夏如馨， 姜 巖， 彭 蕾

(重慶工商大學(xué) 廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067)

傳統(tǒng)的油污染問題依舊廣泛存在且不斷加劇。此外，在政策驅(qū)使下，以油企為代表的產(chǎn)污企業(yè)遺留下來的污染土地發(fā)展成為新問題。主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：其一，隨著中國(guó)工業(yè)化園區(qū)的建設(shè)，出現(xiàn)了很多企業(yè)遷址“入園”事件，舊址土地一般都遭受了較為嚴(yán)重的油污染；其二，在國(guó)家嚴(yán)厲的環(huán)保政策及行業(yè)內(nèi)部技術(shù)升級(jí)的驅(qū)使和推動(dòng)下，部分“土煉油”和低產(chǎn)能等企業(yè)的關(guān)停也遺留了大面積油污染土壤。對(duì)于這些土壤的處置研究在以往基本忽略了重金屬的干擾，而事實(shí)上油污染場(chǎng)地一定伴隨著重金屬污染。Adeniyi和Afolabi[1]較早關(guān)注了二者復(fù)合污染問題，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)加油站、兩個(gè)汽修車間和一個(gè)國(guó)家電站的污染土壤中，均存在石油烴以及Cd、Cr、Cu、Ni和Pb等5種重金屬的混合污染。

發(fā)展至今，人們對(duì)石油烴與重金屬復(fù)合污染問題已經(jīng)有了較為清楚的認(rèn)知。首先，原油本身就含有重金屬，Osuji等[2]及祁魯梁等[3]對(duì)國(guó)內(nèi)外油田原油的灰分進(jìn)行了定性分析，發(fā)現(xiàn)存在Zn、Cu、Pb、Cd、Ni、Mn、Co、V等34種微量金屬。這些金屬元素與石油烴一起構(gòu)成了石油的組分，二者相伴相生[4]；其次，鉆井開采過程中由于鉆井液添加劑、低品質(zhì)重晶石的使用[5]，或者與碎鉆屑一同從地層中攜帶出來，從而引入重金屬污染。在對(duì)鉆井廢棄物的毒性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一些常見的具有危害性的金屬幾乎全部檢測(cè)到了蹤跡，如Zn、Pb、Cu、Cd、Ni、Hg、Ba、Cr等[6]；最后，對(duì)于潤(rùn)滑油而言，由于二烷基二硫代磷酸鋅(ZDDP)等各類含金屬添加劑的使用，以及機(jī)械磨損等過程均會(huì)混入重金屬。同時(shí)，部分重金屬污染土壤也會(huì)伴隨著由機(jī)加工和其他操作引起的油污染[7]。在對(duì)重慶某化工廠的Cr(Ⅵ)污染土壤進(jìn)行采樣分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了Cr(Ⅵ)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)580～940 mg/kg)以外，石油烴的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到18760 mg/kg，比一些油污染場(chǎng)地的含油量還高?？梢姡蜔N和重金屬2種污染物經(jīng)常同時(shí)存在于污染環(huán)境中，并產(chǎn)生復(fù)雜的底物交互作用。不同的重金屬由于具有不同的鍵合度和遷移率而對(duì)微生物和環(huán)境表現(xiàn)出不同的毒性作用；同一重金屬又能以膠體或可溶性絡(luò)合物等形態(tài)存在，從而表現(xiàn)出不同的生物毒性和底物競(jìng)爭(zhēng)特性，使二者的環(huán)境行為發(fā)生改變，影響污染物的跨膜運(yùn)輸及生物降解。

