周 健，秦 浩，李曉紅△，王永輝

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濰坊 261053；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

重金屬鎘（cadmium，Cd）作為一種環(huán)境污染物，對(duì)人類和動(dòng)物健康都構(gòu)成威脅。在環(huán)境暴露人群中，吸煙者是暴露最嚴(yán)重的對(duì)象；不吸煙者通過飲食攝入受污染的食物和水而暴露于鎘［1］。近幾年，有研究報(bào)道，鎘對(duì)生殖系統(tǒng)有一定的影響，鎘暴露可導(dǎo)致睪丸組織損傷，嚴(yán)重可導(dǎo)致不育癥發(fā)生［2］。鎘致生殖系統(tǒng)損傷能影響人類繁衍，所以對(duì)其損傷的保護(hù)是研究的一個(gè)熱點(diǎn)。鎘生殖毒性是由多種機(jī)制介導(dǎo)的，其中之一是對(duì)睪丸細(xì)胞的氧化應(yīng)激［1］。

維生素C（vitamin C，VC）是生活中常見的一種強(qiáng)抗氧化劑。波蘭Gren Agnieszka等學(xué)者［3］曾進(jìn)行過VC對(duì)鎘染毒后小鼠肝、腎和腦的研究，結(jié)果顯示單次高劑量鎘比慢性低劑量鎘具有顯著的毒性效應(yīng)，VC可減輕鎘的應(yīng)激效應(yīng)。本研究染毒鎘劑量和VC保護(hù)用量與其不同，且單次和重復(fù)染毒采用相同的劑量，而且目前鎘劑量與睪丸損傷強(qiáng)度之間的關(guān)系，以及鎘對(duì)睪丸損傷過程的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究進(jìn)行單次和重復(fù)染毒實(shí)驗(yàn)，觀察睪丸的氧化損傷及VC保護(hù)作用，期望能夠?yàn)槿巳悍乐捂k暴露對(duì)生殖系統(tǒng)的不利影響提供理論依據(jù)，也為人們?cè)谌粘Ｉ钪蓄A(yù)防鎘危害提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

分析純氯化鎘（北京化工廠）；維生素C（華中藥業(yè)股份有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、微量還原型谷胱甘肽試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾儀器有限公司）；分光光度計(jì)、紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；3-18K低溫離心機(jī)（德國SIGMA公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康清潔級(jí)雄性昆明小鼠72只，6～7周齡，體重（34±2）g，購自青島動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)良好，沒有已知污染物影響，自由攝食和飲水。72只小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（Con）、氯化鎘（CdCl2）組、維生素C（VC）組、維生素C+氯化鎘（VC+CdCl2）組，分別灌胃+腹腔注射雙蒸水、灌胃雙蒸水+腹腔注射CdCl2、灌胃VC+腹腔注射雙蒸水、灌胃VC+腹腔注射CdCl2。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用CdCl23 mg/kg腹腔注射染毒，VC 200 mg/kg灌胃進(jìn)行保護(hù)，經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每日染毒1次，染毒1 d和3 d及同時(shí)補(bǔ)充VC保護(hù)。每日同時(shí)間段進(jìn)行體重稱量記錄和染毒操作。染毒期間小鼠自由進(jìn)食，飲水。

1.3 樣本制備

第1日和第3日染毒24 h后取9只小鼠（8 h前已禁食），稱重并記錄，摘眼球取血并收集血液，待凝固后4℃離心取上清液，保存于-20℃冰箱備用。處死小鼠后，取出睪丸，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重并記錄，然后剪碎，放入玻璃勻漿器中，于4℃的低溫低速離心機(jī)離心10 min后取上清。

1.4 小鼠體重及臟器系數(shù)的測(cè)定

第1日和第3日染毒24 h后，各組小鼠稱重，處死后取雙側(cè)睪丸稱重，計(jì)算睪丸臟器系數(shù)。公式：睪丸臟器系數(shù)=（睪丸重量/體重）×100。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

