張祿璐 梁永林 張李香 蘆文娟 安冬

運(yùn)動性疲勞（Exercise-induced fatigue，EF）是由機(jī)體運(yùn)動本身所引起的，機(jī)體生理過程不能持續(xù)其功能在特定水平和/或不能維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度，出現(xiàn)運(yùn)動能力下降的現(xiàn)象[1]。主要表現(xiàn)為動作遲緩、協(xié)調(diào)能力下降、記憶能力減退、腦力活動遲鈍、呼吸急促等[2]。長時間處于EF 狀態(tài)將造成細(xì)胞、組織、臟腑及神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重危害人體健康。EF 的發(fā)生機(jī)理復(fù)雜，現(xiàn)有的EF 產(chǎn)生假說主要包括：能量耗竭學(xué)說、代謝產(chǎn)物堆積學(xué)說、自由基學(xué)說、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)學(xué)說、疲勞鏈學(xué)說、保護(hù)抑制學(xué)說等[3，4]。隨著體育事業(yè)興起，EF 也隨之增加。目前EF 的藥物治療多以輔酶a、?；撬岬戎苿橹?，但只能暫時性提升運(yùn)動能力，長期應(yīng)用存在副作用、療效不確切等問題，并且無法從根本上提高機(jī)體耐疲勞性。

旋覆花首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[5]，別名金沸草，為菊科植物旋覆花的頭狀花序。其味苦、辛、咸，性微溫，歸肺、脾、腎、大腸經(jīng)，具有化痰平喘、降氣止嘔、疏肝通絡(luò)、蠲飲利水、補(bǔ)益的功效。現(xiàn)代研究表明，旋覆花主要化學(xué)成分包括黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、萜類、甾醇類、黃銅醇類等，具有抗炎、抗肝損傷、抗氧化等作用[6]。研究證實，旋覆花在一定程度上可以增強(qiáng)體內(nèi)代謝、促進(jìn)體質(zhì)恢復(fù)、提高機(jī)體耐缺氧及抗疲勞的能力[7]。但旋覆花治療EF 的具體作用機(jī)制目前還沒有系統(tǒng)驗證與方法學(xué)評價。因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從分子水平探究旋覆花在治療EF 中的潛在價值，并且分析有效活性成分及其作用機(jī)制，為后期EF 的治療提供新的依據(jù)和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 旋覆花有效成分及靶點的篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）[8]檢索旋覆花的全部活性成分。以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似度（Drug-likeness，DL）≥0.18 為指標(biāo)篩選旋覆花活性成分[9]。同時采用TCMSP 預(yù)測活性成分對應(yīng)的靶蛋白。在UniProt 平臺[10]找到與作用靶點相對應(yīng)的基因名，物種來源選擇人類（“Homo sapiens”）。

1.2 EF 疾病相關(guān)靶點的獲取及整合以“exercise-induced fatigue”為檢索詞，應(yīng)用GeneCard、OMIM、DRUGBANK、pharmGKB 等數(shù)據(jù)庫獲取EF 疾病靶點[11～14]。合并4 個疾病數(shù)據(jù)庫中收集的疾病靶點，并刪除重復(fù)靶點。獲取疾病靶點與旋覆花作用靶點之間的交集，即旋覆花治療EF 的潛在治療靶點，利用R 語言制作韋恩圖。

1.3 旋覆花-有效成分-交集靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將旋覆花活性成分、旋覆花治療EF 的潛在治療靶點導(dǎo)入 Cytoscape 制作“旋覆花-活性成分-潛在治療靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 靶點蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將中藥-疾病共有基因輸入String[15]，選擇“Homo sapiens”，將最小相互作用閾值設(shè)為中等“Highest confidence＞0.9”，其余設(shè)置為默認(rèn)值進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。使用CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，使用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，以度中心性（DC）、介數(shù)中心度（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心度（EC）、局部邊連通性（LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）為節(jié)點關(guān)鍵指標(biāo)，篩選大于六者中位數(shù)的成分作為核心靶點基因，結(jié)合cytohubba 插件中的degree 算法篩選出排名前三的關(guān)鍵靶基因。

1.5 GO 功能和KEGG 信號通路富集分析使用R語言安裝Bioconductor 數(shù)據(jù)包對藥物疾病共有靶點進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，生成條形和氣泡圖。

