柳 卓，田雪飛，郜文輝，譚小寧，翦慧穎，李可心，張 振，曾普華1，△

（1.湖南省中醫(yī)研究院，長沙 412000；2.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 412006；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 412000）

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第6位，死亡率占惡性腫瘤第4位［1］。其高致死率對我國人民健康造成極大的威脅。目前肝癌的治療主要以手術(shù)和放化療為主，具有生物復雜性和治療手段的局限性，同時還面臨費用高，起效慢，易復發(fā)毒副作用大等特點。因此，肝癌治療亟待安全、經(jīng)濟、有效的藥物。

能量代謝正成為當前腫瘤研究熱點，細胞能量代謝重編程（有氧糖酵解、線粒體能量代謝異常）是腫瘤細胞代謝的重要特征，其產(chǎn)生的能量主要用于腫瘤的快速擴增與遷移［2］。線粒體是機體能量代謝的細胞器，是腫瘤細胞快速增殖的重要介質(zhì)?；谀[瘤細胞能量代謝為靶點，抑制腫瘤細胞增殖，有望成為惡性腫瘤臨床治療的新靶點?！肮唐⑾e飲”原名益氣化瘀解毒方是我院國醫(yī)大師潘敏求教授團隊治療肝癌的經(jīng)驗方，以四君子湯為基礎方加減，由白參、白術(shù)、半枝蓮、莪術(shù)、茯苓、黃芪、石見穿組成。具有益氣化瘀、散結(jié)解毒之功效。前期研究表明該方具有帶瘤生存，改善患者生存狀況的療效［3］。動物研究表明其具有抑制移植瘤生長，誘導肝癌細胞自噬和凋亡的作用［4］，但其凋亡作用的機制尚未明確。

本實驗體外培養(yǎng)HepG2研究固脾消積飲含藥血清對肝癌細胞凋亡的作用機制，為其臨床療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物

HepG2細胞為湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈。所有實驗動物遵循國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物質(zhì)量管理辦法》，SPF級SD大鼠10只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，動物購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2019-0004。本動物實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院動物倫理委員會批準，批準號2019-0072。

1.2 藥物及試劑

固脾消積飲白參10 g、黃芪30 g、半枝蓮30 g、重樓15 g、醋莪術(shù)15 g、甘草5 g購于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。DMEM高糖培養(yǎng)基（Procell公司，批號：WH0021K261），小牛血清（CELL-BOX公司，批號：20201118），CCK8試劑盒（APExBIO公司，批號：K1018），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Elabscience公司，批號：E-IR-R305），增強型線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C2003S），周期與凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1052），Bax抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-10049），Bcl-2抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-22004），Caspase-3抗體（Elabscience公司，批號：E-AB-22115）；Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基（美國Agilent公司，批號：00620006）；丙酮酸、葡萄糖ELISA試劑盒（南京建成生物工程公司，批號A081、F006）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（英國Abcam公司，批號GR33333591）；糖酵解速率測定試劑盒（美國Agilent公司，批號26817104）；三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）ELISA檢測試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號201651、206021）。

1.3 儀器

DxFLEX型流式細胞儀（美國Beckman Coulter有限公司）；Multifuge XIR型超低溫低速離心機（德國ThermoFisher）；EIX808U型酶標儀（美國BioTek公司）；Mini Protean 3 Cell型電泳儀（美國Bio-Rad）；GBox XRQ型凝膠成像儀（中國Gene公司）；Seahorse XFe96型能量代謝分析儀（美國Agilent公司）。

1.4 固脾消積飲含藥血清的制備

飲片冷水浸泡30 min，煎煮2次，將藥液混合后過濾，濃縮至成人3倍劑量，再將藥物濃縮至100 ml含生藥1.8 g/ml，取10只SD大鼠，中藥組5只，按相當于成人120 g/d等效量換算，每日灌胃量21.6 g/kg；空白組5只，用等體積蒸餾水灌胃；連續(xù)5 d，灌胃后第6日腹主動脈取血，收集兩組大鼠的血清，-80℃保存、備用。

