史衛(wèi)東

( 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 南寧 530007 )

菜心是起源于中國南方的十字花科蔬菜，復(fù)種指數(shù)高，種植面積大，品種繁多。菜心種質(zhì)資源狹窄，開展種質(zhì)創(chuàng)新及鑒定對品種選育很重要。目前，基因組分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于菜心遺傳多樣性分析，ISSR、SCoT和AFLP分析表明菜心遺傳多樣性較低(孫雪梅等，2010；Shi et al., 2011；史衛(wèi)東等，2015)，AFLP和SCoT分析表明菜心遺傳變異主要來源于種內(nèi)(Shi et al., 2011；史衛(wèi)東等，2015)。菜心分子標(biāo)記分類與傳統(tǒng)分類的一致性和差異性并存，SRAP多態(tài)性的聚類分析結(jié)果與基于表型特征的分類結(jié)果基本一致(李桂花等，2012)，SCoT標(biāo)記的分類結(jié)果與熟期分類結(jié)果比較一致(史衛(wèi)東等，2015)，但分子標(biāo)記聚類分析與表型分類也存在不一致的情況(孫雪梅等，2010；李桂花等，2012)，說明菜心除了具有DNA序列變化之外，還具有不依賴于DNA序列的表觀遺傳變化，這種表觀遺傳變化并不能被基因組標(biāo)記檢測出來，因此，有必要開展菜心表觀遺傳多樣性的研究，以提高鑒定效率和準(zhǔn)確性。

DNA甲基化不改變DNA序列的遺傳修飾，在減數(shù)分裂和有絲分裂階段可以穩(wěn)定遺傳(Kakutani et al., 1999)，因而成為植物最重要的表觀遺傳標(biāo)記。DNA甲基化可以發(fā)生在所有序列環(huán)境中，包括對稱的CG和CHG序列以及非對稱的CHH序列(Chan et al., 2005)，檢測CG序列的甲基化狀態(tài)常用甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP)，MSAP技術(shù)以其簡單可靠及費用較低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于擬南芥、甘藍、芥藍和油菜等十字花科植物的DNA甲基化分析(Cervera et al., 2002；陸光遠等，2005；Salmon et al., 2008；史衛(wèi)東等，2012；Zhang et al., 2013)，基于熒光標(biāo)記引物擴增的F-MSAP也已應(yīng)用于辣椒、雞和牡蠣等動植物的DNA甲基化分析(徐青等，2005；姜群等，2014；徐小萬等，2021)。

本研究旨在通過檢測49份菜心的DNA甲基化水平和模式變化，揭示菜心表觀遺傳多樣性形成的機理，為進一步提高雜交育種鑒定準(zhǔn)確性和效率提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

49份菜心為廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所收集和創(chuàng)制的品種資源和自交系，包括7份自交系親本(1號、2號、3號、5號、6號、7號、14號)，8份雙自交系雜種(21號、24號、26號、31號、34號、36號、47號、48號)，17份單自交系雜種(15號、18號、19號、20號、22號、23號、25號、29號、30號、32號、33號、35號、37號、39號、43號、44號、49號)，7份商品種(4號、8號、9號、10號、11號、12號、13號)，10份商品種雜種(16號、17號、27號、28號、38號、40號、41號、42號、45號、46號)，共計14份品種和35份雜種。田間試驗于2014年在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地進行，每份資源小區(qū)面積5 m，采收期隨機選取5株，調(diào)查記載形態(tài)指標(biāo)，取嫩葉混合凍存于-20 ℃。

1.2 方法

基因組DNA的提?。翰捎肅TAB法提取基因組總DNA。F-MSAP：Taq DNA 聚合酶、緩沖液、dNTP和熒光引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。酶切連接一步法反應(yīng)體系：DNA(50 ng·μL)4 μL，Adapter 1 μL，EcoR I/MspⅠ或 EcoRⅠ/HpaⅡ 2 μL，10 X Reaction buffer 2.5 μL，10 mmol·LATP 2.5 μL，T4 Ligase 1 μL，HO 7 μL。分別用EcoRⅠ/MspⅠ組合、EcoRⅠ/HpaⅡ組合對同一基因組DNA酶切，混勻后離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。預(yù)選擴增反應(yīng)：反應(yīng)體系25 μL為DNA 2 μL、預(yù)擴增引物1 μL、dNTPs 0.5 μL、10 X PCR buffer 2.5 μL、Taq 酶0.5 μL、ddHO 18.5 μL。離心數(shù)秒，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 80 s，72 ℃ 5 min；4 ℃。選擇性擴增反應(yīng)：預(yù)選擴增產(chǎn)物1∶20稀釋后作為選擴增模板。反應(yīng)體系25 μL：DNA 2 μL，10 X PCR buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，EcoR I 引物1 μL，HpaⅡ/ MspⅠ引物1 μL，Taq酶0.5 μL，ddHO 17.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s；每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，12個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 80 s，23個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃。接頭及引物序列見表1。

