劉潔 * 陳樹嘉 李嘉Δ

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300203；2.天津市第二人民醫(yī)院肝病科，天津 300192）

非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為第一大慢性疾病及肝功異常的首要原因[1]。非酒精性單純性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver，NAFL）及非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis, NASH）是NAFLD的不同進(jìn)展階段，NASH是發(fā)生纖維化和肝硬化重要的中間階段，是導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，與肝硬化、肝癌發(fā)生密切相關(guān)[2]；盡早診斷NASH并進(jìn)行干預(yù)，可有效改善NAFLD患者的預(yù)后[3]。目前認(rèn)為NAFLD的發(fā)生是遺傳、環(huán)境共同作用的結(jié)果，NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[4]，目前認(rèn)為NAFL進(jìn)展為NASH的機(jī)制為多種因素共同導(dǎo)致[5]，其臨床表現(xiàn)隱匿，早期診斷受多種因素干擾，因此檢測(cè)NAFL及NASH的差異基因，尋找分子診斷標(biāo)記物具有重要意義。本研究基于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene expression omnibus database，GEO）中的NAFLD基因芯片GSE33814進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期獲取NAFLD相關(guān)的關(guān)鍵基因，為后續(xù)尋找分子標(biāo)記物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從 GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索NAFLD相關(guān)的數(shù)據(jù)集，組織來(lái)源為“人肝臟組織”。最終選定基因表達(dá)譜芯片GSE33814數(shù)據(jù)集（GPL6884）。該數(shù)據(jù)集包含44例樣本，正常對(duì)照組13例，NAFL組19例，NASH組12例。

1.2 方法

1.2.1 DEGs篩選

采用 GEO2R 在線分析程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）從 GSE33814數(shù)據(jù)集中分別篩選出 NAFL組與健康對(duì)照組（Healthy controls，HC）及NASH組與HC組的DEGs。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：校正后P值（adjustP-value）＜0.05，|logFC|＞ 0.5。

1.2.2 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通過(guò)R語(yǔ)言（3.6.3版本，使用ggplots包）對(duì)差異表達(dá)基因在GO中注釋其參與的生物學(xué)過(guò)程，包括生物過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組成（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function，MF），并進(jìn)行KEGG通路富集分析同時(shí)繪制氣泡圖。

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction，PPI）構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

使用STRING 11.5數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//cn.stringdb.org）對(duì)DEGs對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用關(guān)系分析，閾值條件設(shè)置為綜合評(píng)分大于 0.4，采用Cytohubba插件的最大集團(tuán)中心性（Matthews correlation coefficient，MCC）算法，依照基因在PPI網(wǎng)絡(luò)的重要性篩選評(píng)分前10位作為關(guān)鍵基因。

1.2.4 靶基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)和靶基因-轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TF）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

miRNA及TF在特定的疾病狀態(tài)時(shí)，在轉(zhuǎn)錄后階段通過(guò)與靶基因相互作用控制基因的表達(dá)。我們應(yīng)用 NetworkAnaly在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/home.xhtml）、miRTarBase工具及ENCODE工具整合靶基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)和靶基因-TF網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選

由GSE33814數(shù)據(jù)集得到NAFL患者相對(duì)于HC的DEGs共219個(gè)，其中上調(diào)基因147個(gè)，下調(diào)基因72個(gè)，火山圖見圖1A。NASH相對(duì)于HC的DEGs共1992個(gè)，包括988個(gè)上調(diào)基因和1004個(gè)下調(diào)基因，火山圖見圖1B。將兩組DEGs分別取交集，得到DEGs共193個(gè)，上調(diào)基因133個(gè)，下調(diào)基因60個(gè)，制作韋恩圖如圖2所示。

圖1 GSE33814數(shù)據(jù)集中差異基因的表達(dá)

