吳曉雪，李 娜，袁利明，劉欣杰，劉素平，陳 寧，賽務(wù)加甫

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003)

隨著胚胎工程技術(shù)應(yīng)用逐漸增加，體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的條件也受到越來(lái)越多研究人員的重視。哺乳動(dòng)物精子中含有可溶性蛋白質(zhì)“精子因子”(或精子攜帶的卵母細(xì)胞激活因子)，這些可溶性蛋白質(zhì)可在配子融合后觸發(fā)Ca2+振蕩。它在精子中的存在可以解釋為什么胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)模仿受精導(dǎo)致小鼠和人類卵中Ca2+振蕩[1-2]。小鼠睪丸中存在的PLCζ基因可激活小鼠卵母細(xì)胞，影響小鼠早期胚胎的發(fā)育[3-5]。綿羊PLCζ基因可促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞在體外發(fā)育，其有望成為一種體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞的生物試劑[6],在人類和小鼠精子頂體中發(fā)現(xiàn)PLCζ亞型——NYD-SP27[7]。NYD-SP27可能會(huì)與PLCζ一樣有望成為一種新型的促進(jìn)卵母細(xì)胞體外發(fā)育的生物試劑。關(guān)于綿羊NYD-SP27基因?qū)d羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響還未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)顯微注射技術(shù)將pEGFP-N1-NYD-SP27導(dǎo)入到綿羊MⅡ卵母細(xì)胞中，觀察卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，探究NYD-SP27對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響，為揭示哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和卵母細(xì)胞 pEGFP-N1-NYD-SP27及pEGFP-N1均為石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。石河子市屠宰場(chǎng)采集綿羊卵巢，將卵巢放入裝有27℃～32℃生理鹽水(含雙抗)的保溫瓶中并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒小提試劑盒，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，BamHⅠ，Takara 公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，GIBCO公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 體式顯微鏡，顯微操作儀，二氧化碳培養(yǎng)箱，PCR儀，電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的準(zhǔn)備 PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27陽(yáng)性克隆菌液，利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，然后對(duì)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，雙酶切反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 10.0 μL，ddH2O 6.0 μL，1×H buffer 2.0 μL，EcoRⅠ 1.0 μL,BamHⅠ 1.0 μL。37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)鑒定結(jié)果正確的陽(yáng)性菌液。用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27，質(zhì)粒濃度不低于100 ng/μL，質(zhì)粒提取后放在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備 用加入抗生素的生理鹽水(37℃預(yù)熱)沖洗綿羊卵巢 2次～3次，剔除周圍的結(jié)締組織后繼續(xù)用加入抗生素的生理鹽水洗滌2次，將預(yù)熱平衡好的割卵液取出，并將卵巢放入割卵液中，用鑷子固定卵巢，肉眼可見(jiàn)卵巢表面含有澄清透明的卵泡，將這些卵泡用11 cm手術(shù)刀片切開(kāi)。在體視顯微鏡下觀察割卵液中胞質(zhì)均勻、包裹卵丘細(xì)胞3層及以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),并用撿卵針收集，取出預(yù)熱平衡2 h的成熟液，將挑選好的COCs放入成熟液中沖洗3次，然后將其放入成熟液微滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2。體外成熟培養(yǎng)22 h后,將COCs放入透明質(zhì)酸酶中輕微吹打除去顆粒細(xì)胞，將去除顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞放到顯微鏡下觀察成熟情況，挑出成熟的卵母細(xì)胞分組備用。

1.2.3 重組質(zhì)粒和空載體的顯微注射 將挑選出的卵母細(xì)胞隨機(jī)平均分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。將試驗(yàn)組和對(duì)照組的卵母細(xì)胞分別放入細(xì)胞松弛素中作用5 min，成熟液洗滌3次后，移入操作液微滴中。將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27用注射針吸取后，穿過(guò)透明帶，注入到卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，隨后將注射針緩慢退出(顯微注射操作均要在1 h內(nèi)完成)。對(duì)照組卵母細(xì)胞注射pEGFP-N1，方法與試驗(yàn)組一致。將兩組細(xì)胞分別放入SoFaa液微滴中，5% CO2、38.5℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察卵母細(xì)胞是否進(jìn)入2-細(xì)胞期，48 h后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞卵裂率，第7天統(tǒng)計(jì)桑葚胚率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)4次，用SPSS(25.0)軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

菌液進(jìn)行PCR后，將產(chǎn)物通過(guò)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)得到一條大小為1 617 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符；雙酶切鑒定重組質(zhì)粒后，得到一條為5 452 bp的載體線性片段，另一條為1 617 bp的目的片段(圖2)，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～8.菌液PCR產(chǎn)物

