鐘馨林，鐘欣儀，林隆基，李岳峰，鄧優(yōu)錦**

（1．福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

中華鵝膏菌 （Amanita sinensis） 是擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌目 （Agaricales） 鵝膏菌屬（Amanita） 的一種大型真菌，通常與殼斗科和松屬植物的樹根共生，形成外生菌根[1]。中華鵝膏菌在我國主要分布在福建、云南、廣東、四川、貴州、湖南等省份。在福建的閩西北地區(qū)，如尤溪、德化、武平、漳平等縣域，中華鵝膏菌也被稱為松果傘、麻絲菇，主要生長在馬尾松林下，是當?shù)卮迕癫墒车闹饕吧秤镁籟2]。該菌子實體較大，高度及菌蓋直徑分別可達40 cm和12 cm，散發(fā)濃郁香氣，且味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟價值。

目前，人們對中華鵝膏菌的了解和研究較少。以福建省武平縣采集的一株野生中華鵝膏菌為研究對象，從生長環(huán)境、形態(tài)特征、分類地位、基因組特性以及氣味物質(zhì)等多個方面進行研究，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試菌株為中華鵝膏菌WPAS01，采集自福建省武平縣巖前鎮(zhèn)的將軍山?；蚪M測序和氣味物質(zhì)測定的供試樣品均使用其菌蓋（直徑為10 cm～12 cm）。

1.2 DNA提取與基因組測序

采用改良后的CTAB法提取中華鵝膏菌WPAS01總DNA。準確稱取0．2 g新鮮菌蓋樣品至2 ml離心管中，加入600 mL質(zhì)量濃度為2 g·mL-1的CTAB溶液和10 μL的 β-巰基乙醇，迅速混勻后置于65℃水浴鍋中水浴30 min，期間每5分鐘上下顛倒混勻20次；加入等體積的混合液V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1，充分混合，在 12 000 r·min-1、20℃下離心10 min，取上清液（重復2次）；加入異丙醇（體積為上清液體積的70%），混合均勻，于-20℃靜置30 min使DNA沉淀，4℃離心10 min，去除上清液；沉淀中加入1 mL經(jīng)預冷體積分數(shù)為70%的乙醇，上下顛倒搖勻，4℃離心10 min，去除上清液，通風晾干；加入50 μL無菌水（含0．05 mg RNase） 溶解沉淀，于37℃水浴鍋中水浴30 min。提取的DNA送由諾禾致源生物科技有限公司（天津） 進行文庫構(gòu)建和DNA測序，采用Illunima HiSeq X 10測序平臺測序，擬獲得4 Gb～6 Gb雙末端原始測序序列。

1.3 種屬鑒定

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載A.sinensis HKAS 25761的 ITS序列 （NCBI accession number：NR_119389．1），作為參考序列。采用本地BLASTN[3]將WPAS01菌株的原始測序reads序列與參考序列進行比對，設置E值為10-5，以表格形式輸出。通過Seqtk[4]軟件中的subseq命令提取出匹配的reads序列，利用CAP3程序[5]組裝序列。以ITS1和ITS4的引物序列為邊界，將組裝獲得的序列截成ITS序列。提交WPAS01菌株的ITS序列至GenBank的NR數(shù)據(jù)庫中，通過BLASTN從分子水平分析其分類地位。

下載NR數(shù)據(jù)庫中與WPAS01菌株的ITS序列相似性最高的DNA序列。采用Mega 11軟件[6]中的ClustalX進行序列比對，設置空位開口罰分為15．00，空位延伸罰分為6．66。采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，完全刪除空位或丟失數(shù)據(jù)。

1.4 基因組信息分析

采用Jellyfish軟件分析K-mer count分布，K-mer設置為21。將分布結(jié)果上傳至在線工具Genome Scope[7]預測WPAS01菌株基因組大小、雜合度和重復序列的比例。測序數(shù)據(jù)采用SPAdes 3．14．0軟件[8]進行組裝，設置梯度K-mer值為75、 97、 113和127。組裝結(jié)果采用BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs） 軟件[9]進行完整性評估，使用Funannotate軟件[10]進行基因組注釋。