以往，對(duì)于石油類污染場(chǎng)地中的重金屬缺乏足夠的重視，生物修復(fù)研究以生物除油為主，而屏蔽了重金屬的擾動(dòng)。筆者針對(duì)石油烴-重金屬復(fù)合污染問題，綜述了當(dāng)前復(fù)合污染微生物修復(fù)研究現(xiàn)狀。重點(diǎn)論述了石油烴與重金屬的交互作用，剖析了石油烴降解菌在復(fù)合污染環(huán)境中進(jìn)化出的不同金屬抗性機(jī)制，指出在生物修復(fù)領(lǐng)域中大量基礎(chǔ)研究與實(shí)際應(yīng)用的脫節(jié)，提出將重金屬的影響和去除納入到制定油污染場(chǎng)地修復(fù)策略中，推動(dòng)生物修復(fù)技術(shù)走向?qū)嶋H應(yīng)用是未來的發(fā)展方向。

1 重金屬抑制石油烴的生物降解

重金屬在土壤環(huán)境中呈現(xiàn)出復(fù)雜的作用結(jié)果，僅濃度變化就會(huì)對(duì)石油烴的生物降解產(chǎn)生不同影響，不過，抑制作用還是占據(jù)主導(dǎo)[8-14]。多數(shù)研究結(jié)果證實(shí)，隨著金屬濃度的增加，石油烴生物降解效率降低。Oriomah等[11]的研究就具有代表性，Achromobacterxylosoxidans對(duì)Cu(Ⅱ)和廢機(jī)油都表現(xiàn)出耐受性，但當(dāng)二者共存時(shí)，隨著Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度增加至200 mg/L時(shí)，A.xylosoxidans對(duì)廢機(jī)油的降解能力由40%降低到5%。Baltrons等[12]也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，Cr、Co、Pb、Mn、Ni、Cu和Zn等金屬濃度越高，對(duì)微生物降解3～4環(huán)多環(huán)芳烴的抑制作用越明顯。重金屬抑制石油烴生物降解機(jī)制更多地表現(xiàn)為損傷細(xì)胞或抑制細(xì)胞活力[15]。在重金屬環(huán)境中，細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)地吸附和吸收重金屬后會(huì)影響酶蛋白等生物活性物質(zhì)的功能特性；細(xì)胞還可依靠代謝酶和有機(jī)酸等物質(zhì)在胞內(nèi)、胞外還原和絡(luò)合重金屬。這些作用將會(huì)占用細(xì)胞正常的代謝通道，形成與天然底物的競(jìng)爭(zhēng)，細(xì)胞對(duì)重金屬的應(yīng)激響應(yīng)擾動(dòng)了原有的石油烴代謝途徑。因此，重金屬對(duì)石油烴抑制作用的復(fù)雜性體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞代謝的影響上，其作用結(jié)果再抑制石油烴的生物利用。

在現(xiàn)有認(rèn)知中，除了重金屬本身的毒理學(xué)效應(yīng)以外，更多的研究集中在酶蛋白方面。重金屬可以通過抑制石油烴降解酶系來影響其代謝通路。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量濃度100～300 mg/L的Pb(Ⅱ)作用下，Bacillusmalacitensis的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶被誘導(dǎo)，使酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變、催化活性位點(diǎn)被掩蔽，這種作用是通過激發(fā)氧自由基的產(chǎn)生而造成酶蛋白損傷；此外，Pb(Ⅱ)的抑制作用也表現(xiàn)在影響細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng)從而遲滯細(xì)胞的分裂增殖上。加氧酶是多環(huán)芳烴(PAHs)類化合物代謝的關(guān)鍵限速酶，在石油烴代謝通路中起到重要作用[17]。當(dāng)前，對(duì)該酶的研究手段已較為成熟，相關(guān)報(bào)道較多。盡管對(duì)金屬抑制酶蛋白活性的研究相對(duì)較多，但不同的研究體系以及研究角度的不同，對(duì)其機(jī)制的闡述不盡相同，形成普遍共識(shí)的是絕大多數(shù)重金屬對(duì)酶蛋白會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

此外，石油烴代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量水楊酸等有機(jī)酸，這一過程是有機(jī)物代謝的普遍規(guī)律，與重金屬并不存在直接關(guān)聯(lián)，但有機(jī)酸的累積會(huì)降低細(xì)胞對(duì)重金屬逆性脅迫的抗性[18]，導(dǎo)致重金屬對(duì)微生物的抑制作用被放大，最終加劇了對(duì)石油烴生物降解的抑制。因此，在以往的生物修復(fù)研究中，屏蔽重金屬的處理模式不會(huì)是最優(yōu)解決方案。

