杜文佳 何良志 劉眾成 詹紅偉 姜金

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院（甘肅省骨科臨床醫(yī)學(xué)研究中心），甘肅 蘭州 730030

伴隨人口老齡化加劇，骨質(zhì)疏松引起的相關(guān)問(wèn)題逐漸成為社會(huì)的重大負(fù)擔(dān)，已演變?yōu)閲?yán)重的公共衛(wèi)生事件[1，2］。目前研究表明，維持骨量由骨形成、骨重塑等生理進(jìn)程共同維系動(dòng)態(tài)平衡[3］。當(dāng)骨穩(wěn)態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡被打破，隨之會(huì)出現(xiàn)骨量下降、骨骼過(guò)度礦化等病理過(guò)程[4］。然而，骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前仍不明確。流體剪切應(yīng)力（fluid shear stress，F(xiàn)SS）在對(duì)抗骨質(zhì)疏松的發(fā)生及進(jìn)程中起著不容忽視的重要作用[5，6］。骨骼的機(jī)械負(fù)荷可以通過(guò)間質(zhì)液流動(dòng)產(chǎn)生的FSS傳遞至成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，這種流體特性在骨細(xì)胞和襯在小梁周?chē)某晒羌?xì)胞表面產(chǎn)生剪切應(yīng)力，剪切應(yīng)力傳遞各種生化信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，最終發(fā)揮生物學(xué)效能[7］。2010年Coste B等[8］作者首先在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)一種快速適應(yīng)的機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道，并將其命名Piezo1（Fam38A）。當(dāng)前研究認(rèn)為Piezo1在調(diào)控并參與骨質(zhì)疏松進(jìn)程中起著重要作用[9-11］。2017年Sugimoto A等[9］作者發(fā)現(xiàn)Piezo1對(duì)骨骼內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持及成骨分化具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)Piezo1機(jī)械敏感性陽(yáng)離子通道或許在骨質(zhì)疏松及骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10］。Wang L等[11］發(fā)現(xiàn)Piezo1主要通過(guò)在成骨細(xì)胞中的信號(hào)傳遞作用影響破骨細(xì)胞活性而在骨組織中發(fā)揮作用。Song T等[12］發(fā)現(xiàn)Piezo1介導(dǎo)的成骨細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，利于骨形成。然而，Piezo1是否參與成骨細(xì)胞的增殖過(guò)程以及其相關(guān)的分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。

細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架系統(tǒng)，其在維持正常細(xì)胞形態(tài)中起重要作用[13］。在成骨細(xì)胞中，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白在對(duì)機(jī)械刺激的感知中發(fā)揮重要作用[14］。Suzuki H等[15］發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中的細(xì)胞骨架的功能對(duì)受機(jī)械應(yīng)力調(diào)控的骨形成過(guò)程十分關(guān)鍵。然而，迄今為止，關(guān)于FSS如何介導(dǎo)細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不明確，仍缺乏相關(guān)研究證實(shí)Piezo1通道蛋白是否會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)中，我們使用課題組自行研發(fā)的FSS加載裝置（專(zhuān)利號(hào)：ZL201520-637211.6）該FSS加載裝置由6通道平行小室構(gòu)成，通過(guò)計(jì)算機(jī)監(jiān)控實(shí)時(shí)加載的FSS大小，由計(jì)算機(jī)監(jiān)控系統(tǒng)、儲(chǔ)液系統(tǒng)、加載系統(tǒng)以及脈管系統(tǒng)構(gòu)成[16，17］。在體外對(duì)MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞作用，探究Piezo1介導(dǎo)的FSS對(duì)成骨細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。我們提出如下假設(shè)：Piezo1通道蛋白介導(dǎo)的FSS通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞骨架重組上調(diào)成骨細(xì)胞增殖。本研究擬使用FSS加載裝置探究FSS與Piezo1的具體作用關(guān)系，并探討Piezo1與成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架蛋白之間的上下游關(guān)系及具體作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 器材與儀器 研究所需MC3T3-E1成骨細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)北京協(xié)和細(xì)胞技術(shù)資源中心。試劑：α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)），胎牛血清（FBS）（Gibco，美國(guó)），胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），青霉素-鏈霉素溶液100×、磷酸鹽緩沖液（PBS）、4%多聚甲醛、Triton-×100（Beyotime，中國(guó)），DAPI染色液（Biosharp，中國(guó)），Piezo1一抗、PCNA一抗、MCM2一抗、Cyclin D1一抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔熒光二抗-488（Proteintech，中國(guó)），EdU染色試劑盒（Rebobio，中國(guó)），CytochalasinD（Topscience，中國(guó)），Yoda1、GsMTx4（Tocris，英國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1成骨細(xì)胞培養(yǎng)于含有1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基（α-MEM∶FBS=9∶1）中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入4mL完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀(guān)察一次，細(xì)胞增長(zhǎng)至90%密度進(jìn)行1∶2傳代。

