謝駿 溫鑫 高鳳敏 楊驕霞 郭繼芳

急性心肌梗死是一種臨床常見的心肌組織細(xì)胞壞死性疾病，其主要誘因?yàn)楣跔顒?dòng)脈持續(xù)性供血、供氧不足，患者主要臨床表現(xiàn)為長時(shí)間的胸骨后劇烈疼痛[1，2]。我國每年新增急性心肌梗死病例數(shù)居高不下。溶栓、手術(shù)、介入等均為臨床常用的治療手段，有學(xué)者表示，部分急性心肌梗死患者治療過程中出現(xiàn)心肌組織損傷程度加劇的情況，即為再灌注損傷，有研究表明，再灌注損傷會(huì)使患者心肌損傷程度更加嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅患者生命安全[3，4]。目前臨床尚無特效的治療心肌缺血再灌注損傷的手段，因此越來越多的專家學(xué)者開始致力于心肌缺血再灌注損傷治療方法的研究[5]。CTRP9 是一種新型脂肪因子，主要表達(dá)于機(jī)體心肌組織，具有抗炎、促進(jìn)血管舒張等作用，但是關(guān)于其在心肌缺血再灌注損傷中的研究鮮有報(bào)道[6]。本研究建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，調(diào)控CTRP9 表達(dá)，旨在探究CTRP9 對(duì)心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料選取40 只SD 健康雄性大鼠[哈爾濱國生生物科技股份有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2021-002]，年齡10～14 周，平均（11.9±1.7）周；體重235～279g，平均（257.3±17.6）g。所有大鼠于（22.9±1.5）℃環(huán)境中喂養(yǎng)。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：ago CTRP9、antago CTRP9（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；大鼠抗小鼠TNF-α、IL-6 抗體（Gibco 公司）；小鼠抗兔LPO、CAT 抗體（Hyclone 公司）；兔抗大鼠Wnt3a、β-catenin 抗體（Invitrogen 公司）；大鼠抗小鼠AMPK 抗體（Selleck公司）；兔抗大鼠p38MAPK 抗體（BD 公司）；小鼠抗兔PPARγ 抗體（Sigma 公司）。

1.2 分組干預(yù)隨機(jī)選取10 只大鼠為正常組，不做處理。其余30 只大鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型：麻醉處理大鼠，使用心電圖對(duì)大鼠進(jìn)行心電監(jiān)測(cè)。于大鼠左胸第4 肋間隙開胸，使大鼠心臟顯露于術(shù)野，將大鼠左心耳下2mm 位置左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，同時(shí)觀察心電圖，ST 段抬高表示缺血建立成功，45min 后將結(jié)扎縫線去除，再灌注2h。建模過程中大鼠死亡3 只，建模成功27 只。將27只心肌缺血再灌注損傷大鼠隨機(jī)分為模型組、下調(diào)組、上調(diào)組各9 只，下調(diào)組大鼠腹腔注射antago CTRP9 30mg/kg，上調(diào)組大鼠腹腔注射ago CTRP9 30mg/kg，正常組、模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 指標(biāo)監(jiān)測(cè)

1.3.1 LVEDd、LVESd 水平檢測(cè) 對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉處理，剃除大鼠胸部體毛，以30°仰臥體位進(jìn)行固定，將超聲探頭置于左胸骨，與中線夾角20°，對(duì)大鼠LVEDd、LVESd 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 酶標(biāo)分析儀檢測(cè)氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)水平 取各組大鼠腹部靜脈血3ml，2 000r/min 離心15min后-50℃保存。標(biāo)記酶標(biāo)板，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行稀釋，設(shè)置三孔分別標(biāo)記為對(duì)照1、對(duì)照2、觀察孔，對(duì)照1 孔加入顯色劑及終止液，對(duì)照2 孔加入制備的標(biāo)準(zhǔn)品，觀察孔加入血清標(biāo)本及抗體，三孔封膜、振蕩后置于37℃保溫箱培養(yǎng)2.5h，添加顯色劑，顯色后添加終止液，計(jì)算LPO、CAT、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.3 HE 染色 各組大鼠全麻處理，采用頸部脫臼法處死，取大鼠心臟組織進(jìn)行清洗，固定后浸泡于4%甲醛1d，石蠟包埋、切片后脫蠟，使用不同濃度酒精復(fù)水，清洗3min 后蘇木素染色，之后進(jìn)行分化、氨水藍(lán)化，沖洗后伊紅染色、乙醇梯度脫水、脫蠟后封片，顯微鏡下觀察。