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000；1～2.EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；3.陰性對(duì)照

2.2 重組質(zhì)粒和空載體的顯微注射

顯微注射重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27及空載pEGFP-N1(圖3)48 h后，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到兩組卵母細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光(圖4)，顯微注射pEGFP-N1-NYD-SP27表達(dá)載體的卵母細(xì)胞發(fā)生卵裂，注射空載體的卵母細(xì)胞沒(méi)有卵裂。

圖3 卵母細(xì)胞顯微注射(20×)

A.注射pEGFP-N1空載體的卵母細(xì)胞(明場(chǎng))；B.注射pEGFP-N1空載體的卵母細(xì)胞(熒光)；C.注射pEGFP-N1-NYD-SP27重組質(zhì)粒的卵母細(xì)胞(明場(chǎng))；D.注射pEGFP-NYD-SP27重組質(zhì)粒的卵母細(xì)胞(熒光)

2.3 卵母細(xì)胞體外發(fā)育情況

載體注射48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞發(fā)育情況統(tǒng)計(jì)分析卵母細(xì)胞發(fā)育率。結(jié)果顯示，對(duì)照組的卵母細(xì)胞沒(méi)有繼續(xù)發(fā)育，而試驗(yàn)組的卵母細(xì)胞可以繼續(xù)發(fā)育(圖5)，卵裂率為46%±0.8%，差異極顯著(P<0.01)，桑葚胚率為13.3%±0.5%，差異極顯著(P<0.01)。

圖5 NYD-SP27注射組卵母細(xì)胞發(fā)育情況(20×)

3 討論

不同的物理或化學(xué)方法皆可使一些哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在體外繼續(xù)發(fā)育，最常用的為6D聯(lián)合離子霉素，但這種方法可能不利于卵母細(xì)胞的后期發(fā)育[8-10]。小鼠NYD-SP27和牛NYD-SP27在活性上具有特異性差異，這兩種蛋白在作用方式上可能存在差異[11]。精子NYD-SP27蛋白含量的物種間差異，以及卵母細(xì)胞NYD-SP27底物的定位和有效性的特異性差異[12-13]，可能有助于優(yōu)化卵母細(xì)胞體外發(fā)育的條件。PLCζ基因可以使綿羊卵母細(xì)胞在體外繼續(xù)發(fā)育，PLCζ基因在生殖發(fā)育中有重要作用[14]。PLCζ家族中的睪丸發(fā)育特異性蛋白-27基因(NYD-SP27)[15]是否能夠同PLCζ一樣具有使哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外發(fā)育的能力還有待研究，本研究將NYD-SP27導(dǎo)入到綿羊卵母細(xì)胞中，初步研究其對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的影響。

本研究將pEGFP-N1-NYD-SP27與pEGFP-N1通過(guò)顯微注射技術(shù)注入卵母細(xì)胞48 h后，兩組細(xì)胞均可在倒置熒光顯微鏡下清晰地觀察到綠色熒光。其中試驗(yàn)組注射重組質(zhì)粒pEGFP-N1-NYD-SP27的卵母細(xì)胞發(fā)生卵裂，并繼續(xù)發(fā)育到桑葚胚。對(duì)照組注射pEGFP-N1的卵母細(xì)胞未發(fā)生卵裂。在注射后48 h后，對(duì)兩組細(xì)胞的發(fā)育情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，注射pEGFP-N1的對(duì)照組卵母細(xì)胞卵裂率為0，桑葚胚率為0；注射pEGFP-N1-NYD-SP27的試驗(yàn)組卵母細(xì)胞卵裂率為46%±0.8%，桑葚胚率為13.3%±0.5%，差異極顯著(均P<0.01)，表明NYD-SP27可以促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞在體外發(fā)育。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞可在體外繼續(xù)發(fā)育與卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)有關(guān)[16-18]，PLCγ1基因調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，繼續(xù)發(fā)育[19]。PLCζ基因可引起小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子波動(dòng)[20]，使小鼠卵母細(xì)胞會(huì)繼續(xù)發(fā)育。NYD-SP27能夠引起牛、鼠卵母細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩，且牛卵母細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的振蕩是小鼠的10倍[21]。因此，NYD-SP27基因是否也是通過(guò)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平來(lái)影響綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的能力還有待探究。

本研究將NYD-SP27基因成功導(dǎo)入綿羊卵母細(xì)胞中，并使卵母細(xì)胞在體外成功發(fā)育到桑葚胚，初步探討了NYD-SP27蛋白對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的作用，為進(jìn)一步探討NYD-SP27基因?qū)Σ溉閯?dòng)物早期胚胎體外發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。