1.5 細胞培養(yǎng)及分組

HepG2用10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞共設4組：對照組（Control）、空白血清組（Blank）、固脾消積飲血清組（GPXJY）和順鉑組（Positive），每組設置6～10個復孔?？瞻籽褰M加入10%空白血清，中藥組分別加入10%固脾消積飲含藥血清培養(yǎng)基，順鉑組培養(yǎng)基中加入20μg/ml順鉑，于5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.6 細胞活力檢測試劑盒（CCK8）檢測細胞活性

HepG2細胞按照1.5分組干預后，棄掉上清，每孔加入CCK8，37℃培養(yǎng)2 h，于450 nm波長處，用酶標儀測定各孔吸光值（OD值）。

1.7 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法檢測凋亡情況

在12孔板上，按照1.5共培養(yǎng)分組和干預后，棄掉上清，每孔加入相應DAPI，染10 min后，PBS洗后顯微鏡下觀察。

1.8 Tunel檢測HepG2細胞凋亡情況

每組細胞用4%多聚甲醛固定30 min，充分固定后，PBS清洗2×3 min次，Triton X-100封閉5 min，用PBS清洗2×3 min，配檢測液后每孔加入50 μl，37℃避光60 min孵育，PBS洗2×3 min后，在熒光顯微鏡下拍照。

1.9 流式細胞儀檢測人肝癌Hep G2細胞周期

各組加入等體積藥物干預24 h后，收集細胞，1 000 r/min左右離心3 min，沉淀細胞。用PBS清洗2次。向400μl細胞懸液中加入400μl結(jié)合緩沖液和10μl AnnexinV-FITC（20μg/ml），混勻，4℃避光孵育15 min后，在向細胞懸液中加入5μl碘化丙啶（PI）（20μg/ml），混勻。4℃避光孵育5 min，室溫放置10 min。采用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.10 JC-1線粒體檢測試劑盒檢測人肝癌HepG2細胞線粒體膜電位

取各組細胞懸液1 ml（含1×106細胞），以冷PBS洗滌細胞，100μl PBS液懸浮細胞，加入JC-1染色工作液，37℃孵育20 min，600 r/min 4℃離心3 min，沉淀細胞，重復三次，用JC-1重懸后，用流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位，結(jié)果以平均熒光強度表示。

1.11 細胞上清液膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）含量檢測

取各組上清液按照說明書檢測細胞上清液TG和TC含量。

1.12 脂質(zhì)過氧化物（MDA）的檢測

使用蛋白酶消化細胞，收集每組細胞。按照脂質(zhì)過氧化MDA檢測試劑盒說明書，95℃下60 min孵育，冰浴10 min，酶標儀檢測。

1.13 細胞糖酵解速率測定

藥物干預后細胞，每孔加入XF RPMI培養(yǎng)基，再將細胞放入無CO2的細胞培養(yǎng)箱中1 h等待上機檢測，按照糖酵解速率試劑盒步驟進行檢測。

1.14 葡萄糖代謝檢測

取各組細胞上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測丙酮酸和葡萄糖含量

1.15 蛋白免疫印記法（Western blot）檢測

BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)（BCL2-Associated X，Bax）、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）蛋白按照1.5共培養(yǎng)分組和干預后，提取蛋白，取含有100μg總蛋白的細胞裂解產(chǎn)物進行電泳，5%脫脂奶粉進行封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，清洗后二抗搖床孵育2 h，清洗后用凝膠成像。

1.16 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 固脾消積飲對HepG2細胞增殖的影響

細胞處理24 h后，光密度OD（optical density）檢測的結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組和固脾消積飲組細胞明顯被抑制（P＜0.05，表1）。同時，DAPI染色結(jié)果顯示，固脾消積方含藥血清對HepG2細胞的抑制作用較明顯，細胞數(shù)變少（圖1）。各組給予相應濃度藥物，分別作用于HepG2細胞24 h后，檢測其光密度OD（optical density）。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組和固脾消積飲組細胞明顯被抑制（P＜0.05）。

DAPI染色結(jié)果如圖1顯示，固脾消積方含藥血清對HepG2細胞的抑制作用較明顯，細胞數(shù)變少。

Fig.1 DAPI staining of HepG2 cells treated with medicated serum in each group（×200）