圖2 GSE33814數(shù)據(jù)集中上調(diào)基因及下調(diào)基因韋恩圖

2.2 DEGs GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果

利用R語(yǔ)言對(duì)DEGs相關(guān)的MF、BP、CC進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：DEGs主要參與中性粒細(xì)胞活化與免疫反應(yīng)、脂肪酸的代謝分解、小分子物質(zhì)代謝、氨基酸分解代謝等生物過(guò)程；DEGs主要存在于線粒體基質(zhì)、細(xì)胞基質(zhì)結(jié)等；在MF方面，DEGs主要與輔酶結(jié)合、氧化還原酶活性及NADP結(jié)合等。KEGG通路富集結(jié)果顯示，DEGs主要參與檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、丙酸鹽循環(huán)、色氨酸代謝及cGMP-PKG等信號(hào)通路。GO和KEGG富集分析顯著性排名前10的條目見圖3。

圖3 差異基因的功能和通路富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心基因的篩選

將 193個(gè) DEGs帶入 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，閾值條件設(shè)置為綜合評(píng)分大于0.4，剔除 PPI 網(wǎng)絡(luò)中具有不同表達(dá)傾向和孤立節(jié)點(diǎn)的 DEGs后，共包含147個(gè)節(jié)點(diǎn)和277條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為3.77（圖4A）。將PPI結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape軟件，并利用CytoHubba插件在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出一個(gè)重要的功能模塊，擇取排列前10的關(guān)鍵基因，分別是：ACO2、MAPK1、DLD、MAP2K1、SND1、FGA、LMNA、MAP2K2、ALDH18A1、PMPCB。這些基因即為PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（圖4B）。

圖4 DEGs網(wǎng)絡(luò)中的PPI網(wǎng)絡(luò)圖及功能模塊中的關(guān)鍵基因

2.4 靶基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)和靶基因-TF網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

miRNA的前三個(gè)靶向 DEGs是由 183個(gè)miRNA調(diào)控的MAKP1，由52個(gè)miRNA調(diào)控的MAP2K2和由30個(gè)miRNA調(diào)控的SND1?？刂谱畲髷?shù)量的DEGs（3個(gè)基因）的miRNA是hasmir-16-5p（圖5A）。TF的前三個(gè)目標(biāo) DEG 是LMNA，由75個(gè)TF調(diào)控，ACO2由36個(gè)TF調(diào)制，DLD由29個(gè)調(diào)控（圖5B）。

圖5 靶基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)和靶基因-TF網(wǎng)絡(luò)