1.3.4 心肌梗死體積、心肌細(xì)胞凋亡率計(jì)算 取各組大鼠心肌組織切片，置于1% TTC 溶液中，在室內(nèi)避光環(huán)境中孵育0.5h，使用BI-2000 醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)梗死體積百分比進(jìn)行計(jì)算。TUNEL 法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38MAPK/PPAR通路蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 使用Western blot 法檢測(cè)。裂解待測(cè)標(biāo)本，提取50μg 蛋白，蛋白定量后行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉2h 后添加一抗（1:2000）4℃孵育1d，使用PBS 液清洗3 次后添加二抗（1:5000），孵育1h 后PBS 液清洗3 次，顯色、曝光、成像，檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算Wnt3a、β-catenin、AMPK、p38MAPK、PPARγ 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0 軟件分析，計(jì)量資料以±s描述，多組對(duì)比行F檢驗(yàn)，組間對(duì)比行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)觀察正常組大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、正常，排列整齊緊密，無細(xì)胞破損情況；模型組、下調(diào)組大鼠心肌組織細(xì)胞排列雜亂，出現(xiàn)較多膠原纖維，且出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞膜受損情況；上調(diào)組大鼠心肌組織細(xì)胞排列雜亂情況明顯改善，炎性細(xì)胞減少。見圖1。

2.2 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較模型組、下調(diào)組大鼠LVEDd、LVESd 水平高于正常組，且下調(diào)組大鼠LVEDd、LVESd 水平高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組大鼠LVEDd、LVESd 水平低于模型組、下調(diào)組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較（±s，mm）

表1 各組大鼠LVEDd、LVESd 水平比較（±s，mm）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調(diào)組比較，cP＜0.05

組別 n LVEDd LVESd正常組 10 6.65±0.67 4.21±0.35模型組 9 10.63±1.58a 7.15±0.82a下調(diào)組 9 13.47±2.12ab 8.62±1.29ab上調(diào)組 9 8.52±1.05abc 5.32±0.55abc

2.3 各組大鼠氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)水平比較模型組、下調(diào)組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常組，CAT 水平低于正常組，且下調(diào)組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于模型組，CAT 水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平高于正常組，低于模型組、下調(diào)組，CAT 水平低于正常組，高于模型組、下調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)水平比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)水平比較（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調(diào)組比較，cP＜0.05

組別 n LPO（mmol/L）IL-6（pg/ml）正常組 10 5.26±0.85 83.29±9.15 3.19±0.61 6.58±0.79模型組 9 15.33±2.34a 63.05±6.54a 12.28±2.27a 19.33±2.53a下調(diào)組 9 19.18±2.67ab 52.19±6.13ab 16.41±2.52ab 24.16±2.79ab上調(diào)組 9 8.12±1.52abc 75.13±8.52abc 5.63±1.52abc 11.21±1.78abc CAT（U/ml）TNF-α（ng/L）

2.4 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率比較模型組、下調(diào)組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率高于正常組，且下調(diào)組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組、下調(diào)組，高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表3 各組大鼠心肌梗死體積比例、心肌細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調(diào)組比較，cP＜0.05

組別 n 梗死體積比例 凋亡率正常組 10 0.00±0.00 3.98±0.64模型組 9 35.26±4.17a 19.52±2.33a下調(diào)組 9 41.32±4.53ab 25.16±2.68ab上調(diào)組 9 16.37±2.76abc 9.68±1.21abc

2.5 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)比較模型組、下調(diào)組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達(dá)高于正常組，下調(diào)組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達(dá)高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組大鼠Wnt3a、β-catenin 表達(dá)高于正常組，低于模型組、下調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)對(duì)比（±s）

表4 各組大鼠Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)對(duì)比（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調(diào)組比較，cP＜0.05

組別 n Wnt3a β-catenin正常組 10 0.98±0.11 1.02±0.15模型組 9 1.63±0.25a 1.65±0.23a下調(diào)組 9 1.86±0.32ab 1.89±0.29ab上調(diào)組 9 1.21±0.16abc 1.25±0.19abc

2.6 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達(dá)對(duì)比模型組、下調(diào)組大鼠AMPK、PPARγ 表達(dá)低于正常組，p38MAPK 表達(dá)高于正常組，且下調(diào)組大鼠AMPK、PPARγ 表達(dá)低于模型組，p38MAPK表達(dá)高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；上調(diào)組大鼠AMPK、PPARγ 表達(dá)低于正常組，高于模型組、下調(diào)組，p38MAPK 表達(dá)高于正常組，低于模型組、下調(diào)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5、圖3。

表5 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達(dá)對(duì)比（±s）

表5 各組大鼠AMPK/p38MAPK/PPAR 通路蛋白表達(dá)對(duì)比（±s）

注：與正常組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與下調(diào)組比較，cP＜0.05

組別 n AMPK p38MAPK PPARγ正常組 10 1.01±0.12 1.05±0.14 0.98±0.10模型組 9 0.62±0.07a 1.56±0.22a 0.53±0.06a下調(diào)組 9 0.49±0.06ab 1.82±0.25ab 0.41±0.05ab上調(diào)組 9 0.85±0.09abc 1.23±0.16abc 0.75±0.08abc