1.3 細(xì)胞干預(yù) 按課題組既往操作將細(xì)胞置于FSS加載裝置中，調(diào)整加載參數(shù)，待加載完成后取出玻片進(jìn)行下一步操作[18］。Piezo1激動(dòng)劑Yoda1溶解于DMSO，并配置成100μmol/L濃度，將其加入需要進(jìn)行干預(yù)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶并使最終濃度為10μmol/L，作用2h。Piezo1抑制劑GsMTx4溶解于PBS并配置成10μmol/L濃度，將其加入需要進(jìn)行干預(yù)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并使最終濃度為4μmol/L，作用0.5h。

1.4 免疫熒光及鬼筆環(huán)肽染色 使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定30min（室溫），PBS清洗三遍，將細(xì)胞置于1%Triton-×100中通透30min（室溫），PBS清洗三遍，然后將細(xì)胞置于10%山羊封閉血清封閉30min（37℃），PBS清洗三遍，將細(xì)胞置于Piezo1一抗（1∶300）中過(guò)夜（4℃），PBS清洗五遍，然后將細(xì)胞置于熒光二抗（-488）中染色1h（37℃），PBS清洗五遍，將細(xì)胞置于DAPI染色液中15min（37℃），在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞。

1.5 EdU染色 將干預(yù)后的MC3T3-E1細(xì)胞種植在直徑12mm的蓋玻片，分別置于24孔板內(nèi)，每孔滴加200μLEdU染液，37℃水浴鍋內(nèi)放置1h。吸棄EdU染液，PBS洗2次，3min/次，每孔加0.5mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫靜置30min。吸棄甲醛，每孔加入0.5mL 1g/L甘氨酸中和醛基，室溫?fù)u床搖洗5min。吸棄甘氨酸溶液，PBS洗2次，3min/次，每孔滴加0.5mL 0.5%Triton×-100，室溫?fù)u床放置10min。PBS搖洗2次，3min/次，每孔加入200μL染液，避光室溫?fù)u床放置30min。吸棄反應(yīng)液，再次滴加0.5mL 0.5%Triton×-100通透液，清洗2次，10min/次，滴加0.5mL甲醇洗1次，5min，PBS洗1次，5min。每孔加入200μL Hoechst染液，室溫、避光搖床放置30min，棄反應(yīng)液，PBS洗2次，3min/次，隨后將蓋玻片取出，熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.6 Western Blot使用RIPA細(xì)胞裂解液與PMSF以100∶1比例配置裂解液，向干預(yù)完成的細(xì)胞中加入1.0mL裂解液，冰上裂解30min，12 000rpm離心20min后棄去沉淀。向剩余裂解液中加入1/3的4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液。蛋白在10%SDS-PAGE膠中120V電泳，待電泳完成后350 mA恒流轉(zhuǎn)印30min，封閉1h后將轉(zhuǎn)印膜置于相應(yīng)一抗中4℃過(guò)夜，取出轉(zhuǎn)印膜并置于相應(yīng)二抗中作用1h。拭干轉(zhuǎn)印膜后滴加ECL發(fā)光液并曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 定量分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。所有數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（M±SD）呈現(xiàn)。其次使用雙尾t-檢驗(yàn)或單因素方差分析計(jì)算是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并繪制統(tǒng)計(jì)圖；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Image-J用于計(jì)算Western blot條帶灰度值。Adobe Illustrator（2019版本，美國(guó)）進(jìn)行圖像組裝及成圖。

2 結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度循環(huán)FSS對(duì)成骨細(xì)胞Piezo1表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果表明未加力時(shí)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白處于低表達(dá)狀態(tài)，隨著施加不同強(qiáng)度FSS，細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)呈先增后減的趨勢(shì)，6dyne/cm2時(shí)表達(dá)量最高，與未加力組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），后文加載FSS強(qiáng)度設(shè)定為6dyne/cm2。加載9dyne/cm2、12dyne/cm2FSS時(shí)，與未加力組相比仍有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），但較加載6dyne/cm2力時(shí)有所下降。而當(dāng)FSS加載到15dyne/cm2、18dyne/cm2時(shí)，Piezo1蛋白表達(dá)量下降，這可能與強(qiáng)FSS致細(xì)胞膜破壞有關(guān)。見(jiàn)圖1。