依據(jù)試劑盒說明書測(cè)定血清SOD、MDA水平，睪丸組織SOD、MDA、GSH、GSSG、GSH-Px、T-GSH水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重和臟器系數(shù)變化

結(jié)果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負(fù)荷第1日與第3日小鼠體重與睪丸臟器系數(shù)都低于Con，VC處理后減輕的程度有所降低（表1）。

Tab.1 Effects of Cd on the body weight and testicular coefficient of mice in each group（±s，n=9）

Tab.1 Effects of Cd on the body weight and testicular coefficient of mice in each group（±s，n=9）

Group Body weight（g）1 d 3 d Testicular coefficient（%）1 d 3 d Con 34.12±2.12 35.98±2.02 0.58±0.21 0.56±0.17 VC 34.21±1.96 35.72±1.75 0.57±0.11 0.56±0.25 CdCl2 26.67±2.67 26.73±2.15 0.39±0.09 0.36±0.08 VC+CdCl2 28.27±1.92 28.76±1.68 0.41±0.26 0.38±0.10

2.2 小鼠血清SOD及MDA的變化

結(jié)果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負(fù)荷第1日，染毒組SOD和MDA水平高于Con，VC處理后降低，接近Con；鎘負(fù)荷第3日，染毒組SOD水平較Con顯著降低（P＜0.05），VC處理后較染毒組顯著升高（P＜0.05），MDA含量較Con顯著升高（P＜0.05），VC處理后含量顯著降低（P＜0.05）；鎘負(fù)荷第3日，染毒組SOD水平顯著低于第1日（P＜0.05），MDA含量高于第1日，但無顯著性差異，VC處理后SOD水平低于第1日及MDA含量高于第1日，但無顯著性差異（表2）。

Tab.2 Changes in serum levels of SOD and MDA of mice in each group（±s，n=9）

Tab.2 Changes in serum levels of SOD and MDA of mice in each group（±s，n=9）

SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1 d）

Group SOD（U/ml）1 d 3 d MDA（nmol/ml）1 d 3 d Con 116.60±10.06 108.30±8.04 2.24±0.18 2.24±0.19 VC 113.20±7.66 110.71±5.80 2.03±0.10 2.03±0.17 CdCl2 126.31±8.24 77.52±6.33*Δ2.43±0.08 3.43±0.36*VC+CdCl2 114.03±12.90 100.33±4.53# 2.33±0.05 3.00±0.21#

2.3 小鼠睪丸組織MDA及GSH/GSSG變化

結(jié)果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負(fù)荷第1日，染毒組MDA水平顯著高于Con（P＜0.05），GSH/GSSG水平顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后較染毒組顯著降低（P＜0.05）；鎘負(fù)荷第3日，染毒組MDA含量顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后含量顯著降低（P＜0.05），GSH/GSSG水平顯著低于Con（P＜0.05），VC處理后顯著升高（P＜0.05）；鎘負(fù)荷第3日，染毒組MDA含量顯著高于第1日（P＜0.05），VC處理后含量較第1日顯著升高（P＜0.05），GSH/GSSG水平低于第1日；VC處理后，GSH/GSSG水平未有明顯變化（表3）。

Tab.3 Changes of MDA and GSH/GSSG in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

Tab.3 Changes of MDA and GSH/GSSG in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

MDA：Malondialdehyde；GSH：Reduced glutathione；GSSG：Oxidized glutathione*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1d）；▲P＜0.05 vs VC+CdCl2（1 d）

Group MDA（nmol/mg）1 d 3 d GSH/GSSG 1 d 3 d Con 1.60±0.25 1.60±0.25 0.51±0.01 0.50±0.01 VC 1.65±0.21 1.77±0.18 0.50±0.03 0.50±0.02 CdCl2 2.51±0.17*5.06±0.33*Δ0.59±0.04*0.34±0.02*Δ VC+CdCl2 2.11±0.12 3.86±0.14#▲0.45±0.02#0.45±0.01#

