巴細(xì)胞吞噬率明顯下降,并分別降至13.1%(P＜0.05)和13.9%(P＜0.05),且兩組也不存在顯著性差異。

綜上所述,本研究采用同源重組技術(shù)獲得克氏原螯蝦PcRab5和PcRab6的原核表達(dá)蛋白,并制備了效價高和特異性強(qiáng)的多克隆抗體。實驗結(jié)果表明,PcRab5和PcRab6在克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞吞噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,本文可為理解甲殼動物Rab蛋白家族的功能奠定基礎(chǔ)。然而,Rab5和Rab6分別通過什么通路對甲殼動物細(xì)胞吞噬作用進(jìn)行調(diào)控? 目前并不清楚。在后續(xù)研究中,仍需開展更多實驗,以厘清Rab5和Rab6調(diào)控血淋巴細(xì)胞的吞噬機(jī)制。