3 討論

作為常見的心血管疾病，急性心肌梗死具有發(fā)病急、預(yù)后差的特點(diǎn)[7]。中老年人群為急性心肌梗死高發(fā)群體，急性心肌梗死已經(jīng)成為威脅中老年人群生命安全的主要疾病。臨床常使用介入、溶栓等手段對(duì)急性心肌梗死患者進(jìn)行治療，但具有一定的再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)，再灌注損傷也是影響急性心肌梗死患者預(yù)后的主要因素[8，9]。有研究表明，心肌缺血再灌注損傷是一種較復(fù)雜的病理過程，病情嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致不可逆的心肌組織細(xì)胞凋亡[10，11]。CTRP9是一種新型脂肪因子，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、擴(kuò)張血管、抗炎等多種作用。CTRP9 表達(dá)變化與急性心肌梗死嚴(yán)重程度具有密切聯(lián)系，但是關(guān)于其在心肌缺血再灌注損傷病理發(fā)展過程中作用的研究還鮮有報(bào)道。

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展會(huì)導(dǎo)致心室重構(gòu)，對(duì)機(jī)體心功能造成嚴(yán)重威脅[12，13]。有學(xué)者在研究中表示，心肌缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度與機(jī)體左室功能具有密切聯(lián)系[14]。LVEDd、LVESd 常用于評(píng)價(jià)機(jī)體心功能。本研究顯示，與正常大鼠相比，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠LVEDd、LVESd 水平較高，說明隨著心肌缺血再灌注損傷的發(fā)展，大鼠出現(xiàn)心室重構(gòu)，心功能受到明顯損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CTRP9 表達(dá)的心肌缺血再灌注損傷大鼠LVEDd、LVESd 水平明顯下降，說明上調(diào)CTRP9 表達(dá)能夠改善大鼠心室重構(gòu)狀況，從而促進(jìn)大鼠心功能恢復(fù)，可能是因?yàn)镃TRP9 能夠緩解動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張血管，從而改善心肌梗死、再灌注損傷嚴(yán)重程度。

有研究表明，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)均為心肌缺血再灌注損傷發(fā)展的主要誘因，抑制機(jī)體心肌組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度，對(duì)機(jī)體心功能恢復(fù)、預(yù)后改善具有積極作用[15，16]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平較高，CAT 水平較低，上調(diào)CTRP9 表達(dá)的心肌缺血再灌注損傷大鼠LPO、TNF-α、IL-6 水平明顯下降，說明心肌缺血再灌注損傷癥狀的發(fā)展伴隨著一定程度的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，上調(diào)CTRP9 表達(dá)能夠減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度，從而抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織損傷，起到改善大鼠心功能的作用。

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展伴隨著心肌細(xì)胞凋亡，從而造成大鼠心功能嚴(yán)重?fù)p傷[17]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷模型大鼠凋亡率較高，上調(diào)CTRP9 表達(dá)的心肌缺血再灌注損傷大鼠梗死體積比例、凋亡率明顯下降，說明上調(diào)CTRP9 表達(dá)能夠改善大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重程度，抑制心肌組織細(xì)胞凋亡，可能是因?yàn)樯险{(diào)CTRP9 表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡通路蛋白表達(dá)。Wnt/β-catenin 為廣譜的細(xì)胞凋亡通路，主要配體Wnt3a、β-catenin 表達(dá)與細(xì)胞凋亡、增殖能力變化密切相關(guān)[18，19]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷大鼠Wnt3a、β-catenin 相對(duì)表達(dá)量較高，上調(diào)CTRP9 表達(dá)的心肌缺血再灌注損傷大鼠Wnt3a、β-catenin 相對(duì)表達(dá)量明顯下降，說明上調(diào)CTRP9 表達(dá)能夠調(diào)控Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)，抑制大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡，從而緩解大鼠心肌損傷嚴(yán)重程度。

有研究表明，AMPK 信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，激活A(yù)MPK信號(hào)通路能夠減輕心肌組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡，從而起到減輕再灌注損傷嚴(yán)重程度的作用[20，21]。本研究顯示，心肌缺血再灌注損傷大鼠AMPK、PPARγ 表達(dá)較低，p38MAPK 表達(dá)較高，上調(diào)CTRP9 表達(dá)的心肌缺血再灌注損傷大鼠AMPK、PPARγ 表達(dá)上調(diào)，p38MAPK 表達(dá)下調(diào)，說明上調(diào)CTRP9 表達(dá)激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，從而起到減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷、改善大鼠心功能的作用。

綜上所述，上調(diào)心肌缺血再灌注損傷大鼠CTRP9表達(dá)，能夠改善大鼠心室重構(gòu)，減輕大鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是調(diào)控Wnt/β-catenin 通路、AMPK/p38 MAPK/PPAR 通路蛋白表達(dá)，為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。