圖1 Western Blot檢測(cè)不同強(qiáng)度FSS對(duì)Piezo1蛋白表達(dá)的影響

2.2 Yoda1和GsMTx4對(duì)成骨細(xì)胞Piezo1蛋白的影響早期研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1蛋白激活劑Yoda1和抑制劑GsMTx4對(duì)細(xì)胞的最適作用時(shí)間分別為3h和2h。對(duì)成骨細(xì)胞干預(yù)不同濃度Yoda1和GsMTx4、免疫熒光染色檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)結(jié)果如圖2示，Yoda1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)，而20μM組相比于其他各濃度組Piezo1蛋白表達(dá)更高。同樣，GsMTx4則抑制細(xì)胞內(nèi)Piezo1表達(dá)，相比之下，0.5μM組內(nèi)Piezo1蛋白抑制最明顯。

圖2 免疫熒光檢測(cè)不同濃度Yoda1和GsMTx4對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白影響

2.3 Piezo1上調(diào)成骨細(xì)胞增殖 如圖3所示，對(duì)成骨細(xì)胞分別以Yoda1（Piezo1特異性激活劑，20μM，3h）、DMSO（Piezo1溶劑）、GsMTx4（Piezo1特異性抑制劑，0.5μM，2h）干預(yù)，Western Blot檢測(cè)Piezo1、PCNA、MCM2、Cyclin D1的表達(dá)。結(jié)果顯示，Yoda1可促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.001，圖3B），GsMTx4則明顯下調(diào)Piezo1蛋白（P＜0.001，圖3B）表達(dá)，上調(diào)Piezo1蛋白后成骨細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白明顯上調(diào)（PCNA∶P＜0.01、MCM2∶P＜0.01、Cyclin D1∶P＜0.001，圖3C-E），而沉默Piezo1蛋白則抑制成骨細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)（PCNA∶P＜0.01、MCM2∶P＜0.05、Cyclin D1∶P＜0.001，圖3C-E），溶劑DMSO則不會(huì)影響Piezo1蛋白及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)（圖3B-E）。

圖3 Western Blot檢測(cè)Piezo1蛋白對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

EdU染色觀(guān)察成骨細(xì)胞增殖，如圖4所示，Yoda1組成骨細(xì)胞增殖率明顯高于空白組，與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖4B）。GsMTx4組細(xì)胞增殖率則低于空白組（P＜0.05，圖4B）。

圖4 EdU染色觀(guān)察Piezo1蛋白對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

2.4 FSS及Piezo1蛋白對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響相比于空白組，F(xiàn)SS組細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力絲陽(yáng)性率明顯增高（P<0.001）。給予GsMTx4干預(yù)后，與FSS組相比，F(xiàn)SS+GsMTx4組內(nèi)成骨細(xì)胞應(yīng)力絲陽(yáng)性率明顯降低（P<0.001）。證明FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架重組，而抑制Piezo1蛋白則抑制成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架重組。見(jiàn)圖5。

圖5 鬼筆環(huán)肽染色觀(guān)察FSS與Piezo1對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的影響

2.5 FSS通過(guò)細(xì)胞骨架上調(diào)成骨細(xì)胞增殖 如圖6所示，EdU染色顯示空白組、FSS組以及FSS+骨架蛋白F-actin特異性抑制劑細(xì)胞松弛素D（CytoD）組中成骨細(xì)胞增殖表現(xiàn)，與空白組相比，F(xiàn)SS組增殖率明顯升高（P<0.001，圖6B），使用CytoD進(jìn)行干預(yù)后，相較于FSS組細(xì)胞增殖率出現(xiàn)顯著下調(diào)（P<0.001，圖6B）。證明抑制骨架蛋白后抑制成骨細(xì)胞增殖。

圖6 FSS通過(guò)細(xì)胞骨架上調(diào)成骨細(xì)胞增殖的EdU染色

3 討論

本研究主要發(fā)現(xiàn)Piezo1介導(dǎo)的FSS上調(diào)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白以及增殖率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架在Piezo1介導(dǎo)的FSS上調(diào)成骨細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，抑制骨架蛋白表達(dá)可以顯著降低生物力學(xué)信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。