2.4 小鼠睪丸組織SOD、GSH-Px及T-GSH的變化

結(jié)果顯示，Con與VC組近似，無顯著性差異；鎘負(fù)荷第1日，染毒組SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著高于Con（P＜0.05），VC處理后其水平顯著降低（P＜0.05）；鎘負(fù)荷第3日，染毒組SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著低于Con（P＜0.05），VC處理后其水平顯著升高（P＜0.05）；鎘負(fù)荷第3日SOD、GSH-Px和T-GSH水平顯著低于第1日（P＜0.05），VC處理后，第3日依舊低于第1日，但無顯著性差異（表4）。

Tab.4 Changes of SOD，GSH-Px and T-GSH in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

Tab.4 Changes of SOD，GSH-Px and T-GSH in testis tissues of mice in each group（±s，n=9）

SOD：Superoxide dismutase；GSH-Px：Glutathione peroxidase；T-GSH：Total glutathione*P＜0.05 vs Con；#P＜0.05 vs CdCl2；ΔP＜0.05 vs CdCl2（1 d）

Group SOD（U/mg）1 d 3 d GSH-Px（U/mg）1 d 3 d T-GSH（mg/g）1 d 3 d Con 91.88±6.50 91.88±6.56 27.51±1.30 28.03±1.50 25.82±2.35 26.05±1.90 VC 96.27±5.25 96.27±5.26 27.70±1.27 26.80±1.45 26.77±2.40 26.27±1.90 CdCl2 135.41±5.09*60.41±3.40*Δ 38.39±2.54* 13.39±0.86*Δ 36.18±2.38* 18.43±1.00*Δ VC+CdCl2 100.12±3.73#86.62±3.60# 30.12±1.97# 18.37±1.56# 28.62±0.72# 23.62±0.90#

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，鎘負(fù)荷致小鼠體重及睪丸臟器系數(shù)降低［4］，本研究也表明，不同鎘負(fù)荷下小鼠體重及睪丸臟器系數(shù)降低。睪丸臟器指數(shù)降低表明鎘對(duì)睪丸造成損傷［5］。VC處理后，降低的程度略有改善，說明VC對(duì)染鎘小鼠睪丸組織具有一定保護(hù)作用。

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其濃度與細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān) 性，MDA濃度可間接反應(yīng)膜脂過氧化程度［6］。隨著鎘負(fù)荷延長，鎘組小鼠血清、睪丸組織氧化產(chǎn)物MDA含量逐漸升高，呈劑量依賴性，表明鎘的蓄積致小鼠氧化應(yīng)激程度加重，VC干預(yù)后，第1日和第3日MDA含量顯著低于染毒組，表明VC對(duì)第1日、第3日鎘致氧化損傷有一定保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道，VC轉(zhuǎn)化為抗壞血酸根給脂自由基提供電子干預(yù)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［7］。VC可能通過上述機(jī)制發(fā)揮作用。

GSH/GSSG是細(xì)胞內(nèi)最豐富的氧化還原對(duì)，也是主要的抗氧化系統(tǒng)之一［8］。GSH/GSSG是細(xì)胞健康的指標(biāo)，它代表氧化劑和抗氧化劑之間的動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)這個(gè)比值的變化是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)微調(diào)的基礎(chǔ)，包括細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)和其他細(xì)胞過程所需的氧化應(yīng)激信號(hào)［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)GSH/GSSG和T-GSH進(jìn)行了研究。周雍［10］的研究表明，急性鎘染毒1 h后還原型GSH含量急劇升高，48 h含量接近對(duì)照組。本研究顯示，鎘負(fù)荷第1日睪丸組織GSH/GSSG比值升高，可能與GSH含量應(yīng)激性升高有關(guān)。氧化應(yīng)激時(shí)，GSH氧化成GSSG，隨著鎘負(fù)荷時(shí)間延長GSH含量下降；睪丸組織累積較多的GSSG，GSSG可在谷胱甘肽還原酶作用下可還原為GSH，NADP+/NADPH系統(tǒng)提供所需的還原當(dāng)量。有文獻(xiàn)報(bào)道，苯并（a）芘染毒致小鼠睪丸組織細(xì)胞G-6-PD活性隨著染毒劑量逐漸降低［11］。鎘負(fù)荷可能也致小鼠睪丸組織細(xì)胞G-6-PD活性降低，GSSG在睪丸組織逐漸累積，導(dǎo)致GSH/GSSG比值降低。本研究鎘負(fù)荷第3日GSH/GSSG比值降低可能與上述機(jī)制有關(guān)。VC參與GSSG轉(zhuǎn)化為GSH的反應(yīng)過程［12］。本研究不同鎘負(fù)荷經(jīng)VC干預(yù)GSH/GSSG比值接近對(duì)照組，可能與此機(jī)制有關(guān)，說明VC在一定程度上維持該比值的平衡，對(duì)鎘負(fù)荷致小鼠睪丸組織細(xì)胞氧化損傷有一定保護(hù)作用。但是VC為水溶性易被代謝，鎘負(fù)荷再延長是否能發(fā)揮保護(hù)作用需進(jìn)一步研究。

