李天慧 翟 剛 賀江燕 婁氣永 金 霞 杜震宇 肖武漢 殷 戰(zhàn) ,

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072;2. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200241;4. 中國科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院,武漢 430072)

魚類卵巢發(fā)育的完整過程包括卵發(fā)生、卵黃發(fā)生、卵巢成熟和排卵[1]。在卵巢發(fā)育過程中,母體營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中,形成卵黃,作為胚胎重要的母體營養(yǎng)來源。魚的卵黃主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和維生素組成[2]。由于母體營養(yǎng)運(yùn)輸缺陷而引起的卵巢發(fā)育不良,將嚴(yán)重影響女性生育能力、胚胎質(zhì)量及卵巢發(fā)育的諸多方面。卵黃原蛋白(Vtgs)是一類高分子量的糖磷脂蛋白,是卵黃蛋白的前體,主要在肝臟中合成[3,4]。Vtgs不僅是卵黃蛋白的主要成分,也是將含有礦物質(zhì)的脂質(zhì)和脂溶性維生素運(yùn)送到卵巢的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體[5,6]。母體通過Vtgs的營養(yǎng)運(yùn)輸和卵黃形成對(duì)女性生育有很大的影響,可能直接損害卵母細(xì)胞的健康和分化[7]。傳統(tǒng)上,一般認(rèn)為vtg的轉(zhuǎn)錄和合成是由雌激素/雌激素受體信號(hào)通路,通過對(duì)vtg基因啟動(dòng)子中的雌激素反應(yīng)元件(Estrogen response elements,ERE)進(jìn)行調(diào)控[8]。也有報(bào)道表明,類胡蘿卜素使魚卵呈現(xiàn)黃色或橙色,并且是支撐卵母細(xì)胞成熟的重要營養(yǎng)成分[9—12],魚的類胡蘿卜素可從食物中吸收,在大多數(shù)魚類中,Vtgs被認(rèn)為是類胡蘿卜素從肝臟向卵巢轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體[13—15]。

卵黃發(fā)生后,卵母細(xì)胞走向成熟。伴隨著促黃體生成素(LH)的激增,生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle breakdown,GVBD)是卵母細(xì)胞成熟的特征[16]。Gata4通過與Nr5a1互作,上調(diào)anti-Müllerian hormone(amh)的表達(dá)來影響斑馬魚(Danio rerio)卵巢的成熟[17]。在小鼠和人類卵巢中,有報(bào)道稱Nr4a1和Insl3都是卵母細(xì)胞成熟的重要調(diào)節(jié)因子[18]。雌激素受體和孕激素受體在卵巢發(fā)育中都扮演著重要的角色,然而,目前對(duì)Ar與斑馬魚卵巢發(fā)育關(guān)系的研究還較少。

雄激素受體(Ar)是由其配體包括睪酮或雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)激活的核受體[19,20]。在小鼠模型上的研究表明ar在精子發(fā)生中是不可缺少的[19,21—23]。最近兩個(gè)獨(dú)立的研究團(tuán)隊(duì)在斑馬魚ar敲除模型上的研究表明,ar信號(hào)在性別決定、精子發(fā)生和卵巢發(fā)育中發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[20,24]。特別是在卵巢發(fā)育方面,在ar敲除斑馬魚上觀察到,與卵巢發(fā)育相關(guān)的性腺指數(shù)(Gonadosomatic index,GSI)、受精率、成熟卵母細(xì)胞比率均顯著降低[20]。

在本研究中,我們進(jìn)一步探索了ar缺乏,即雄激素信號(hào)通路缺乏,對(duì)斑馬魚肝臟中Vtg產(chǎn)生、母體營養(yǎng)通過Vtg運(yùn)輸、卵黃形成和卵巢成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚養(yǎng)殖和處理

所有實(shí)驗(yàn)斑馬魚(Danio rerio)飼養(yǎng)在28.5℃的循環(huán)水系統(tǒng)中,光照14h,黑暗10h。每天喂食新孵化的豐年蟲(Artemia salina)兩次。斑馬魚ar突變系由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肖武漢團(tuán)隊(duì)構(gòu)建[20]。斑馬魚的發(fā)育階段以受精后幾個(gè)月(Months post-fertilization,mpf)來確定。