1.6 分子對接運(yùn)用PDB 和PubChem 平臺分別獲取靶點3D 結(jié)構(gòu)和藥物分子結(jié)構(gòu)，使用Autodock vina 軟件進(jìn)行分子對接，使用PyMOL 等軟件分析對接強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 旋覆花有效成分篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索有旋覆花的成分，并按OB ≥30%和DL ≥0.18 作為篩選旋覆花潛在活性成分的標(biāo)準(zhǔn)，共獲得旋覆花活性化合物19 個（見表1）。

表1 旋覆花有效成分

2.2 旋覆花活性成分治療EF 預(yù)測靶點的篩選按1.2 項的研究方法獲取并去除重復(fù)EF 疾病靶點共計3 643 個（見圖1）。運(yùn)用R 語言獲取旋覆花-EF交集靶點制作韋恩圖，交集靶點151 個（見圖2）。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵藥物成分該網(wǎng)絡(luò)有197 個節(jié)點，其中藥物節(jié)點1 個、藥物成分節(jié)點16 個、靶基因節(jié)點180 個，408 條邊（見圖3）。選擇連接度作為參考依據(jù)，獲取的藥物成分連接度排名前三的為槲皮素（131 個）、山柰酚（54 個）、木犀草素（53 個），提示這些成分為旋覆花治療EF 的關(guān)鍵有效藥物成分。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果將旋覆花-EF 共同靶點導(dǎo)入String 中，進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（見圖4）。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，利用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 插件進(jìn)行兩次篩選，獲取核心靶蛋白為NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子家族（RELA）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、CDKN1A、MAPK1、RB1、抑癌基因（TP53）、核因子-κB 抑制因子α（NFKBIA）、轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（AP-1）家族成員JUN、雌激素受體1（Estrogen receptor 1，ESR1）、MAPK14、HSP90AA1、AKT1、核蛋白轉(zhuǎn)錄因子（FOS）、MYC，其中degree 值排名前三的為TP53、HSPgoAAI、Akt1（見圖5）。

2.5 旋覆花和EF 重合靶點GO 與KEGG 通路富集分析GO 注釋及KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示共得到GO 富集條目2 421 個，其中細(xì)胞生物過程（BP）2 160 個，包括對脂多糖的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)等。細(xì)胞組成（CC）64 個，包括膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、質(zhì)膜筏等。分子功能（MF）197 個，包括脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活動、配體-激活等。選擇排名前10 的通路繪制條形圖（見圖6）。KEGG 預(yù)測靶點通路156 個，列舉前30條關(guān)鍵信號集通路（見圖7）。

2.6 “活性成分-靶點”分子對接選擇連接度值排名前三的活性成分：槲皮素、木犀草素、山柰酚和degree 值前3 的潛在核心靶點TP53、HSP90AA1、AKT1 進(jìn)行分子對接，驗證預(yù)測結(jié)果（見表2）。一般認(rèn)為結(jié)合能越低構(gòu)象越穩(wěn)定，小于-7kcal/mol 表明蛋白與配體可緊密結(jié)合。結(jié)果顯示，旋覆花有效成分與TP53、HSP90AA1、AKT1 有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，驗證了本研究數(shù)據(jù)的可靠性，運(yùn)用AutoDock 將對接結(jié)果進(jìn)行可視化，繪制3D 示意圖（見圖8）。

表2 旋覆花活性成分與靶點結(jié)合能

3 討論

根據(jù)EF 的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸于“勞倦”、“勞損”、“虛勞”的范疇，其病因病機(jī)在醫(yī)學(xué)古籍中已有詳細(xì)記載[16]?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》[17]言明：“所有勞倦，形氣衰少”；《中藏經(jīng)·勞傷論》[18]：“勞者，勞于神氣也；傷者，傷于形容也”；《丹溪心法·耳聾》[19]：“勞役傷于血氣”；《仁齋直指》[20]：“終日役役，神倦力?！?。由此可見，臟腑耗損、氣血耗傷為EF 發(fā)生的主要原因，故臨床治療多以補(bǔ)益法為主。旋覆花在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載具有補(bǔ)中的功效，且《開寶本草》[21]言明其可“通血脈，益色澤”。李然等[22]通過對古代本草、古代方劑考察探究旋覆花的潛在功能時發(fā)現(xiàn)，在《普濟(jì)方》中含有旋覆花治療虛損癥候的方劑達(dá)22 首，因此推測旋覆花具有補(bǔ)益的功用。