2 重金屬促進(jìn)石油烴的生物降解

重金屬抑制細(xì)胞代謝是普遍存在的一種生物毒理現(xiàn)象，不過，重金屬的作用并非完全體現(xiàn)在其生物學(xué)毒性上，當(dāng)前的部分研究也發(fā)現(xiàn)了其對(duì)石油烴降解具有促進(jìn)作用。個(gè)別重金屬在適宜濃度等特定環(huán)境中對(duì)細(xì)胞毒性效應(yīng)小，而且可以調(diào)節(jié)微生物對(duì)石油烴的吸附作用，如通過群體感應(yīng)來調(diào)控生物膜的形成和胞外多糖產(chǎn)生等過程[19]。在抑制與調(diào)控兩種作用競(jìng)爭(zhēng)下，使重金屬表現(xiàn)出提高石油烴的可生物降解性。表1總結(jié)了當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的對(duì)石油烴降解具有促進(jìn)作用的重金屬。其中，該現(xiàn)象較多地發(fā)生在Cu(Ⅱ)上[19-22]。Ma等[20]發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)的存在可以促進(jìn)真菌Acremoniumsp. P0997對(duì)蒽的吸附，使蒽在水和菌絲之間的相分配發(fā)生改變，當(dāng)Cu(Ⅱ)質(zhì)量濃度增加至600 mg/L時(shí)，蒽吸附系數(shù)從0.75 L/g遞增至2.25 L/g，吸附系數(shù)與Cu(Ⅱ)濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。2種細(xì)胞吸附行為競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果造成了這一現(xiàn)象。重金屬與微生物表面之間存在靜電吸引力，而PAHs則以范德華力吸附于菌體表面，顯然，2種作用力差異明顯，導(dǎo)致重金屬優(yōu)先占據(jù)細(xì)胞表面的吸附區(qū)[23]；隨著金屬陽離子濃度的增加，細(xì)胞表面電荷逐漸被中和而呈現(xiàn)出近中性狀態(tài)，此時(shí)疏水性的PAHs更易于被吸附。在重金屬占據(jù)吸附區(qū)的初期，PAHs存在一個(gè)吸附抑制過程，只是細(xì)胞對(duì)PAHs的吸附作用原本就非常有限，其生物降解主要依賴于酶系的生物氧化[24]，所以抑制結(jié)果并不明顯。此外，對(duì)于PAHs與重金屬的交互作用存在另外一種認(rèn)知：由于陽離子-π[25]作用力使PAHs傾向于吸附在聚集于細(xì)胞表面的重金屬上，提高了細(xì)胞對(duì)PAHs的吸附。不過，這一研究結(jié)論僅有個(gè)別報(bào)道，這種新型分子間作用力對(duì)復(fù)合污染物的去除機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

上述研究存在著一個(gè)共性問題，隨著金屬濃度的增加而呈現(xiàn)出一致的促進(jìn)作用，但對(duì)于抑制濃度未做報(bào)道。而實(shí)際上，同一金屬離子處于不同濃度水平時(shí)，很可能表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)。趙曉秀等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中存在23.7 mg/kg的低濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cu(Ⅱ)時(shí)，正十六烷的降解率從不含Cu(Ⅱ)的59.0%提高到66.0%；而當(dāng)Cu(Ⅱ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到47.4和237.0 mg/kg時(shí)，正十六烷的降解率又分別下降至49.0%和39.0%。這一現(xiàn)象可能由于降解十六烷的優(yōu)勢(shì)微生物是Cu(Ⅱ)抗性菌株，能夠耐受一定的Cu(Ⅱ)毒性，而非優(yōu)勢(shì)的其他土著微生物則是Cu(Ⅱ)敏感性菌株，其活性受到Cu(Ⅱ)抑制，減少了對(duì)土壤中生長(zhǎng)型底物的競(jìng)爭(zhēng)，從而有利于優(yōu)勢(shì)菌攝取各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)十六烷的降解；但當(dāng)金屬濃度超過閾值水平時(shí)，會(huì)對(duì)所有抗性和敏感性微生物產(chǎn)生各種生理、生化和遺傳毒性效應(yīng)，抑制石油烴的微生物降解。