1.5 氣味物質(zhì)測定與數(shù)據(jù)分析

稱取4 g～5 g新鮮的WPAS01菌蓋樣品至50 mL離心管中，在液氮中迅速降溫，保存于超低溫冰箱。樣品送由邁維代謝生物科技有限公司（浙江嘉興）進行預處理和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測序。

GC-MS分析獲取的原始數(shù)據(jù)文件使用安捷倫MassHunter軟件進行峰提取，獲得特征峰的質(zhì)荷比、保留時間和峰面積等信息；所得質(zhì)譜圖經(jīng)MWGC數(shù)據(jù)庫（邁維代謝建立的一個針對植物揮發(fā)性物質(zhì)的專一數(shù)據(jù)庫）檢索，并與數(shù)據(jù)庫中的標準圖譜核對，確定物質(zhì)化學組成；采用unit variance scaling（UV）歸一化處理方法計算代謝物含量數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPAS01菌株的生境與形態(tài)特征

WPAS01菌株子實體采集自福建省武平縣巖前鎮(zhèn)的將軍山馬尾松人工林區(qū) （116°6′48″E，24°48′48″N，海拔為460 m）。環(huán)境晝夜溫差較大，溫度為18℃～28℃，相對濕度維持在75%以上。WPAS01菌株的野生子實體形態(tài)及其生長環(huán)境見圖1。

圖1 WPAS01菌株的子實體形態(tài)與生長環(huán)境Fig．1 Fruit body morphology and growth environment of strain WPAS01

如圖1所示，所采集的WPAS01菌株子實體為單生；菌蓋呈傘狀，深灰色，干燥且具有皺紋，表皮被有深灰色殘余疣狀菌幕，成熟時直徑為7 cm～12 cm；菌肉和菌褶均為白色，菌柄近圓柱形，根部也被有深灰色殘余疣狀菌幕，內(nèi)部松軟。

2.2 WPAS01菌株的種屬鑒定

經(jīng)Illumina測序獲得300 bp的1．45×107對雙末端片段，共計4．36 Gb原始數(shù)據(jù)。經(jīng)組裝，WPAS01菌株的ITS區(qū)域介于ITS1和ITS4引物間的序列長度為695 bp。NCBI-BLASTN結(jié)果顯示，按score值排列的前20個均為中華鵝膏菌。使用Neighbor-joining法構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)進化樹，見圖2。

圖2 ITS序列的系統(tǒng)進化樹Fig．2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖2可知，21個菌株可以聚成4組，其中WPAS01、HKAS100492、AS3和WM42菌株歸為D組。HKAS100492菌株為2013年采自于福建省漳平縣山區(qū)（海拔為300 m）的中華鵝膏菌，與WPAS01菌株的ITS序列相似性為100%。WPAS01菌株與B組菌株的差異最大，其中FB-30955、FB-12189和FB-30983菌株的相似性均小于90%。

2.3 中華鵝膏菌WPAS01菌株的基因組特征

使用GenomeScope對基因組測序數(shù)據(jù)進行評估的結(jié)果顯示，WPAS01菌株的單倍體基因組為47．54 Mb，其中46．23%為重復序列，雜合率為2．02%。使用SPAdes軟件組裝原始數(shù)據(jù)，得到46 845個contig片段，Contig N50的值為4 661 bp，合計69．54 Mb，（G+C）含量為48．09%。對基因組裝的完整性進行評估，完整的BUSCOs（complete BUSCOs） 共有1 556個，占擔子菌總數(shù)的88．2%；片段化的BUSCOs（fragmented BUSCOs） 共有112個，占6．3%；缺失的BUSCOs（missing BUSCOs） 共有 96 個，占 5．5%；結(jié)果表明，組裝的基因組比較完整，基本滿足后續(xù)基因序列分析的需求。使用Funannotate軟件對所組裝的基因組進行預測，基因組基本情況見表1。

表1 中華鵝膏菌WPAS01菌株基因組的基本情況Tab．1 Basic information of Amanita sinensis strain WPAS01

由表1可知，中華鵝膏菌WPAS01菌株組裝基因組共得到21 619個基因，平均長度為1 096 bp，占基因組總長度的49．8%；蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS） 的平均長度為1 016 bp。