表 1 MSAP擴增接頭和引物序列(HM: Hpa II/Msp I)Table 1 Adaptors and primer sequences used for MSAP amplications (HM: Hpa II/Msp I)

數(shù)據(jù)讀取及統(tǒng)計分析：將選擇性擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用ABI377測序儀檢測，通過GENESCAN軟件分析，按照“無帶為0，有帶為1”記錄數(shù)據(jù)矩陣。利用軟件Excel 2007計算甲基化多態(tài)性比例和甲基化類型，將DNA甲基化模式分為四種類型：Ⅰ型為HpaⅡ和MspⅠ雙酶切的(1，1)，表示CCGG位點未甲基化；Ⅱ型為HpaⅡ酶切，MspⅠ不能酶切的(1，0)，表示CCGG位點C外側(cè)半甲基化；Ⅲ型為HpaⅡ不能酶切，MspⅠ酶切的(0，1)，表示CCGG位點內(nèi)側(cè)C全甲基化；Ⅳ型為HpaⅡ和MspⅠ都不能酶切的(0，0)，表示抑制全甲基化CCGG位點酶切，也可能是突變位點。利用軟件POPGENE 1.32進行表觀遺傳多樣性分析，統(tǒng)計多態(tài)性位點百分率(P%)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)、Nei’s 遺傳距離、遺傳相似系數(shù)和基因流等。利用軟件MEGA 4.0按照UPGMA方法進行聚類分析。利用軟件GenAlEx 6.41進行主成分分析和AMOVA分析。引物多態(tài)信息量 (polymorphism information content, PIC)，公式為=1-∑，式中表示第個基因型頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA甲基化多態(tài)性分析

利用8對條帶清晰和多態(tài)性較好的引物進行49份菜心的F-MSAP擴增，一共擴增出1 728條帶，其中多態(tài)性條帶1 479條，多態(tài)性比例為86%。8對引物的多態(tài)性條帶分別為196、186、200、173、188、200、200、178條，平均為190條，多態(tài)性比例為88%，PIC值分別為0.230 4、0.201 2、0.247 8、0.237 3、0.244 7、0.241 8、0.234 0、0.224 6，均值為0.232 7，多態(tài)性位點的PIC值均位于0～0.5 之間。按照總平均、自交系、品種和雜種進行分類分析，49份菜心、7份自交系親本、8份雙自交系雜種、17份單自交系雜種、7份商品種、10份商品種雜種的平均多態(tài)性分別為68.15%、65.33%、68.55%、67.25%、69.54%、70.09%，表明F-MSAP檢測效率較高，菜心DNA甲基化多態(tài)性較高，商品種的DNA甲基化多態(tài)性比自交系及其雜種高，雜種的DNA甲基化多態(tài)性比親本高，雜交可以提高DNA甲基化多態(tài)性。

2.2 表觀遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析顯示，49份菜心的平均表觀觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、期望雜合度分別為1.702 0、1.201 0、0.142 7、0.241 0，7份自交系親本分別為1.668 0、1.190 0、0.135 4、0.228 9，8份雙自交系雜種分別為1.682 9、1.188 9、0.135 4、0.230 1，17份單自交系雜種分別為1.707 5、1.212 0、0.148 7、0.249 1，7份商品種分別為1.729 5、1.202 0、0.143 5、0.243 4，10份商品種雜種分別為1.712 1、1.200 0、0.143 4、0.243 2。結(jié)果顯示，雙自交系雜種的Shannon多樣性指數(shù)和期望雜合度分別等于和大于自交系親本，單自交系雜種兩者均大于自交系親本，商品種與商品種雜種兩者變化很小，表明菜心表觀遺傳多樣性較低，自交系雜種的表觀遺傳多樣性比親本高，單自交系雜種的表觀遺傳多樣性比雙自交系雜種高，雜交能夠增加自交系雜種的表觀遺傳差異。49份菜心、7份自交系親本、8份雙自交系雜種、17份單自交系雜種、7份商品種、10份商品種雜種的表觀遺傳距離分別為0.009 4、0.009 5、0.009 4、0.009 4、0.008 6和0.009 6，結(jié)果顯示，自交系親本之間的表觀遺傳距離大于自交系雜種和商品種，單、雙自交系雜種之間相同，但均小于商品種，商品種雜種大于商品種，表明自交增加自交系親本的表觀遺傳距離，雜交增加商品種雜種的表觀遺傳距離。AMOVA分析表明，表觀遺傳變異主要來源于種內(nèi)(96%)，種間較少(4%)(=0.036)?；蛄鳛?.681 5，大于1，表明菜心均質(zhì)化嚴重，遺傳分化受到抑制，大部分遺傳變異來源于種內(nèi)，只有少量的遺傳變異存在于種間。