從表1可見，除了Cu(Ⅱ)以外，Pb(Ⅱ)也對(duì)石油烴降解具有促進(jìn)作用。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Pb(Ⅱ)的質(zhì)量濃度從150 mg/L降低到50 mg/L時(shí)，B.malacitensis胞外和胞內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了6.0×104和3.0×104。Pb(Ⅱ)誘導(dǎo)菲的降解基因簇表達(dá)，刺激了關(guān)鍵開環(huán)酶的釋放；同時(shí)，低濃度的Pb(Ⅱ)刺激產(chǎn)生的毒物興奮效應(yīng)可引起蛋白質(zhì)含量增加，促進(jìn)了酶-金屬-底物三元復(fù)合物的形成，最終提高了菲的降解速率；而當(dāng)Pb(Ⅱ)過量時(shí)，則會(huì)與Mg(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)等營(yíng)養(yǎng)元素競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)成分中的巰基(-SH)，又抑制了酶的活性。對(duì)于芽孢桿菌屬的研究，筆者所在課題組在近期也發(fā)現(xiàn)了一株Bacillustropicus，但該菌僅在Cu(Ⅱ)存在下對(duì)潤(rùn)滑油的降解具有一定促進(jìn)作用，而當(dāng)另外3種金屬Pb(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅵ)存在時(shí)，均產(chǎn)生了抑制作用，體現(xiàn)了重金屬生物學(xué)效應(yīng)的復(fù)雜性。另外發(fā)現(xiàn)的一種有別于Cu(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)的作用機(jī)制是在含Cd(Ⅱ)的體系中。Cd(Ⅱ)和芘會(huì)脅迫細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)來誘導(dǎo)O.radicata[27]產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，損害細(xì)胞活性，但高濃度Cd(Ⅱ)又會(huì)誘導(dǎo)抗氧化酶(SOD、CAT、POD)更迅速地分泌，可以強(qiáng)烈抑制由于ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，二者的競(jìng)爭(zhēng)形成了隨金屬濃度變化的促進(jìn)效應(yīng)，因此，表1中芘的去除率提高了9%?？傊?，微生物為應(yīng)對(duì)重金屬毒性產(chǎn)生的不同抗性機(jī)制使復(fù)合污染環(huán)境中石油烴的降解變得更為復(fù)雜，利用和提高重金屬積極作用，削弱和抵消其脅迫是生物修復(fù)技術(shù)得以發(fā)展的優(yōu)選策略。

表1 重金屬對(duì)石油烴降解的促進(jìn)作用Table 1 The promotion effect of heavy metals on the degradation of petroleum hydrocarbons

3 耐受重金屬毒性降解石油烴

油污染場(chǎng)地生物除油研究是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。利用微生物對(duì)重金屬具有耐受性進(jìn)行油類污染物的生物降解是諸多報(bào)道的研究思路。無論是否考慮重金屬的影響，也無論是利用土著微生物還是外源菌，在客觀上，只有適應(yīng)復(fù)合污染環(huán)境的微生物才能有效代謝石油烴。表2為污染環(huán)境中篩選出的耐受重金屬石油烴降解菌。在表2中，從油污染場(chǎng)地中選育出的土著微生物普遍具有環(huán)境適應(yīng)性以及石油烴降解能力。這一功能特性的形成被認(rèn)為與細(xì)胞內(nèi)形成的特有基因有關(guān)，即DNA分子中一般都含有抗性基因或降解基因[30-31]。其中，Oyetibo等[32-33]的研究頗具代表性。除Burkholderiacepacia對(duì)于原油和蒽都表現(xiàn)出較高的降解能力外，另外2株P(guān)seudomonasaeruginosa和Corynebacteriumkutscheri對(duì)難降解的蒽的去除率只有50%左右，其較高的原油去除率則應(yīng)體現(xiàn)在對(duì)其他石油烴組分的降解上。包括該報(bào)道在內(nèi)表2中的各研究均未觸及重金屬與石油烴的交互作用，但這并不意味著不存在促進(jìn)或抑制作用，特別是在Oyetibo等的研究體系中，在Ni和Co的存在下，菌株呈現(xiàn)出很高的降解活力原因值得進(jìn)一步研究。