Piezo1機(jī)械敏感性離子通道是促進(jìn)胚胎發(fā)育和成人骨環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)械傳感器。《自然》雜志最新列出的2021年值得關(guān)注的7種技術(shù)中指出，除了生長(zhǎng)因子和其他分子，細(xì)胞還可以感知物理力，這種力可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖以及癌癥發(fā)生，在感受力學(xué)刺激的諸多分子中，Piezo1離子通道被提到首位[19］。之前我們的研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞細(xì)胞膜上Piezo1通道可以感受FSS并對(duì)FSS刺激做出反應(yīng)[10，16，20］。雖然后續(xù)有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Piezo1蛋白調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖及在小鼠骨骼發(fā)育中的關(guān)鍵作用，這些研究分別從不同層面闡明了Piezo1在成骨細(xì)胞中的作用，但是關(guān)于流體剪切力介導(dǎo)Piezo1調(diào)控成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制知之甚少，而且流體剪切力作用后，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的方式也不十分不明確[11，12，21，22］。

關(guān)于其他細(xì)胞的研究中已發(fā)現(xiàn)流體剪切力對(duì)Piezo1通道的影響，如Wang S等[23］發(fā)現(xiàn)，流體剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ATP釋放和P2Y2/Gq/G11介導(dǎo)的信號(hào)傳遞中，Piezo1參與了下游磷酸化過(guò)程和內(nèi)皮NOS的激活，促進(jìn)Piezo1表達(dá)誘發(fā)血管舒張，這為高血壓治療提供了新見(jiàn)解。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Piezo1可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4通道的激活，并且Piezo1介導(dǎo)的TRPV4通道打開(kāi)與FSS強(qiáng)度和作用時(shí)間相關(guān)[24］。本研究證明了流體剪切力可以介導(dǎo)Piezo1通道促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。對(duì)成骨細(xì)胞分別以Yoda1和GsMTx4干預(yù)后，成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)，這與之前報(bào)道的結(jié)論相一致[25-27］。隨后我們進(jìn)一步檢測(cè)Piezo1蛋白上下調(diào)后對(duì)成骨細(xì)胞增殖的變化，發(fā)現(xiàn)Piezo1蛋白表達(dá)與成骨細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，說(shuō)明Piezo1通道打開(kāi)后釋放Ca2+入胞，而這些遞質(zhì)具有促成骨作用。這是繼前期關(guān)于流體剪切力介導(dǎo)Piezo1促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移后的進(jìn)一步研究，也進(jìn)一步豐富了流體力學(xué)對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)理。

細(xì)胞骨架重組指骨架蛋白重新排列形成應(yīng)力絲的過(guò)程，應(yīng)力絲的形成愛(ài)表細(xì)胞骨架重組良好、細(xì)胞形態(tài)正常[28，29］。通過(guò)鬼筆環(huán)肽染色可以觀(guān)察到成骨細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力絲表現(xiàn)[30］。我們進(jìn)一步探究了FSS及Piezo1對(duì)成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響。首先對(duì)成骨細(xì)胞加載流體剪切力顯示相比未加力時(shí)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力絲陽(yáng)性率明顯升高，但使用Piezo1抑制劑GsMTx4后細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力絲陽(yáng)性率明顯降低。這證明FSS促進(jìn)成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架重組，而抑制Piezo1表達(dá)則減弱這一作用，證明FSS可能介導(dǎo)Piezo1調(diào)控成骨細(xì)胞骨架重組。隨后的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，使用細(xì)胞骨架抑制劑細(xì)胞松弛素D（CytoD）后，成骨細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力絲重組率明顯降低，而對(duì)成骨細(xì)胞干預(yù)CytoD后，減弱了FSS促成骨細(xì)胞增殖的作用，表明細(xì)胞骨架重組與成骨細(xì)胞增殖呈正相關(guān)。但是，細(xì)胞骨架是通過(guò)何種途徑調(diào)控成骨細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不明確，這就有待后續(xù)更進(jìn)一步的研究加以驗(yàn)證，若能完全解析外界刺激—離子通道—細(xì)胞骨架—信號(hào)通路之間的單向或相互作用機(jī)制，將對(duì)骨形成機(jī)制的完善填補(bǔ)空缺。

本研究未開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)Piezo1介導(dǎo)的FSS通過(guò)細(xì)胞骨架對(duì)哺乳動(dòng)物骨表型的影響未進(jìn)行系統(tǒng)的研究，因此，存在一定的局限性，后續(xù)研究應(yīng)將研究中心傾向于進(jìn)行動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)，并對(duì)Piezo1在動(dòng)物體內(nèi)的具體功能及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

綜上所述，我們的研究完善了FSS對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)的最適作用條件，論證了Piezo1介導(dǎo)的Piezo1通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞骨架重排進(jìn)而上調(diào)成骨細(xì)胞增殖，探究了機(jī)械應(yīng)力對(duì)治療骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制，闡釋了Piezo1及細(xì)胞骨架可能會(huì)成為治療骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)。