本研究通過中藥數(shù)據(jù)庫信息的挖掘，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，獲得旋覆花16 個活性成分。根據(jù)OB 值排序，排前三的活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚，推測這三種成分為旋覆花治療EF 的主要成分，而其他成分予以輔助。槲皮素是六類黃酮化合物中的一類，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)特性[23]。5-羥色胺（5-HT）是一種主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，力竭運(yùn)動后5-HT/多巴胺比值的升高促進(jìn)了中樞疲勞的發(fā)生[24]。研究表明，槲皮素可恢復(fù)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，降低腦中5-HT 的表達(dá)，延緩或消除運(yùn)動性中樞疲勞[25]。研究表明，木犀草素通過增加大鼠原代肝細(xì)胞的HO-1 和谷氨酸半胱氨酸連接酶，減少乳酸、血尿素氮等代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，改善肌肉機(jī)構(gòu)和肝糖原的合成、儲備，從而降低疲勞感[26]。此外，木犀草素能抑制力竭運(yùn)動后肝及骨骼肌中白細(xì)胞介素-6（IL-6）和IL-1β等促炎因子的表達(dá)，預(yù)防慢性疲勞的產(chǎn)生[27]。多酚類為天然抗疲勞活性成分，然而山柰酚治療EF的作用機(jī)制缺乏文獻(xiàn)支持還需進(jìn)一步實驗證明。

篩選出的核心靶點中，TP53、HSP90AA1、Akt1的degree 值排名靠前，預(yù)測為治療EF 的關(guān)鍵節(jié)點蛋白。TP53 在促線粒體生物發(fā)生、節(jié)能量代謝、平衡氧化應(yīng)激等過程中起重要作用[28]。TP53 的缺失使能量產(chǎn)生方式由有氧呼吸轉(zhuǎn)向無氧糖酵解，線粒體呼吸強(qiáng)度降低影響能量的產(chǎn)生，因而使機(jī)體耐疲勞性下降[29]。HSP90AA1 類屬熱休克蛋白家族，參與多種生物過程，對自由基破壞的生物膜機(jī)構(gòu)起到重要的保護(hù)作用[30]。Akt1 在多種組織中廣泛表達(dá)，激活后可參與細(xì)胞凋亡、葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)合成等多種細(xì)胞過程。研究表明，Akt1 可通過活化PGC1-a 促進(jìn)線粒體生物合成，為細(xì)胞組織提供能量[31]。

GO 富集分析顯示旋覆花治療EF 涉及抗氧化反應(yīng)、對金屬離子響應(yīng)、活性氧的代謝過程、膜微結(jié)構(gòu)域等生物過程。KEGG 通路富集分析顯示，旋覆花治療EF 具有多條通路，主要為PI3K-Akt 信號通路、TNF 信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路、TP53 信號通路等。研究表明，EF 的產(chǎn)生與自由基堆積、炎癥反應(yīng)及線粒體功能障礙等有關(guān)[32]。PI3K-Akt 信號通路是人體抗氧化過程的重要途徑，目前已有大量細(xì)胞體外實驗證實，抗氧化藥物可以通過激活PI3K-Akt 信號通路提高SOD、GSH-Px 等抗氧化酶的活性，從而降低自由基含量，有效防治細(xì)胞DNA氧化損傷、線粒體功能障礙等作用[33]。TNF 是腫瘤壞死因子，具有促炎癥、誘發(fā)凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。長時間耐力運(yùn)動促使血清及骨骼肌中TNF-α 活性升高，過多的炎性細(xì)胞因子將引起組織損傷，進(jìn)一步加速疲勞[32]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接初步驗證，旋覆花具有多成分、多靶點、多通路治療EF 的特點，可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)線粒體的等生物學(xué)過程共同發(fā)揮抗疲勞作用。這將為預(yù)防和治療EF 提供數(shù)據(jù)支撐及參考依據(jù)。然而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)局限于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)和軟件，這使得預(yù)測結(jié)果不能展示其全面的藥理作用，并且中藥成分在煎煮過程中發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)，這使藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制與預(yù)測結(jié)果存在差異。故想要進(jìn)一步研究旋覆花治療EF 的作用機(jī)制還需要對關(guān)鍵靶點及通路進(jìn)行實驗驗證。