2.3 DNA甲基化分析

由表2可知，DNA甲基化水平分析顯示的49份菜心、7份自交系親本、8份雙自交系雜種、17份單自交系雜種、7份商品種、10份商品種雜種的甲基化率分別為68.14%、65.26%、68.99%、67.39%、69.86%、69.29%。DNA甲基化模式分析顯示的未甲基化率分別為31.86%、34.74%、31.01%、32.61%、30.14%、30.71%，半甲基化率分別為33.18%、32.54%、37.80%、31.09%、33.01%、33.67%，全甲基化率分別為34.96%、32.72%、31.20%、36.30%、36.85%、35.62%。結(jié)果顯示，49份菜心的DNA甲基化水平較高，全甲基化水平高于未甲基化和半甲基化，以全甲基化模式為主，自交系雜種的DNA甲基化水平比親本高，其中7份自交系未甲基化水平升高導(dǎo)致甲基化水平降低，8份雙自交系雜種去甲基化水平升高，17份單自交系雜種全甲基化升高造成甲基化水平升高，7份商品種和10份商品種雜種的DNA甲基化水平和模式變化很小，表明自交能夠降低DNA甲基化水平，雜交通過DNA甲基化模式變化增加了自交系雜種的DNA甲基化水平。

表 2 49份菜心的表觀遺傳多樣性以及DNA甲基化模式和水平Table 2 Epigenetic diversity and DNA methylation pattern and level in 49 Chinese flowering cabbages

續(xù)表 2

續(xù)表 2

2.4 聚類分析

如圖1所示，利用UPGMA聚類分析方法，約在Nei’s 遺傳距離0.42處將49份菜心分成五類。第一類7份包括1號、16號、18號、19號、20號、21號和22號，其中1號是19號、20號、21號、22號的母本，‘特青60天粗條菜心’是16號、18號的母本。第二類2份包括38號和44號，‘綠寶701’分別是38號的父本和44號的母本。第三類14份包括2號、5號、6號、8號、9號、10號、11號、15號、23號、35號、36號、39號、46號和47號，其中2號是23號的母本，6號是35號、36號的母本，‘桂柳十月柳葉菜心’是15號和47號的父本。第四類11份包括12號、14號、17號、24號、37號、40號、41號、42號、43號、45號和48號，其中‘綠寶701’是41號、42號、43號和45號的母本，‘綠寶701’是17號、40號和37號的父本，14號是48號的母本。第五類15份包括3號、4號、7號、13號、25號、26號、27號、28號、29號、30號、31號、32號、33號、34號和49號，其中3號是25號、26號的母本，4號是27號的母本，5號是29號、30號、31號、32號、33號和34的母本，‘綠寶701’是28號、33號和49號的父本。

具體編號見表2。下同。See Table 2 for specific numbers. The same below.圖 1 基于遺傳距離的49份菜心的UPGMA聚類圖Fig. 1 UPGMA dendrogram of 49 Chinese flowering cabbages based on Nei’s genetic distance

14個品種分散在各類中，35份雜種傾向于按照母本親緣關(guān)系分類，表明雜種更多地遺傳了母本的DNA甲基化狀態(tài)，母本DNA甲基化對雜種表觀遺傳多樣性具有較大影響。

2.5 主成分分析

利用GenAlEx 6.41軟件包中的PCA模塊進行主成分分析(圖2)，結(jié)果顯示49份菜心明顯分為I、II、III、IV和V五組，五組分布與聚類分析的五類結(jié)果基本一致，表明F-MSAP檢測效率很高，準(zhǔn)確性也很高。第一和第二主坐標(biāo)的貢獻率分別為19.44%和11.81%，可解釋31.25%的表觀遺傳變異。