在實(shí)地修復(fù)時(shí)，可以采用將具有重金屬抗性和石油烴降解能力的組合微生物功能菌群應(yīng)用于復(fù)合污染土壤的方法[40]。Alisi等[41-42]利用混合菌群修復(fù)了在Mn、Zn、Cd、Cr、Pb多種金屬存在下的復(fù)合污染土壤，經(jīng)過15 d的修復(fù)，直鏈碳?xì)浠衔?C12～C20)的降解率為65%～75%，其中，頑固的異戊二烯烷烴類組分(C15～C18)去除率也達(dá)到了50%～60%。他們從微生物群落分析入手，發(fā)現(xiàn)在重金屬和有機(jī)毒性脅迫下，外源菌群變得非?；钴S，推動(dòng)整個(gè)微生物群落表現(xiàn)出高的代謝活性。在該研究中，外源菌群的功效可能來自于對(duì)能量流的特異性捕獲，激活整個(gè)微生物群落啟動(dòng)生物降解。根據(jù)DGGE(變性梯度凝膠電泳)剖面對(duì)生態(tài)指標(biāo)的分析，微生物群落的豐度、結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，污染物的脅迫影響主要體現(xiàn)在群落代謝特性上，而非對(duì)結(jié)構(gòu)特性產(chǎn)生影響，亦即土壤環(huán)境中的微生物多樣性并未發(fā)生改變。這一報(bào)道從污染生態(tài)學(xué)角度切入，利用Biolog?ECOPlates研究了生物修復(fù)過程中污染場(chǎng)地的微生物群落變化，極具特色。但是，研究結(jié)論值得推敲。一般認(rèn)為，環(huán)境在遭受污染后，微生物群落的多樣性趨于簡(jiǎn)單化，而微生物的數(shù)量在石油烴進(jìn)入環(huán)境后會(huì)呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，其原因很簡(jiǎn)單，有機(jī)污染物既提供了碳源等生長(zhǎng)因子，也產(chǎn)生了有機(jī)毒性，在長(zhǎng)期作用下后者導(dǎo)致種群種類減少，前者則刺激了耐受性微生物的生長(zhǎng)繁殖。該研究中所得結(jié)論可能存在一定局限性，問題出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)用的土壤樣品。實(shí)驗(yàn)用土取自于含有少量Cr、Ni、Cu、Mn等金屬的廢棄農(nóng)田，之后復(fù)配了柴油和高濃度的Zn、Pb，穩(wěn)定3 d后開展了外源菌的修復(fù)研究。除了前述長(zhǎng)期選擇作用將導(dǎo)致微生物群落簡(jiǎn)單化以外，在外源菌的使用上也存在對(duì)土著微生物形成競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)的可能性，繼而抑制部分耐受微生物的生長(zhǎng)和代謝，若這種選擇性競(jìng)爭(zhēng)存在于污染環(huán)境中，也會(huì)造成微生物種類的減少。

表2 污染環(huán)境中篩選出的耐受重金屬石油烴降解菌Table 2 Heavy metal-tolerant petroleum hydrocarbon degrading bacteria screened out in polluted environment