2.4 中華鵝膏菌WPAS01菌株的氣味物質(zhì)

中華鵝膏菌WPAS01菌株的揮發(fā)性成分經(jīng)GCMS聯(lián)機測定和計算機譜庫檢索，共檢測出135種揮發(fā)性成分，共同組成了其獨特香氣。按照氣味物質(zhì)的相對含量從高到低進行排列，前20種氣味物質(zhì)詳見表2。

表2 中華鵝膏菌WPAS01菌株子實體的20種主要氣味物質(zhì)特征Tab.2 Characteristics of 20 main odor substances from fruit body of Amanita sinensis strain WPAS01

如表2所示，中華鵝膏菌WPAS01菌株子實體中含量最高的前3種氣味物質(zhì)分別為4，6-二甲基-異噻唑并[5，4-b]吡啶-3-酮、3-[1-吡咯烷基]-氮雜環(huán)己烷、順-13-十八碳烯酸，均超過10%。這20種氣味物質(zhì)中，苯乙醛[18]、正十六烷酸[13]、1-辛烯-3-醇[14]、1-辛烯-3-酮[21]等的相關(guān)研究已較為深入。例如，苯乙醛的研究結(jié)果表明，其由芳香族氨基酸經(jīng)過艾氏途徑降解而成，具有類似風信子的香氣，在制作桂花、刺槐等香精時有提調(diào)香氣的作用，并廣泛運用于香料產(chǎn)業(yè)[18]。

分析得到的135種揮發(fā)性成分的化學性質(zhì)及分類，結(jié)果見圖3。

圖3 135種揮發(fā)性成分化合物類型分布情況Fig.3 Distribution of the 135 volatile component compound types

由圖3可知，在分析出的135種揮發(fā)性成分中，烴類有36種，占總數(shù)的26.7%；酸酯類有34種，占25.2%；醛類有19種，占14.1%；芳香族雜環(huán)化合物和酮類均分別占總數(shù)的10.4%；10種醇類占7.4%；酚類和醚類各1種，分別占總數(shù)的0.7%；其他6種揮發(fā)性成分占4.4%。由此可見，烴類、酸酯類和醛類是中華鵝膏菌WPAS01菌株的主要香氣成分。

將分析得到的135種揮發(fā)性成分與茶樹菇（Agrocybe chaxinggu）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、平菇 （Pleurotus ostreatus）、香菇 （Lentinus edodes）、金針菇（Flammulina velutipes）、金福菇（Tricholoma lobayense）、雙孢蘑菇 （Agaricus brunnescens） 7種常見食用菌所含的氣味物質(zhì)[23]進行對比，結(jié)果見表3。

表3 中華鵝膏菌WPAS01菌株與其他7種食用菌的共有氣味物質(zhì)分布情況Tab.3 Distribution of common odor substances between Amanita sinensis strain WPAS01 and other seven edible fungi

由表3可知，在其他7種常見的食用菌中也被發(fā)現(xiàn)的15種氣味化學物質(zhì)在WPAS01菌株中占135種氣味物質(zhì)總質(zhì)量的21.16%。其中，苯乙醛在WPAS01菌株中的含量最高，占5.67%；其也普遍存在于其他食用菌中，在除雙孢蘑菇外的6種食用菌中都有發(fā)現(xiàn)。中華鵝膏菌WPAS01菌株與金福菇共有的氣味物質(zhì)最多，為9種；與金針菇含有的氣味物質(zhì)最不相同，共有的只有2種。

2.5 苯乙醛的合成途徑關(guān)鍵酶基因檢測結(jié)果

苯乙醛是中華鵝膏與其他食用菌共有香氣物質(zhì)中含量最高的，也是生物合成2-苯乙醇的前體。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 中，生物合成2-苯乙醇有2種途徑，包括莽草酸途徑和艾氏通路[24]。對中華鵝膏菌WPAS01菌株包含編碼2個途徑所有關(guān)鍵酶的基因進行檢測，通過檢測結(jié)果擬合苯乙醛在其中的合成途徑，詳見表4和圖4。