圖 2 49份菜心主成分分析Fig. 2 Principal coordinates analyses(PcoA) of 49 Chinese flowering cabbages

3 討論與結(jié)論

3.1 DNA甲基化多態(tài)性分析

經(jīng)典的MSAP利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測DNA甲基化多態(tài)性，F(xiàn)-MSAP則是利用熒光標(biāo)記引物結(jié)合毛細管電泳檢測，因此檢測效率和靈敏度得以較大提高，徐青等(2005)利用F-MSAP檢測發(fā)現(xiàn)雞F代的甲基化多態(tài)模式約有95%來自親本，變異的甲基化位點約5%，姜群等(2014)發(fā)現(xiàn)F-MSAP檢測牡蠣的效率是MSAP的2倍以上，多態(tài)性檢測率提升了9%。F-MSAP不足之處是只能識別基因組的 CCGG 位點，不能檢測CHG序列以及非對稱的CHH序列，實際的甲基化水平有所低估(McClelland et al., 1994; Salmon et al., 2008)，另外MSAP基于AFLP技術(shù)開發(fā)，檢測的多態(tài)性片段大小有所限制。與十字花科親緣植物相比，49份菜心的DNA甲基化多態(tài)性較高，高于擬南芥(24%～34%)、白菜幼苗莖尖(30.42%)、甘藍(53.3%～60.7%)、油菜種子(15.7%)、芥藍(47%)、甘藍型油菜基因滲入系(33.4%～39.8%)的DNA甲基化多態(tài)性 (Cervera et al., 2002；Li et al., 2002；陸光遠等，2005；Salmon et al., 2008；史衛(wèi)東等，2012；Zhang et al., 2013)，也高于菜心ISSR(56.31%)、SRAP(40.2%)、SCoT(36%)的基因組多態(tài)性(孫雪梅等，2010；李桂花等, 2012；史衛(wèi)東等，2015)。與菜心AFLP和SCoT分析相比，F(xiàn)-MSAP進一步提高了鑒定效率和準(zhǔn)確性(Shi et al.,2011；史衛(wèi)東等，2015)，主成分分析也比較一致，表明F-MSAP可以作為一種檢測菜心DNA甲基化的有效方法，極大地提高菜心DNA甲基化的檢測效率和靈敏度。

3.2 表觀遺傳多樣性分析

Shannon多樣性指數(shù)是評價種內(nèi)和種間遺傳多樣性水平的指標(biāo)，其值越大表示遺傳多樣性越高，49份菜心的表觀Shannon多樣性指數(shù)(0.142 7)小于基因組ISSR(0.229)、AFLP(0.472)和SCoT(0.217)的Shannon多樣性指數(shù)(孫雪梅等，2010；Shi et al., 2011；史衛(wèi)東等，2015)，表觀遺傳距離(0.009 4)小于ISSR(0.029～0.344)、AFLP(0.112)、SCoT(0.428)等基因組標(biāo)記的遺傳距離(孫雪梅等，2010；Shi et al., 2011；史衛(wèi)東等，2015)，據(jù)此推測菜心表觀遺傳多樣性較低且低于基因組遺傳多樣性，與芥藍的表觀遺傳多樣性水平較低的結(jié)果相一致(史衛(wèi)東等，2012)，與西瓜、水稻和辣椒的基因組甲基化多樣性高于遺傳多樣性的結(jié)果不同(Nimmakayala et al., 2011；彭海等，2014；徐小萬等，2021)，這可能與不同的比較方法有關(guān)，也可能與不同物種之間表觀遺傳多樣性和基因組遺傳多樣性存在較大的差異有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)菜心自交系親本的表觀遺傳距離大于商品種，表明自交增加了表觀遺傳多樣性水平，豐富了遺傳背景，商品種表觀遺傳多樣性最低，但商品種雜交增加了表觀遺傳多樣性。

3.3 DNA甲基化分析

研究表明在不同生態(tài)型擬南芥上35%～43% 的 CCGG位點為DNA甲基化敏感位置，而在同一生態(tài)型內(nèi)則高度保守(Cervera et al., 2002)，甘藍品種或品系具有更多的甲基化片段(Salmon et al., 2008)，甘藍型油菜基因滲入系呈現(xiàn)高頻率的高甲基化(Zhang et al., 2013)。本研究菜心自交系親本、自交系雜種、商品種和商品種雜種的未甲基化、半甲基化和全甲基化比例各占1/3以上，但全甲基化在商品種較高，表明菜心以全甲基化模式為主，菜心與擬南芥、甘藍具有相似的甲基化變化，這是否是十字花科植物的普遍現(xiàn)象，還有待研究。