無論如何，依靠具有耐受重金屬特性的微生物降解石油烴、修復(fù)油污染場(chǎng)地是以往的主流研究，并且在大多數(shù)報(bào)道中均屏蔽了重金屬的影響。在筆者看來，利用復(fù)合菌群技術(shù)處置復(fù)合污染場(chǎng)地不失為一種有效手段，其實(shí)用性強(qiáng)，符合當(dāng)前人們的認(rèn)知水平。

4 石油烴-重金屬的共去除

微生物對(duì)石油烴與重金屬共去除的報(bào)道很少，但也逐漸發(fā)現(xiàn)Pseudarthrobacterphenanthrenivorans[43]、Sphingomonaspaucimobilis[44]、CitrobacterFreundii[45]、StenotrophomonasMaltophilia[46]、Pseudomonasgessardii[47]等菌株在對(duì)重金屬的應(yīng)激反應(yīng)中進(jìn)化出相應(yīng)的防御系統(tǒng)，它們不僅能夠耐受重金屬毒性，還能在代謝石油烴過程中還原轉(zhuǎn)化和吸附固定重金屬，實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)、無機(jī)毒性的共去除，如圖1所示。其中Cr在環(huán)境中多以Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)形態(tài)存在，依靠石油烴降解菌的代謝活動(dòng)可以將Cr(Ⅵ)還原為低價(jià)態(tài)，從而極大削弱鉻酸鹽生物毒性；與固定作用相比，還原轉(zhuǎn)化作用直接削弱了重金屬毒性，這也是抗性生物最主要的解毒機(jī)制。對(duì)于其他金屬元素而言，多以二價(jià)等穩(wěn)定態(tài)存在，難以實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移的氧化還原反應(yīng)，決定了其生物去除只能依靠吸附、吸收、絡(luò)合等固定作用。當(dāng)然，固定作用也可以削弱環(huán)境污染，但重金屬的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞生理活性產(chǎn)生消極影響。與此同時(shí)，可給態(tài)金屬離子的減少又緩解了對(duì)細(xì)胞的脅迫，正是一系列綜合作用的結(jié)果促成了生物降解石油烴協(xié)同去除重金屬。

R—Alkly chain圖1 微生物對(duì)石油烴-重金屬共去除作用Fig.1 Microbial co-removal effect on petroleum hydrocarbons and heavy metals

4.1 降解石油烴協(xié)同轉(zhuǎn)化重金屬

在復(fù)合污染環(huán)境中，微生物的代謝產(chǎn)物或者石油烴本身可以作為電子供體[48]以實(shí)現(xiàn)重金屬的還原反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)2種污染物進(jìn)行解毒。在Huang等[49]對(duì)萘和Cr(Ⅵ)的共去除研究中，首次報(bào)道了參與萘降解的酶蛋白NahG(水楊酸羥化酶)能夠還原Cr(Ⅵ)，使PseudomonasbrassicacearumLZ-4可以同時(shí)降解6 mmol/L的萘和500 μmol/L的Cr(Ⅵ)。NahG原本是利用FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)作為輔因子將水楊酸轉(zhuǎn)化為兒茶酚，如圖2中A、B、C 3條路徑所示，這一過程伴隨著電子從NADH(還原型輔酶Ⅰ)轉(zhuǎn)移到氧分子上。但當(dāng)Cr(Ⅵ)存在時(shí)，電子轉(zhuǎn)移則遵循了D途徑，直接轉(zhuǎn)移到了Cr(Ⅵ)上，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)鉻酸鹽的還原。此外，王衍麗[43]發(fā)現(xiàn)，rhd是編碼PAHs降解酶蛋白的關(guān)鍵基因，而chrA基因則與耐受和去除重金屬有關(guān)，只有這兩個(gè)基因同時(shí)存在于細(xì)胞內(nèi)才可能發(fā)生共去除效應(yīng)；繼而利用IMG/M(The integrated microbial genomes with microbiome samples)的全基因組和宏基因組數(shù)據(jù)庫(Metagenome database)挖掘出13個(gè)菌門、20個(gè)菌綱、58個(gè)菌目、123個(gè)菌科、401個(gè)菌屬和1164個(gè)菌種同時(shí)具有這兩種基因?；诨蛲诰蛐畔?，利用一株P(guān).phenanthrenivorans菌證實(shí)了在對(duì)質(zhì)量濃度為100 mg/L菲的降解過程中伴隨著Cr(Ⅵ)的還原。另外一種研究方法采用了變性梯度凝膠電泳技術(shù)，也收到了很好的研究結(jié)果。Ibarrolaza等[44]發(fā)現(xiàn)，S.paucimobilis對(duì)Cr(Ⅵ)形成了明顯的聚驅(qū)應(yīng)激，在S.paucimobilis質(zhì)量濃度低于3.2 mg/L時(shí)，Cr(Ⅵ)和質(zhì)量濃度為200 mg/L的菲可以被完全去除。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于生物降解石油烴協(xié)同轉(zhuǎn)化重金屬的研究具有重要意義，畢竟，共去除的核心問題在于污染環(huán)境中存在特異性功能型的微生物，這是從事相關(guān)研究乃至解決實(shí)際問題的物質(zhì)基礎(chǔ)。