酶和非酶系抗氧化系統(tǒng)包括SOD、GSH-Px、GSH，它們可以清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。鎘負(fù)荷第1日，血清SOD及睪丸組織SOD、GSH-Px、T-GSH水平升高。這一結(jié)果與其他學(xué)者［5，13］研究不一致，但也有學(xué)者［14］研究顯示SOD活力水平升高。原因可能是：（1）劑量不同，機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)不同。（2）觀察時(shí)間不同，本研究染毒結(jié)束后第1日觀察。因此，本研究鎘負(fù)荷第1日SOD、GSH-Px、T-GSH水平升高可能與應(yīng)激性增加或者其他機(jī)制有關(guān)，需進(jìn)一步研究。文獻(xiàn)報(bào)道，鎘能抑制SOD、GSH-Px活性，增加ROS和脂質(zhì)過氧化損傷，干擾抗氧化酶的活性。鎘還能改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，通過與內(nèi)源性及外源性抗氧化劑反應(yīng)，如GSH［15］。本研究顯示鎘負(fù)荷第3日SOD、GSH-Px、T-GSH水平降低，可能與上述機(jī)制有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定是由于復(fù)雜的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的保護(hù)作用，外源性抗氧化物質(zhì)（如VC、VE等）強(qiáng)化內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的作用［16］。Culter提出，許多生物體有能力維持穩(wěn)定的氧化應(yīng)激，應(yīng)用抗氧化補(bǔ)充劑證明有效性是假定初始氧化應(yīng)激水平高于正?；蚋哂跈C(jī)體的調(diào)節(jié)點(diǎn)，這樣，抗氧化補(bǔ)充劑可能降低氧化應(yīng)激增加的水平，但應(yīng)激不能被內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)阻止［16］。因?yàn)閂C為水溶性的，可能在小鼠的日?；顒?dòng)中被代謝；鎘的半衰期長，易體內(nèi)蓄積，所以本研究中VC處理后SOD、GSH-Px與TGSH水平得到改善，但鎘負(fù)荷第3日活力水平低于第1日，可能與上述機(jī)制有關(guān)。因此，VC在一定程度上可以減緩鎘致小鼠睪丸的氧化損傷，但該保護(hù)作用可能有一定的時(shí)間限制。

研究表明，自噬由嚴(yán)重氧化應(yīng)激觸發(fā)，被認(rèn)為是一種能清除細(xì)胞質(zhì)中損傷的細(xì)胞器和蛋白降解成分的自然過程，但過度的自噬會(huì)破壞細(xì)胞的基本成分［17］。有研究表明，柚皮素通過下調(diào)p62和LC3-II的表達(dá)，進(jìn)一步抑制MDA和H2O2的產(chǎn)生，保護(hù)睪丸免受鎘誘導(dǎo)的自噬［17］。陳明生等［18］研究表明，VC聯(lián)合替莫唑胺能夠增強(qiáng)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性，這一作用是通過ERK信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制替莫唑胺所介導(dǎo)的自噬作用。本研究VC對(duì)鎘染毒的保護(hù)作用可能與睪丸自噬有關(guān)，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究探討。