廖良坤 楊勝濤 袁源 查云盛 和桂芳 肖魚(yú)

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東湛江524001；2.怒江綠色香料產(chǎn)業(yè)研究院 云南怒江 673200）

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜[（Alpinia zerumbet(Pers.)Burtt.et Smith）]的干燥成熟果實(shí)，是貴州、云南少數(shù)民族常用的民族藥材，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿(mǎn)、消化不良、嘔吐腹瀉等，目前已有 200多年的栽培歷史[1]。艷山姜揮發(fā)油是從艷山姜的干燥成熟果實(shí)中提取得來(lái)，具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化以及防治心血管系統(tǒng)疾病等[2]。研究表明，艷山姜葉子的水提物和二氯甲烷提取物在體外有抗增殖活性，水醇提取物和二氯甲烷提取物對(duì)白血病和肺腫瘤細(xì)胞系顯示出抗增殖作用，表明艷山姜具有作為抗腫瘤藥物的潛質(zhì)[3]。目前關(guān)于艷山姜精油的活性研究主要集中于對(duì)心血管系統(tǒng)疾病和抗炎方面[4]，在艷山姜精油抑制癌細(xì)胞增殖方面研究較少。

本研究通過(guò)提取艷山姜精油，分析其揮發(fā)組分，并利用HepG2人肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，分析精油誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖的效果，揭示其抗腫瘤作用。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 試劑艷山姜，采自云南怒江州；HepG2人肝癌細(xì)胞系，購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco；胎牛血清，美國(guó)Gibco；DMSO，美國(guó)sigma；CCK-8試劑盒，美國(guó)Sigma；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo Fisher；Annexin V-PE/7-AAD流式試劑盒，中國(guó)三箭；一抗：Caspase-3（兔來(lái)源）、Caspase-9（兔來(lái)源）、p53（兔來(lái)源）、PCNA（兔來(lái)源），英國(guó)Abcam；內(nèi)參一抗β-actin（兔來(lái)源），英國(guó)Abcam；RNA提取試劑盒，日本takara；氣相色譜質(zhì)譜儀，日本島津。

1.1.2 設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋；低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭；倒置顯微鏡，Nikon，日本；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD；垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置，美國(guó)Bio-Rad；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜裝置，美國(guó)Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)，中國(guó) Tanon；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI；激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon。

1.2 方法

1.2.1 艷山姜精油 GC-MS分析將水蒸氣蒸餾獲得的艷山姜精油10 μL溶解于1 mL甲醇中，利用0.22 μm尼龍膜過(guò)濾后，進(jìn)行GC-MS分析。色譜條件：色譜柱HP-5 MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃保持5 min，以5℃/min的速率升溫至50℃，再以8℃/min的速率升溫至230℃保持5 min，以20℃/min的速率升溫至280℃，保持5 min。載氣為He；載氣流量為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度290℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比為10∶1。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，傳輸線(xiàn)溫度250℃，離子源溫度230℃，質(zhì)譜掃描范圍為 35～550 m/z[5]。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞為人類(lèi)肝癌細(xì)胞HepG2，其培養(yǎng)基為威廉姆斯E（WME）全培養(yǎng)基，其中包含5%胎牛血清（FBS）、2 mmol/L谷氨酸鹽、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、0.05 μg/mL氫化可的松、5 μg/mL胰島素、100 μg/mL慶大霉素、50 μg/mL鏈霉素和 50 units/mL青霉素，將HepG2細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞代數(shù)為14～35代[6]。

1.2.3 不同濃度艷山姜精油處理HepG2細(xì)胞模型建立吸取250 μL艷山姜精油，質(zhì)量為0.229 4 g，計(jì)算密度為0.917 6 g/mL，因此吸取435.9 μL艷山姜精油，質(zhì)量為 0.4 g，加入無(wú)水乙醇 2 mL，得艷山姜精油母液濃度為0.2 g/mL。用胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL，分別接種于96孔板中，每孔100 μL，每組細(xì)胞3個(gè)重復(fù)；將96孔板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2），待細(xì)胞貼壁后，利用不同精油處理細(xì)胞[7]。

1.2.4 CCK 檢測(cè)分別往上述96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞中加入 400、200、100、50、25、0 μg/mL 的艷山姜精油，培養(yǎng)12、24、48 h；每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值；設(shè)置空白孔（培養(yǎng)基、CCK8），對(duì)照孔（未經(jīng)處理的細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8）[8]。

細(xì)胞抑制率=[A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組]/[A對(duì)照組-A空白組]×100%

A實(shí)驗(yàn)組：具有經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞的CCK8溶液的吸光度值；A空白組：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度值；A對(duì)照組：具有未經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞的CCK8溶液的吸光度值。

1.2.5 流式細(xì)胞分析用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%～70%，加入相應(yīng)濃度的精油處理HepG2細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清和沉淀，以2 000 r/min離心5 min；用PBS洗滌細(xì)胞2次，以2 000 r/min離心5 min，收集（1～5）×105個(gè)細(xì)胞；在 50 μL 的 Binding Buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；加入 450 μL的 Binding Buffer混勻，加入 1 μL AnnexinV-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Annexin V-PE的橙紅色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=578 nm；7-AAD紅色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)Ex= 546 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=647 nm[9]。

1.2.6 qPCR按照RNA提取試劑盒步驟，提取RNA，用分光光度儀測(cè)定濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照步驟將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，根據(jù)濃度稀釋適當(dāng)倍數(shù)，然后利用qPCR儀進(jìn)行mRNA檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，共計(jì) 40 個(gè)循環(huán)[10]?；虮磉_(dá)定量采用△Ct的方法，引物由Western Biotechnology公司合成，見(jiàn)表1。