表4 中華鵝膏菌WPAS01菌株基因組中苯乙醛合成通路的預測基因Tab.4 Predicted genes for phenylacetaldehyde synthesis pathways in genome of Amanita sinensis strain WPAS01

圖4 中華鵝膏菌WPAS01菌株中苯乙醛擬生物合成途徑Fig.4 Predicted biosynthesis pathway of phenylacetaldehyde in Amanita sinensis strain WPAS01

由表4和圖4可知，中華鵝膏菌WPAS01菌株包含編碼苯乙醛2個合成途徑中所有關(guān)鍵酶的基因，由此預測中華鵝膏均能利用這2個途徑合成苯乙醛。其中，莽草酸通路是經(jīng)由糖酵解生成的磷酸烯醇式丙酮酸和戊糖磷酸途徑生成的4-磷酸赤蘚糖，通過3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸合酶（WPAS01_001159）、分支酸合成酶 （WPAS01_001879，WPAS01_001106，WPAS01_016450）、分支酸變位酶 （WPAS01_004237）、預苯酸脫水酶（WPAS01_014788,WPAS01_007266，WPAS01_000604） 和苯丙酮酸脫羧酶 （WPAS01_001064，WPAS01_001143）等關(guān)鍵酶的逐步催化，形成苯乙醛。艾氏通路是進入體內(nèi)的L-苯丙氨酸先經(jīng)芳香氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（WPAS01_004649） 催化生成苯丙酮酸，再經(jīng)苯丙酮酸脫羧酶（WPAS01_001064，WPAS01_001143）催化生成苯乙醛。

3 討論

中華鵝膏菌群體間的形態(tài)特征和DNA序列具有一定的差異，菌蓋顏色呈灰白色至深灰色，表皮顏色呈灰色至深灰色，表皮狀菌幕殘余為疣狀至顆粒狀，菌柄內(nèi)部松軟至空心[25]。從福建省武平縣的馬尾松人工林區(qū)采集到的該中華鵝膏菌WPAS01菌株的菌蓋呈深灰色，表皮被深灰色疣狀菌幕殘余，菌柄內(nèi)部實心。根據(jù)ITS序列相似性，WPAS01菌株與HKAS100492菌株的ITS序列一致，且采集地均屬于龍巖市，兩地距離約為200 km，具有相近的生態(tài)環(huán)境。

采用SPAdes軟件對WPAS01菌株進行基因組裝，獲得基因組組裝大小為69.54 Mb，但該數(shù)值受到異核菌株雜合度、組裝軟件、測序片段長度、測序數(shù)據(jù)量和設定的K-mer值等因素的影響，無法代表該基因組的真實值。因此，通過采用GenomeScope對基因組測序數(shù)據(jù)進行評估，結(jié)果表明WPAS01菌株的單倍體基因組為47.54 Mb，雜合度為2.02%。已有研究對1 850個真菌物種進行評估[26]，真菌基因組的平均大小為44.2 Mb，該中華鵝膏菌WPAS01菌株基因組略大于這一平均值。

散發(fā)濃郁而特殊的香味是中華鵝膏菌的特色之一。通過檢測發(fā)現(xiàn)，中華鵝膏菌WPAS01菌株子實體中含有135種氣味化學物質(zhì)，通過與常見的7種食用菌進行對比，其中只有15種氣味化學物質(zhì)為與一種或多種食用菌共有，占化合物總數(shù)的11.1%，占總含量的21.16%。已有研究表明，不同的栽培基質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境以及生長環(huán)境，子實體的氣味化學物質(zhì)會產(chǎn)生一定的差異[27]。若使用同樣的栽培基質(zhì)在同一環(huán)境中培養(yǎng)中華鵝膏菌WPAS01菌株以及其他7種食用菌，同一發(fā)育時期的子實體中不同菌株共有的氣味化學物質(zhì)可能會產(chǎn)生變化，但特有香味化學物質(zhì)仍然是中華鵝膏菌氣味的主體。

此次通過對中華鵝膏菌WPAS01菌株氣味物質(zhì)的分析，以及預測其基因組在苯乙醛合成通路中的特性，以期為中華鵝膏菌在香料等精深加工產(chǎn)業(yè)中的開發(fā)利用提供參考。