為了驗(yàn)證Vtg1抗血清的有效性,我們?cè)O(shè)計(jì)了雌激素處理實(shí)驗(yàn)。將17β-雌二醇(E2,E2758,Sigma-Aldrich,St. Louis,Missouri,USA)溶解在二甲亞砜(DMSO,D2650,Sigma-Aldrich,St. Louis,Missouri,USA)中,制備10 mg/L的原液。5 mpf 的ar+/+和ar-/-雌性斑馬魚分別分為兩組,一組突變系或?qū)φ战M暴露在50 ng/L (168.7 pmol/L)的E2中7d,另一組突變系或?qū)φ战M暴露在DMSO對(duì)照組的(20 μL加4 L系統(tǒng)水)處理系統(tǒng)水中。食物和養(yǎng)殖密度等條件保持一致。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要參考已有的文獻(xiàn)描述[25]。

1.2 總RNA提取和qPCR

使用TRIzol試劑從斑馬魚不同組織中提取總RNA,使用RevertAid Firststrand cDNA Synthesis Kit (K1622,Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)

用oligo-dT引物合成cDNA。PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix購自Transgen Biotech有限公司(AQ601-02,Transgen Biotech,北京,中國),按照制造商提供的方案進(jìn)行。使用BioRad實(shí)時(shí)系統(tǒng)熱循環(huán)儀(BioRad Systems,Berkeley,CA,USA)進(jìn)行qPCR。qPCR使用的引物見表1。通過常規(guī)PCR、電泳和測(cè)序驗(yàn)證每對(duì)引物具有特異性。以ef1α基因的表達(dá)水平作為歸一化對(duì)照。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCt方法[26]。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers used for qPCR

1.3 類胡蘿卜素的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)為類胡蘿卜素含量粗測(cè)量,方法參考文獻(xiàn)[27,28]。用無水乙醇從新鮮卵巢中提取類胡蘿卜素,每0.01 g卵巢中加入100 μL無水乙醇。渦流振蕩,然后在4℃的黑暗環(huán)境中過夜。在此過程中振蕩樣品兩次。第2天,將樣品在4000 r/min下離心10min。轉(zhuǎn)移上清液200 μL到96孔板上,在450 nm處測(cè)定樣品的吸光度。類胡蘿卜素的含量按以下公式計(jì)算。

式中,ω. 類胡蘿卜素含量 (mg/g);?. 類胡蘿卜素經(jīng)驗(yàn)消光系數(shù)[250 L/(g·cm)];d. 96孔板直徑200 μL(0.6 cm);F. 稀釋比例;W. 樣品質(zhì)量 (g);V. 萃取緩沖液體積 (L)。

1.4 卵巢總脂測(cè)定

卵巢總脂質(zhì)參照Folch法測(cè)定[29]。將新鮮卵巢稱量為濕重,然后將樣品快速放入液氮中至少15min。將樣品放入-80℃的冰箱中24h。用冷凍干燥機(jī)將樣品冷凍干燥24h,然后稱取干重。用1 mL CM緩沖液(氯仿∶甲醇 2∶1)勻漿,將勻漿移入試管。用CM緩沖液洗滌勻漿管,轉(zhuǎn)移洗滌液至試管,最終體積為6 mL。將樣品在室溫下渦旋1min,4℃過夜。加入2 mL 0.37 mol/L KCl,渦旋5 min,1500 r/min離心20min。提取下層,用氮?dú)飧稍?。測(cè)定卵巢脂肪的質(zhì)量,計(jì)算卵巢脂肪的質(zhì)量百分比。