菜心自交系的DNA 甲基化水平降低，與大白菜自交系的 DNA 甲基化水平降低相一致(Liu et al., 2018)，從甲基化組角度說明菜心與大白菜親緣關(guān)系較近，因而具有相似的表觀遺傳變化。擬南芥雜種的甲基化模式變化經(jīng)常發(fā)生在親本之間的差異甲基化區(qū)域(Greaves et al., 2012)，親本之間的甲基化差異可能是親本和雜種之間甲基化差異的主要原因(Shen et al., 2012)。菜心單自交系雜種和雙自交系雜種的甲基化水平都比親本高，與擬南芥 C24/Landsberg F雜種的甲基化水平增加相一致(Greaves et al., 2012)，但兩個雜種的DNA甲基化模式變化有所不同，因此造成親本自交系和商品種的DNA甲基化差異。菜心自交系隨著不斷自交純合，基因組雜合性減低，表現(xiàn)為DNA甲基化水平降低和未甲基化水平升高，菜心商品種為開放授粉種子，基因組雜合性較高，表現(xiàn)為全甲基化水平較高。據(jù)此推測菜心單自交系雜種的全甲基化水平較高可能是由于自交系與商品種雜交造成的，與擬南芥正反交 F中一個親本等位基因的甲基化水平改變?yōu)榱硪粋€親本甲基化水平有相似之處(Greaves et al., 2012)。菜心雙自交系雜種表現(xiàn)為高水平的去甲基化，與小麥黑麥遠緣雜交后代的半甲基化水平極顯著高于雙親本的半甲基化水平有相似之處(朱朝陽等，2018)。DNA去甲基化的功能和機制是生物學(xué)倍受爭議的研究領(lǐng)域，活躍的DNA去甲基化對修剪基因組的甲基化模式很重要，甲基化和去甲基化的動態(tài)調(diào)控對于保持植物表觀基因組的可塑性也很重要(Zhu et al., 2007)。菜心親本差異、自交或雜交引起后代DNA甲基化模式和水平變化，表明菜心基因組可塑性可能很強，表觀遺傳多樣性形成機理還有待深入研究。

3.4 雜交對表觀遺傳多樣性的影響

表型與分子標(biāo)記都可以檢測菜心親緣關(guān)系，但兩者的鑒定結(jié)果并不十分相符，可能的原因包括品種資源的遺傳背景比較復(fù)雜，基因組分子標(biāo)記優(yōu)化不足或不適合，以及不能檢測出表觀遺傳變化等。本研究49份菜心的聚類結(jié)果清晰可靠，14份菜心品種呈現(xiàn)較大的表觀遺傳變化，其中7份自交系親本分散在各類中，與自交增加了表觀遺傳距離相一致，說明自交增加了自交系親本的表觀遺傳差異。研究表明擬南芥互交雜種具有完全相同的遺傳構(gòu)成，雜交后母本和父本基因組可能不會平等地影響雜種DNA甲基化的變化，雜種的甲基化重塑可能有利于雜種優(yōu)勢(Shen et al., 2012)。本研究35份自交系雜種和商品種雜種分布在各類中，傾向于按照母本親緣關(guān)系分類，與雜交稻甲基化狀態(tài)與母本較近的結(jié)果相同(彭海等，2014)，與擬南芥不同基因型的甲基化多態(tài)性不相關(guān)，親緣關(guān)系緊密的擬南芥并不歸為一類的結(jié)果不同(Cervera et al., 2002)，與擬南芥的基因甲基化與親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果不相關(guān)的結(jié)果不同(Matthew et al., 2007)，菜心母本親緣關(guān)系可能對雜種表觀遺傳多樣性具有較大影響，因此在利用不同菜心親本配組時，要注重對母本的選擇，依據(jù)母本親緣關(guān)系對雜種后代分類可能會起到事半功倍的效果，對菜心種質(zhì)資源研究和育種具有極其重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，通過F-MSAP檢測菜心DNA甲基化變化，揭示了菜心表觀遺傳多樣性形成機理，分析和預(yù)測了雜種后代的表觀遺傳差異，提高了鑒定效率和準(zhǔn)確性，為進一步開展雜交育種提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。