3 討論

非酒精性脂肪肝與肥胖、2型糖尿病、心腦血管疾病等密切相關(guān)，其發(fā)生發(fā)展嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，據(jù)報(bào)道，約9%~20%的NASH患者于發(fā)病 15年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌[6]。因此，獲取NAFLD相關(guān)的關(guān)鍵基因，可以為后續(xù)分子標(biāo)記物尋找提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，從 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE33814數(shù)據(jù)集篩選到與 NAFLD疾病進(jìn)展有關(guān)的193個(gè)DEGs，對(duì)其GO富集分析顯示其功能主要富集于中性粒細(xì)胞活化及免疫反應(yīng)等生物過(guò)程。炎癥反應(yīng)在整個(gè)NAFLD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生著重要的影響，大部分肝臟細(xì)胞均參與免疫及炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)常繼發(fā)于肝臟對(duì)外源性和內(nèi)源性損傷的免疫反應(yīng)，即NASH發(fā)生、發(fā)展的“二次打擊”學(xué)說(shuō)[7]。激活的中性粒細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子可導(dǎo)致肝細(xì)胞的氧化損傷；而且中性粒細(xì)胞相對(duì)于淋巴細(xì)胞的比例增加可以進(jìn)一步加重NASH[8]。肝臟還富含各種免疫細(xì)胞，包括固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，在肝損傷時(shí)迅速聚集到肝臟。固有免疫細(xì)胞在NASH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。在急性或慢性肝病時(shí)，Kupffer細(xì)胞被病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式激活，釋放促炎細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致免疫狀態(tài)的紊亂。免疫細(xì)胞比例失衡可進(jìn)一步促進(jìn)NASH的發(fā)生[9]。此結(jié)果與既往文獻(xiàn)結(jié)論一致。通路富集結(jié)果表明 DEGs主要集中在檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、丙酸鹽循環(huán)、色氨酸代謝及cGMP-PKG等信號(hào)通路等信號(hào)通路。TCA循環(huán)是脂肪氧化的場(chǎng)所，也是糖異生的代謝前體，該循環(huán)功能的誘導(dǎo)與肝臟氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。cGMP/PKG信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，以往報(bào)道多關(guān)注 cGMP-PKG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，PKG-1基因的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)抑制脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，減少肝臟的脂肪積累，抑制炎癥反應(yīng)，并降低肝細(xì)胞纖維化程度，這預(yù)示著cGMP/PKG信號(hào)通路可調(diào)節(jié)NAFLD的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究富集多條氨基酸代謝通路，提示氨基酸的代謝在脂肪肝發(fā)生發(fā)展中起重要作用。最近，朱健等在Molecular Cell上發(fā)表文章提示必需氨基酸攝入不足是造成營(yíng)養(yǎng)不良人群患上脂肪肝病的“罪魁禍?zhǔn)住盵10]。當(dāng)必需氨基酸匱乏時(shí)，肝細(xì)胞中的E3泛素連接酶Ubr1失活，不能催化脂滴保護(hù)蛋白Plin2的多聚泛素化降解。Plin2蛋白水平的升高則會(huì)抑制肝臟脂肪的分解，從而造成脂肪肝病。上述研究為氨基酸代謝在脂肪肝發(fā)生發(fā)展方向開辟了新的思路。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步篩選出更有研究?jī)r(jià)值的關(guān)鍵基因，分別為ACO2、MAPK1、DLD、MAP2K1、SND1、FGA、LMNA、MAP2K2、ALDH18A1和PMPCB。ACO是脂肪酸分解代謝中的關(guān)鍵酶，存在于線粒體中，催化脂酰 CoA生成乙酰CoA并進(jìn)入三羧酸循環(huán)繼續(xù)被氧化，對(duì)脂肪的β氧化非常重要[11]。MAPK是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠被包括 ROS在內(nèi)的多種因素激活，參與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生理、病理活動(dòng)；其磷酸化水平的降低可預(yù)測(cè)脂肪肝的發(fā)生[12]。MAP2K1/2基因編碼MEK1/2蛋白激酶，屬于雙重特異性蛋白集美家族成員，參與細(xì)胞增殖、分化、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育過(guò)程，其表達(dá)的蛋白水平及磷酸化水平在TRIB1的調(diào)控下影響肝臟脂肪生成和糖生成[13]。DLD屬于嘧啶核苷酸-二硫氧化還原酶家族，參與丙酮酸的氧化脫酸反應(yīng)，參與機(jī)體能量代謝，既往報(bào)道DLD修飾后可促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，但尚無(wú)脂肪肝相關(guān)報(bào)道，故此基因可為脂肪肝的疾病進(jìn)展研究提供新的靶點(diǎn)[14]。SND1可以在轉(zhuǎn)錄水平激活脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)，并且調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化[15]；FGA的表達(dá)可作為妊娠期糖尿病的的早期診斷因子[16]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)在脂肪肝患者中的特異性表達(dá)。ALDHs 家族成員ALDH18A1參與了多種腫瘤表觀遺傳學(xué)調(diào)控的中間產(chǎn)物的生成，對(duì)脂肪肝發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[17]。LMN基因突變可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的更新障礙，其對(duì)于靶向器官的印象仍需進(jìn)一步研究。PMPCB參與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，有報(bào)道稱其與肝細(xì)胞癌患者對(duì)索拉菲尼產(chǎn)生耐藥的主要基因[18]，故對(duì)于合并脂肪肝的肝細(xì)胞癌患者或脂肪肝所致肝細(xì)胞癌患者需警惕。

總體而言，本研究利用生物信息方法預(yù)測(cè)NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要靶點(diǎn)基因，以上靶點(diǎn)基因在脂肪炎癥、免疫、疾病進(jìn)展等起著至關(guān)重要的作用，但仍需分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為NAFLD的早期篩查、診斷及治療等提供新的研究方向及可靠依據(jù)。