2.2 固脾消積飲對HepG2形態(tài)的影響

凋亡細胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL）實驗表明，固脾消積飲血清和順鉑血清組凋亡陽性細胞數(shù)明顯多于對照組和無含藥血清（P＜0.01，表1，表2）。

Tab.1 Positive expression rate of OD and TUNEL cells in each group（±s，n=8）

Tab.1 Positive expression rate of OD and TUNEL cells in each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group OD value Apoptosis index（%）Control 1.14±0.09 8.23±1.23 Blank 1.05±0.12 9.23±2.42 GPXJY 0.33±0.09* 40.24±4.23**Postive 0.32±0.12* 42.21±3.25**

Fig.2 TUNEL apoptosis of cells in each group

2.3 固脾消積飲對HepG2周期的影響

細胞周期表明，固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細胞G0-G1期的百分率比對照組大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細胞S期的百分率降低，無統(tǒng)計學意義。固脾消積飲血清組和順鉑血清組HepG2細胞G2-M期降低，無統(tǒng)計學意義（表2，圖3）。

Tab.2 Cell cycle and apoptosis in each group（%，±s，n=8）

Tab.2 Cell cycle and apoptosis in each group（%，±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group G0-G1 S G2-M Control 30.92±0.43 43.12±1.54 21.83±1.43 Blank 49.43±2.78 40.26±2.41 23.20±2.72 GPXJY 67.52±4.32**16.15±1.57 11.22±1.94 Postive 61.26±5.32*20.02±1.43 17.94±1.21

Fig.3 Results of cell cycle and apoptosis in each group

2.4 固脾消積飲對Hep G2細胞線粒體膜電位的作用

線粒體膜電位顯示，與對照組比較，固脾消積飲和順鉑血清組線粒體膜電位依次下降（P＜0.01，表3，圖4）。

Fig.4 Mitochondrial membrane potential of cells in each group

2.5 固脾消積飲對HepG2能量代謝的影響

2.5.1 固脾消積飲對HepG2脂質(zhì)代謝的影響 與對照組相比，空白組TG和TC無變化，中藥組和順鉑組TG和TC含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01，表3）。

2.5.2 固脾消積飲對HepG2的糖酵解功能和MDA水平的影響 與對照組相比，空白組糖酵解和MDA含量無明顯變化，中藥組和順鉑組糖酵解功能明顯降低，MDA含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，表4）。

2.5.3 固脾消積飲對HepG2的丙酮酸和葡萄糖的影響 與對照組相比，空白組丙酮酸含量和葡萄糖含量無變化，中藥組和順鉑組上清液丙酮酸含量明顯增加，葡萄糖含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01，表5）。

2.6 固脾消積飲對Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的影響

與對照組相比較，固脾消積飲和順鉑組的Bax、Caspase-3表達顯著增高，固脾消積飲和順鉑組中Bcl-2蛋白表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，表6，圖5）。

Tab.3 Mitochondrial membrane potential and comparison of TG and TC contents in cells of each group（±s，n=8）

Tab.3 Mitochondrial membrane potential and comparison of TG and TC contents in cells of each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group Membrane potential TG（mmol/L）TC（mmol/L）Control 71.11±2.14 1.40±0.05 1.86±0.05 Blank 60.03±3.14 1.46±0.03 1.82±0.11 GPXJY 27.54±1.32**1.02±0.07*1.42±0.07**Postive 17.47±1.25**1.06±0.05**1.40±0.05*

Tab.4 Comparison of glycolytic function and MDA level of cells in each group（±s，n=8）

Tab.4 Comparison of glycolytic function and MDA level of cells in each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group PER（mpH/min） MDA（mmol/L）Control 809.7±13.9 0.62±0.05 Blank 798.3±18.7 0.75±0.01 GPXJY 472.2±26.7** 1.03±0.01*Positive 463.1±26.5* 1.08±0.05**