表1 引物名稱(chēng)和序列

1.2.7 數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 Excel處理，顯著性采用SPSS方差分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 艷山姜精油GC-MS分析

將艷山姜精油按 1.2.1條件進(jìn)行 GC-MS分析，得到艷山姜精油揮發(fā)性成分，用 NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索匹配，定性分析出50個(gè)揮發(fā)性成分(表1)，分別為烯烴類(lèi)25個(gè)、醇類(lèi)13個(gè)、醛類(lèi)6個(gè)、酮類(lèi)3個(gè)、其他芳烴化合物3個(gè)，共占總揮發(fā)組分的96.35%。艷山姜精油揮發(fā)組分主要為α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、石竹烯、δ-杜松烯、桉葉油醇等烯烴和醇類(lèi)化合物；揮發(fā)組分中，烯烴占63.88%、醇類(lèi)占19.52%、醛類(lèi)占3.95%、酮類(lèi)占2.99%。

表1 艷山姜精油揮發(fā)組分分析

2.2 艷山姜精油對(duì)細(xì)胞抑制率

艷山姜精油對(duì)HepG2癌細(xì)胞的抑制作用如圖1所示。由圖1可看出，艷山姜精油對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，當(dāng)精油濃度在 25～200 μg/mL時(shí)，隨著精油濃度的升高，對(duì) HepG2細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，在200 μg/mL濃度下孵育12、24和48 h的細(xì)胞抑制率分別為21.4%、38.6%和56.8%；當(dāng)精油濃度在25～100 μg/mL時(shí)，孵育時(shí)間對(duì)精油的抑制率影響較小，孵育 12、24和48 h后，相同精油濃度條件下不同孵育時(shí)間的抑制率差異不顯著（p＞0.05），但當(dāng)精油濃度為200 μg/mL時(shí)，不同孵育時(shí)間對(duì)精油的抑制率影響顯著（p＜0.05）。

圖1 艷山姜精油對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用

續(xù)表1 艷山姜精油揮發(fā)組分分析

2.3 細(xì)胞凋亡分析

為探究艷山姜精油是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制HepG2腫瘤細(xì)胞的活性，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同濃度艷山姜精油處理引起的細(xì)胞凋亡，其中無(wú)精油處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率為2.56%（圖2）；精油濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率為3.2%；精油濃度為200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率為6.2%，相較于未利用精油處理的細(xì)胞，凋亡率提升了2.5倍。艷山姜精油引起的HepG2細(xì)胞凋亡如圖3所示。

圖2 不同濃度艷山姜精油下HepG2的凋亡率

圖3 艷山姜精油對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 基因表達(dá)分析

Caspase-3、Caspase-9、p53、PCNA的激活與細(xì)胞凋亡有關(guān)[11-12]，通過(guò) qPCR檢測(cè)經(jīng)艷山姜精油處理的HepG2細(xì)胞每24 h的mRNA表達(dá)水平。如圖4所示，艷山姜精油在不同濃度下Caspase-3、Caspase-9、p53三種基因 mRNA 表達(dá)水平均提高，PCNA基因mRNA表達(dá)水平降低；在艷山姜精油濃度為200 μg/mL時(shí)，Caspase-3、Caspase-9、p53的mRNA基因表達(dá)水平分別提高至對(duì)照組的2.57、1.74、1.50倍，PCNA的 mRNA表達(dá)水平降低至對(duì)照組的0.45倍。caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶[13]，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，caspase-3基因表達(dá)顯著提升（p=0.05），表明艷山姜精油具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。Caspase 9是參與啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡的蛋白酶，可以引起細(xì)胞死亡，經(jīng)艷山姜精油處理后，Caspase 9基因表達(dá)提升了 1.74倍，說(shuō)明艷山姜精油能促進(jìn) HepG2細(xì)胞程序性死亡。p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用，是重要的腫瘤抑制基因，能使癌細(xì)胞凋亡，從而防止癌變[14]。HepG2細(xì)胞經(jīng) 200 μg/mL的艷山姜精油處理后，p53基因表達(dá)提高了1.50倍，表明精油的處理促進(jìn)了p53途徑作用的發(fā)揮，有利于癌細(xì)胞凋亡。PCNA與細(xì)胞 DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[15]；經(jīng)精油處理后，PCNA的表達(dá)顯著降低（p＜0.05），表明癌細(xì)胞的增殖受到較好的抑制。

圖4 艷山姜精油對(duì)基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論

本研究利用水蒸氣蒸餾法，提取艷山姜精油，通過(guò) GC-MS分析可知，精油組分主要包含烯烴類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)，分別占揮發(fā)組分的 63.88%、19.52%。同時(shí)，利用人體肝癌細(xì)胞HepG2系，研究了艷山姜精油抑制腫瘤細(xì)胞增殖功效，通過(guò)CCK法分析精油對(duì)細(xì)胞增殖的影響，表明精油為200 μg/mL時(shí)，處理48 h后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)到 56.8%。利用流式細(xì)胞術(shù)分析艷山姜精油對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，200 μg/mL的精油處理24 h，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照提高了2.5倍。利用QPCR分析精油處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果表明，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因Caspase-3、Caspase-9、p53表達(dá)量均提升，而促進(jìn)細(xì)胞增殖的PCNA基因表達(dá)顯著降低。本研究表明艷山姜精油能抑制HepG2增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為開(kāi)發(fā)艷山姜健康食品提供了科學(xué)支撐。