1.5 激素測(cè)定

采用ELISA試劑盒(Testosterone: 582701,Estrodial: 501890,Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI,USA),并按照制造商的說明使用檢測(cè)睪酮和雌二醇。采集ar+/+和ar-/-雌性斑馬魚肝臟標(biāo)本,將每條魚的組織放入裝有磁珠的破碎管中,加入300 μL PBS破碎勻漿。勻漿后,按照制造商的說明使用有機(jī)溶劑提取性類固醇。通過渦旋和離心分離層,將有機(jī)層轉(zhuǎn)移到新管中,重復(fù)提取4次。有機(jī)部分在溫和的氮?dú)饬飨掠?0℃下蒸發(fā)。最后,將提取液溶解在200 μL ELISA緩沖液中,準(zhǔn)備樣品用于測(cè)量。所有樣本均通過3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)在3個(gè)重復(fù)中進(jìn)行測(cè)量。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

使用蛋白提取緩沖液(P0013B,Beyotime,上海,中國)提取肝臟蛋白。兔抗斑馬魚Vtg1血清由本團(tuán)隊(duì)委托公司制備,稀釋倍數(shù)為1∶1000。β-actin抗體(AC026,ABclonal,武漢,湖北,中國)稀釋倍數(shù)為1∶1000。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào),該信號(hào)由CCD相機(jī)成像儀檢測(cè)(Chemidoc MP Imaging System,Bio-Rad,Berkeley,CA,USA)。β-actin作為上樣對(duì)照,所有樣本重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有分析均使用GraphPad Prism 8軟件(Graph-Pad軟件)進(jìn)行。采用Student’st檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 制備Vtg1抗血清的有效性檢測(cè)及對(duì)ar敲除雌性斑馬魚肝臟Vtg蛋白水平的觀察

雌激素浸泡處理實(shí)驗(yàn)可以檢驗(yàn)Vtg1抗血清的有效性。通過采用斑馬魚在正常養(yǎng)殖或雌激素浸泡處理的對(duì)比實(shí)驗(yàn),取處理組和對(duì)照組雌性斑馬魚肝臟組織進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果顯示: E2處理的ar+/+雌魚肝臟Vtg1高于未經(jīng)E2處理的ar+/+雌魚,說明雌激素信號(hào)通路增強(qiáng),從而使Vtg生成增多,這一結(jié)果也說明了本實(shí)驗(yàn)所用抗血清的有效性(圖1,泳道1,2)。同時(shí),利用ar-/-的雌性斑馬魚,在正常養(yǎng)殖或雌激素浸泡處理的對(duì)比實(shí)驗(yàn),也發(fā)現(xiàn)E2處理和E2未處理的ar-/-雌魚肝臟Vtg1均無變化,說明增加雌激素不足以改變ar敲除對(duì)肝臟Vtg1合成的影響(圖1,泳道3,4)。

圖1 Vtg1抗血清有效性檢測(cè)Fig. 1 Detection of Vtg1 antiserum effectiveness

2.2 ar敲除導(dǎo)致斑馬魚肝臟Vtg蛋白合成下降

與對(duì)照組相比,ar-/-雌魚肝臟中vtg 1,2,4-7和vtg3的相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖2A和2B)。采用Western Blot檢測(cè),以及對(duì)其監(jiān)測(cè)信號(hào)的量化分析,也發(fā)現(xiàn)ar-/-雌魚肝臟Vtg1蛋白水平低于野生型對(duì)照組(圖2C和2D)。

圖2 ar敲除損害雌性斑馬魚肝臟中Vtg的產(chǎn)生Fig. 2 ar-deficiency impairs the hepatic Vtg production in female zebrafish

2.3 ar敲除干擾斑馬魚肝臟中的雌激素信號(hào)通路

肝Vtgs的產(chǎn)生主要源于雌激素受體(Esr)響應(yīng)雌激素的刺激,尤其是雌激素受體中的Esr1[30]。我們發(fā)現(xiàn)ar-/-雌魚肝臟中esr1和esr2b轉(zhuǎn)錄本的水平顯著低于對(duì)照組(圖3A和3C) ,但esr2a的相對(duì)表達(dá)量沒有明顯變化(圖3B)。另一方面,肝臟樣本中的睪酮和雌二醇水平在ar-/-雌魚和對(duì)照組之間沒有顯著變化(圖3D和3E)。這些結(jié)果表明,由于Ar缺乏,雌性斑馬魚肝臟中整體雌激素信號(hào)應(yīng)是下調(diào)的。