NADH—Reduced form coenzyme;NAD+—Deelectron-reducing coenzyme圖2 水楊酸羥化酶(NahG)還原Cr(Ⅵ)過程[49]Fig.2 Salicylate hydroxylase (NahG) reductionCr(Ⅵ) process[49]

4.2 降解石油烴協(xié)同固定重金屬

石油烴降解菌除了可以通過生長(zhǎng)代謝活動(dòng)改變金屬離子的價(jià)態(tài)，將其轉(zhuǎn)化為低毒或者無毒的狀態(tài)，還可以通過吸附、絡(luò)合等作用改變重金屬的形態(tài)和移動(dòng)性，從而緩解重金屬毒性對(duì)生物降解石油烴的脅迫，實(shí)現(xiàn)生物降解石油烴同時(shí)去除重金屬等一系列連鎖反應(yīng)。固定作用可以直接利用細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的官能團(tuán)來吸附游離的正電荷金屬離子。孫業(yè)政[26]發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)石油烴種類不會(huì)對(duì)P.chrysosporium吸附重金屬產(chǎn)生影響，相反在質(zhì)量濃度為64 mg/L萘存在下，真菌在降解萘的過程中對(duì)質(zhì)量濃度為50 mg/L的Pb(Ⅱ)吸附率提高到75.4%。當(dāng)前，對(duì)于真菌的吸附固定能力高于細(xì)菌已經(jīng)得到越來越多的實(shí)驗(yàn)支持。Maddela等[50]就發(fā)現(xiàn)與細(xì)菌Bacillusthuringiensis和Bacilluscereus對(duì)Cu(Ⅱ)的吸附率分別為7.9%和36.3%相比，真菌Geomycessp.對(duì)銅的吸附率可以達(dá)到97.3%，同時(shí)還表現(xiàn)出了對(duì)原油的高效降解率。真菌比表面積較大更容易與周圍環(huán)境發(fā)生物理接觸，尤其是細(xì)胞壁多糖的甘露糖醛酸和古糖醛酸中的高羧基含量提高了對(duì)重金屬的吸附。這種通過細(xì)胞表面官能團(tuán)吸附固定重金屬的報(bào)道越來越多，這是細(xì)胞固有的特性，當(dāng)然不局限在復(fù)合污染環(huán)境中。細(xì)胞在吸附重金屬后，還可以通過膜表面酶或者借助硫酸鹽等離子通道實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，被固定在細(xì)胞器內(nèi)，或與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、絡(luò)合素、多肽結(jié)合形成沉淀而被固定。近年來，金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)在絡(luò)合重金屬方面受到越來越多的關(guān)注。這是一種普遍存在于生物體內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白，其中富含半胱氨酸的短肽，對(duì)多種重金屬有高度親和性。如半胱氨酸殘基的硫醇基團(tuán)可以與Cd(Ⅱ)結(jié)合形成金屬-硫代鹽配合物，從而削弱其毒性[51]。這種由重金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有運(yùn)輸和降低有毒金屬作用的蛋白質(zhì)，對(duì)于隔離固定金屬離子起到重要作用。