Tab.5 Comparison of pyruvate and glucose contents in cells of each group（±s，n=8）

Tab.5 Comparison of pyruvate and glucose contents in cells of each group（±s，n=8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group Pyruvic acid（mmol/L）Glucose（×102μmol/mg）Control 15.69±0.16 2.09±0.03 Blank 16.09±0.05 2.02±0.02 GPXJY 19.48±0.09** 1.25±0.08**Postive 19.09±0.08* 1.21±0.05**

Tab.6 Expression of Bax，Bcl-2 and caspase-3 proteins in each group（±s，n=10）

Tab.6 Expression of Bax，Bcl-2 and caspase-3 proteins in each group（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group

Group BAX Bcl-2 Caspase-3 Control 0.89±0.03 1.33±0.05 1.03±0.04 Blank 0.91±0.02 1.14±0.04 1.04±0.09 GPXJY 1.63±0.08*0.48±0.03**1.85±0.04*Postive 1.71±0.03*0.46±0.05**1.79±0.04*

Fig.5 Protein expressions of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in each group

3 討論

細胞凋亡可以有效抑制腫瘤細胞生長和繁殖，從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。誘導腫瘤細胞凋亡可以在殺滅癌細胞的同時有效的避免對正常細胞的損害。因此，其是一種能有效的抑制癌細胞增殖的重要手段。凋亡常表現(xiàn)為細胞體積縮小，細胞器發(fā)生變化以及凋亡小體出現(xiàn)等［5］。線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是凋亡發(fā)生的三種機制，通過凋亡信號誘導程序性死亡路徑，從而使得腫瘤疾病得以有效治療［6］。本研究結(jié)果顯示，固脾消積飲對肝癌細胞有抑制作用，TUNEL實驗顯示固脾消積飲干預細胞組凋亡陽性細胞明顯增多。流式結(jié)果顯示固脾消積飲血清組G1期的百分率比對照組大。表明固脾消積飲可能是通過阻滯HepG2細胞G1期而抑制癌細胞的增殖作用。

線粒體跨膜電位與細胞凋亡間關系密切，是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對稱分布造成。線粒體是能維持電化學質(zhì)子梯度、進行氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎［7］。正常生理情況下線粒體內(nèi)膜通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過。在細胞凋亡早期線粒體外膜蛋白質(zhì)的通透性增高，線粒體膜電位降低，最終導致細胞凋亡［8］。細胞凋亡中線粒體起著重要作用，而這一過程是通過Bax、Bcl-2家族平衡來調(diào)控［9］。Bcl-2基因可抑制細胞凋亡，延長細胞生存期。Bax則是具有對抗Bcl-2蛋白作用，促進細胞凋亡產(chǎn)生。Caspase-3是凋亡途徑的效應分子，在線粒體介導細胞凋亡途徑中受凋亡信號的刺激下，其上游信號分子作用于線粒體膜，線粒體膜通透性發(fā)生反應，引起凋亡［10］。本實驗結(jié)果表明，固脾消積飲含藥血清處理人肝癌細胞后，線粒體膜電位下降，凋亡率增加，并對線粒體凋亡相關的通路蛋白Bcl-2表達降低，Bax、Caspase-3表達增高。由此可推測，固脾消積飲可能通過線粒體途徑誘導肝癌細胞凋亡的發(fā)生。

與正常細胞不同，腫瘤細胞主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP獲得大量能量，有氧糖酵解是腫瘤細胞最具特征的代謝表型，為腫瘤細胞的增殖提供能量［11］。實驗表明，抑制癌細胞的糖酵解和脂質(zhì)代謝等能量代謝，可以促進腫瘤細胞的凋亡［12-14］。本實驗表明，固脾消積飲血清干預TG和TC含量顯著減少，糖酵解功能明顯降低，MDA含量明顯增加，丙酮酸含量明顯增加，葡萄糖含量明顯減少。由此可推測，固脾消積飲可能對肝癌細胞能量代謝有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們通過體外實驗證實固脾消積飲能促進肝癌細胞凋亡，其作用可能跟線粒體途徑和調(diào)節(jié)能量代謝有關。下一步將進一步對體內(nèi)實驗進行驗證，并聯(lián)合放化療藥物進一步探討。