圖3 ar敲除對(duì)斑馬魚肝臟中的雌激素信號(hào)通路和性激素水平的影響Fig. 3 Influences of ar-deficiency on the estrogen signaling and gonadal hormone level in the liver of zebrafish females

2.4 ar-/-雌性斑馬魚卵巢特征

由于ar-/-雌魚肝臟的Vtg產(chǎn)生受損,有理由推測(cè)卵巢的營養(yǎng)成分也因此受到影響。在3 mpf 的斑馬魚中,與對(duì)照組相比,我們發(fā)現(xiàn)ar-/-雌魚卵巢的大小和重量都有所下降(圖4A和4B)。我們也發(fā)現(xiàn),ar-/-雌魚的含水量高于對(duì)照組(圖4C)。我們還發(fā)現(xiàn)ar-/-雌魚的卵巢變得明顯透明(圖4A),并同時(shí)伴隨在ar-/-雌性斑馬魚的卵巢中,類胡蘿卜素和總脂水平比對(duì)照組顯著降低(圖4D—F)。

圖4 ar敲除斑馬魚卵巢特性變化Fig. 4 Characterization changes of the ovarian composition in ar-/- females

2.5 ar-/-卵巢中與卵巢發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下調(diào)

選取多個(gè)卵巢發(fā)育相關(guān)基因檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量,其中發(fā)現(xiàn)nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1 (nr4a1),GATA binding protein 4 (gata4),nuclear receptor subfamily 5,group A,member 1a(nr5a1a) 和hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2(hsd11b2)等4個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)在性成熟后,與對(duì)照組相比,ar-/-雌性斑馬魚卵巢中nr4a1、gata4、nr5a1a和hsd11b2的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(圖5),這表明ar敲除顯著損害了許多與卵巢發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。

圖5 ar敲除對(duì)若干重要卵巢發(fā)育關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的影響Fig. 5 Transcriptional expression patterns of the key genes related with fish ovaries in ar-/- zebrafish ovaries

3 討論

3.1 ar對(duì)性腺的發(fā)育不可或缺

在小鼠模型[19,31,32]和斑馬魚模型[20,24]中,Ar或者雄激素信號(hào)通路對(duì)性腺的發(fā)育甚至性別發(fā)育帶來影響。在斑馬魚中,ar缺乏導(dǎo)致雌性比例增加和卵巢早衰。ar-/-斑馬魚的卵巢變得透明,GSI顯著降低,以及卵母細(xì)胞成熟出現(xiàn)缺陷[24],這說明Ar參與卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟。同時(shí),有報(bào)道稱類胡蘿卜素的含量決定了卵巢的鮮艷顏色和卵巢的正常發(fā)育[9—12]。比較ar-/-雌魚和對(duì)照組的卵巢外觀,突變體中小而透明的卵巢表明ar缺乏引起卵巢營養(yǎng)成分的受損和特征的改變。

ar也是人類不孕的相關(guān)基因之一,因此,研究ar在卵巢發(fā)育中的功能,對(duì)解決一些與ar有關(guān)的不孕不育癥狀非常關(guān)鍵。

3.2 ar參與調(diào)控雌激素信號(hào)通路和Vtgs的生成

在肝臟中合成的Vtgs是碳水化合物、脂類、脂溶性維生素和類胡蘿卜素的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體[5,6,13—15],因此,我們針對(duì)ar-/-雌魚中的Vtg生成水平開展研究。在ar-/-雌性斑馬魚的肝臟中,確實(shí)觀察到vtg轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的顯著下降和Vtg1蛋白水平的顯著降低(圖2)。此外,與對(duì)照組相比,ar-/-雌性斑馬魚肝臟中esr1和esr2b的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖3),說明Ar缺乏會(huì)干擾斑馬魚肝臟中的雌激素信號(hào)。然而,E2處理并沒有上調(diào)ar-/-雌性Vtg1的產(chǎn)量(圖1),這表明單獨(dú)增加E2并不能拯救ar突變體的表型。由于esr1已被認(rèn)為是肝臟Vtg產(chǎn)生的主要調(diào)控者,而我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚肝臟中Ar的存在,對(duì)雌激素信號(hào)通路調(diào)控肝臟Vtg合成也是必需的,只是其相關(guān)機(jī)制尚未在本研究中得以探明。