除了上述表面吸附和胞內(nèi)積累機(jī)制以外，微生物在代謝石油烴過程中分泌的鐵載體和表面活性劑等代謝產(chǎn)物也可以改變重金屬形態(tài)[52]。如Fusariumsolani在代謝芘的同時(shí)可以產(chǎn)生鐵載體類化合物固定Cu、Zn、Cd、Ni、Pb等重金屬[53]；Pseudomonassp.和Burkholderiasp.等代謝石油烴產(chǎn)生的鼠李糖脂表面活性劑可以螯合Cd(Ⅱ)等[54]?？傊瑢?duì)于石油烴與重金屬的共去除作用的認(rèn)識(shí)還非常有限，但這種作用是對(duì)污染場(chǎng)地進(jìn)行生物修復(fù)最佳的解決方案，特別在重金屬類污染物負(fù)荷較高時(shí)尤為重要。不過，當(dāng)前的研究水平尚無法形成穩(wěn)定的共去除技術(shù)，主要存在兩個(gè)瓶頸問題：其一，缺乏高效的物質(zhì)基礎(chǔ)；其二，成本控制問題。當(dāng)然，在生物修復(fù)領(lǐng)域，環(huán)境條件始終是無法回避的現(xiàn)實(shí)問題，一定程度地限制了該技術(shù)的適用性。筆者所在課題組[55]在石油烴和重金屬共去除方面，針對(duì)潤(rùn)滑油和Cr(Ⅵ)開發(fā)出Lysinibacillusfusiformis功能型菌種資源，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)二者的共去除，但就目前進(jìn)展來看，要想提高修復(fù)效率就要增加助劑成本，而為了控制成本又會(huì)犧牲去除率，因此，共去除技術(shù)還有很長(zhǎng)的路要走，但也的確是最優(yōu)的解決方案。

5 結(jié) 語

建立油污染環(huán)境伴隨重金屬污染的意識(shí)具有重要意義。在油污染環(huán)境中，重金屬也以各種途徑進(jìn)入到污染場(chǎng)地中，形成了石油烴與重金屬的復(fù)合污染，在實(shí)地修復(fù)或油污染修復(fù)研究中需要統(tǒng)籌考慮。重金屬與石油烴間會(huì)形成復(fù)雜的交互作用，往往并存著誘導(dǎo)促進(jìn)作用與毒性抑制作用。在多數(shù)情況下，重金屬的抑制作用占據(jù)主導(dǎo)，影響了細(xì)胞對(duì)石油烴的降解；不過，在部分研究體系中發(fā)現(xiàn)，Cu、Cd和Pb等金屬也可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的吸附作用或分泌抗氧化酶等機(jī)制而對(duì)石油烴降解產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。

以往對(duì)于復(fù)合污染認(rèn)知的不足限制了生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展，由于缺乏共去除技術(shù)而形成了使用單一污染物處置技術(shù)來應(yīng)對(duì)復(fù)合污染的局面，而為實(shí)現(xiàn)修復(fù)目標(biāo)只能增加修復(fù)成本，這種以犧牲處置成本為代價(jià)的修復(fù)研究只會(huì)把生物修復(fù)技術(shù)帶入到?jīng)]有前途的發(fā)展道路。針對(duì)復(fù)合污染問題，利用特異性石油烴降解菌和重金屬抗性菌解決復(fù)合污染問題不失為一種切實(shí)可行的手段，當(dāng)然，在生物降解石油烴過程中，能夠協(xié)同轉(zhuǎn)化、吸附、固定重金屬以實(shí)現(xiàn)二者的共去除，是最理想的修復(fù)策略之一，有助于推動(dòng)生物修復(fù)技術(shù)的穩(wěn)定應(yīng)用，成為該領(lǐng)域的發(fā)展出路。