Ar缺乏導(dǎo)致的肝臟Vtg生成缺陷進(jìn)一步支持了ar-/-雌魚卵巢營養(yǎng)成分的改變(圖4)。已有報(bào)道指明類胡蘿卜素在卵巢發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[9,11,13],而ar-/-雌性卵巢中脂質(zhì)和類胡蘿卜素含量顯著降低,因此,Vtg的合成障礙的確影響了ar-/-的卵巢中營養(yǎng)組分,從而導(dǎo)致發(fā)育受損和卵母細(xì)胞成熟。

3.3 ar敲除影響卵巢發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)

性腺發(fā)育是一系列復(fù)雜的發(fā)育過程,一系列的關(guān)鍵基因的依序和適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)是必需的。例如,gata4被認(rèn)為是調(diào)節(jié)小鼠性腺發(fā)育的因子,在顆粒細(xì)胞中表達(dá)并促進(jìn)其增殖[33]。在人類和大鼠中,NR5A1與性腺中的Gata4蛋白相互作用,激活amh的啟動(dòng)子,促進(jìn)性腺發(fā)育。而在斑馬魚中,nr5a1a的表達(dá)又需要amh,所以這3個(gè)基因很可能形成了一個(gè)反饋的通路[17,34,35]。insl3是卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因,在小鼠中,核受體Nr5a1被認(rèn)為是調(diào)節(jié)insl3啟動(dòng)子的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[36,37]。隨后在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)了新的insl3啟動(dòng)子調(diào)控因子Nr4a1[18]。雖然糖皮質(zhì)激素在卵巢生長中的作用尚未得到證實(shí),但糖皮質(zhì)激素在卵母細(xì)胞成熟過程中也表現(xiàn)出活性,有兩種酶參與到皮質(zhì)醇和可的松的轉(zhuǎn)化[38,39]。在此方面,羥類固醇11-β脫氫酶2(Hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 2,Hsd11b2)是參與此過程的兩種酶之一,可將皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為可的松[40]。我們的研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,ar-/-雌魚卵巢中nr4a1、gata4、nr5a1a和hsd11b2的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(圖5)。這表明,ar-/-雌魚中與卵巢發(fā)育相關(guān)的許多關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式都受到ar缺乏的顯著影響,而卵巢營養(yǎng)成分的缺陷則可能是造成這些卵巢發(fā)育障礙的原因,或者是其中的原因之一(圖4)。

4 結(jié)論

基于已觀察到的斑馬魚ar敲除模型上卵巢發(fā)育不良的表型,我們開展了進(jìn)一步的探索。本項(xiàng)工作研究了 Ar缺乏對(duì)斑馬魚卵巢發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)在ar-/-雌魚肝臟中的Vtg生成受到抑制,因此揭示了Ar對(duì)雌魚肝臟Vtg生成的調(diào)控,至少是Ar調(diào)控斑馬魚卵巢發(fā)育和成熟的重要信號(hào)之一,對(duì)該信號(hào)通路在卵巢發(fā)育方面的影響,我們加以簡(jiǎn)單概況(圖6)。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)了ar與肝臟卵黃蛋白原形成之間的聯(lián)系,對(duì)探索ar基因功能提供了一個(gè)新的視角,但是,ar如何具體調(diào)控雌激素信號(hào)通路還需要更多深入研究。

圖6 ar通過影響肝臟Vtgs的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)卵黃發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟Fig. 6 ar regulates vitellogenesis and oocyte maturation via its effects on hepatic Vtg production