羅浩成，楊詩雯，李 軍，張勇民，董登祥

(1貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550001；2巴黎第六大學法國國家科研中心，巴黎 75005)

厚樸酚(magnolol)為烯丙基連苯二酚類物質，作為傳統(tǒng)中藥材中主要的有效活性成分，其具有多種藥理作用，如抗炎[1]、抗腫瘤[2-3]、促進胃動力[4]、抗菌[5-6]、抗氧化[7]、降血糖[8]、降脂[9]、抗抑郁[10]、抗銀屑病[11]、抗齲齒[12]等，擁有良好的開發(fā)前途和廣闊應用前景。然而受限于厚樸酚水溶解性不好，故難以形成合適的給藥劑型，生物利用度不高，生物活性并未得到充分的開發(fā)和利用，影響厚樸酚在臨床上的應用，造成當前厚樸酚并無成熟可靠的臨床應用劑型。因此，制備其衍生物以期提高水溶性，提高藥理活性，為后續(xù)厚樸酚臨床運用提供重要的基礎支撐。

此前已有許多學者對厚樸酚進行了結構修飾與改造，如郭明鑫[13]等人通過對厚樸酚與和厚樸酚的酚羥基進行修飾，引入酯基、酰肼、1，3，4-噁二唑等結構，為天然產物的減毒增效衍生化設計提供了新的思路。莊文豪[14]在厚樸酚中酚羥基、苯基的基礎上，合成一系列烯丙基被氧化的厚樸酚衍生物，結果表明厚樸酚衍生物抑菌活性均有所增加。但目前對于厚樸酚糖基化改造及修飾的研究較少。糖類化合物作為維持生命進程的重要物質之一，不僅僅是能量供給的來源，也同樣參與許多生物識別過程，例如蛋白質折疊、細胞間通訊、細菌粘附等。此外其還參與形成具有生物學意義的生物分子，如糖蛋白、肽聚糖[15]。由于天然糖類化合物異頭位置構型有α、β的區(qū)別，往往混雜在一起難以分離，所以純天然糖類化合物的實用性仍然不足以應對日益增長的治療需求。通過合成的方式，可獲得大量結構明確及純度高的糖化合物。且通過合成糖片段再與天然藥物連接的手段，可為藥物研究者提供一種改善天然化合物的水溶性、藥物活性及藥代動力學的新思路[16-17]。因此，化學合成是獲取復雜的寡糖和糖類衍生物的重要來源。近年來，許多學者通過利用網絡藥理學將小分子化合物與系統(tǒng)生物學、計算機科學結合起來，采用生物信息學方法“藥物-靶點-疾病”的靶標預測模型，能夠系統(tǒng)地闡述藥物與疾病的作用機制與作用靶點，為接下來的實驗提供數據支持與道路指引[18-19]。

因此，本課題通過對mag結構進行糖基化修飾，引入多羥基水溶性基團(如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖等)及用糖化學保護基團取代保護mag雙羥基，以期改善厚樸酚難溶于水以及易氧化的特性；提高生物利用度、水溶性和穩(wěn)定性；同時對3個糖苷衍生物進行生物信息學分析，為接下來的藥理學實驗提供道路指引。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BSM220.4電子天平(上海卓精電子科技有限公司)、INOVA-500MHz超導核磁共振波譜儀(安捷倫科技有限公司)、OBS-2200旋轉蒸發(fā)儀(倍捷科技(上海)有限公司)、FINNIGANLACQ-DECA質譜儀(美國菲尼根質譜公司)、721G-100紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)、TL-200B電阻超純水機(深圳億利有限公司)、WTF-203B三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

D-(+)-半乳糖(AR批號20160712國藥集團化學試劑有限公司)、D-(+)-麥芽糖(BR批號20170410天津大茂化學試劑廠)、D-(+)葡萄糖(AR批號20161219國藥集團化學試劑有限公司)、吡啶(AR批號20140511國藥集團化學試劑有限公司)、醋酸酐(AR批號20140923國藥集團化學試劑有限公司)、三氯乙腈(AR批號20160402國藥集團化學試劑有限公司)、三氟化硼乙醚(AR批號20171113國藥集團化學試劑有限公司)、乙硫醇(AR批號20160814國藥集團化學試劑有限公司)，2，3，4，6-四-O-乙?；?1-O-D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(α)，2，3，4，6-四-O-乙?；?1-O-D-吡喃半乳糖三氯乙酰亞胺酸酯(β)，2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙?；?D-吡喃葡萄糖三氯乙酰亞胺酸酯(γ)，實驗室自制。

1.2 目標化合物合成(圖1)

圖1 目標化合物的合成路線Fig.1 Synthetic routes of the target compounds

(1)化合物2的合成

稱量100 mg(0.38 mmol)mag和280 mg(0.57 mmol)化合物α，加入50 mL反應瓶內，加入100 mg活化過的4?MS和一個攪拌子，真空泵抽真空干燥0.5 h，通入惰性氣體N2保護反應體系。加入約15 mLDCM作為溶劑溶解底物，在0 ℃的冰水混合浴中平衡反應10 min，然后加入5 μL(0.026 mmol)催化劑TMSOTf。反應用TLC跟蹤點板，展開劑Cy∶EtOAc=3∶2。約1 h后，監(jiān)測到反應完成，Rf值為0.53。加入飽和碳酸氫鈉溶液中和體系中的三氟甲磺酸至pH中性，萃取過濾濃縮得粗產物，過硅膠柱純化粗產物，過柱用洗脫劑為Cy和EtOAc混合配置(體積比3∶1)。得到白色粉末狀固體物質89 mg，即化合物a，產率為39.28%。

稱量500 mg金屬Na，用Cy洗去表面煤油，快速加入裝有50 mLMeOH的燒杯中，制得MeONa溶液。稱量60 mg(0.10 mmol)化合物a，加入25 mL反應瓶內，放入攪拌子，加5 mL甲醇作溶劑溶解底物，然后緩慢倒入剛剛制備的MeONa溶液，直至反應體系pH值到達11～13之間。在r.t.條件下攪拌進行反應，TLC監(jiān)測跟蹤反應進程，展開劑Cy∶EtOAc=2∶3。約1 h后，監(jiān)測到反應物消耗完畢，反應完成，Rf值為0。反應體系中加入強酸型陽離子交換樹脂中和MeONa，使得體系pH中性，用MeOH作為溶劑，過濾除去樹脂，減壓旋蒸濃縮溶劑，粗產物用交聯右旋葡聚糖HL-20凝膠柱純化，得到淡黃色固體物質38.05 mg，即化合物2，產率88.86%，m.p.131～134 ℃。

波譜解析：ESI-MSm/z：451.2{[M+Na]+}；

1H NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.35 - 7.39(d，J =8.2Hz，3H，6-H，12-H，4- H)，7.29(s，1H，10-H)，7.20(s，1H，3-H)，7.12(s，1H，9-H)，7.06- 7.08(d，J =8.0Hz，2H，14-H，17-H)，5.41(s，1H，1′-H)，4.91(s，1H，OH)，4.25 - 4.27(d，J =13.9Hz，4H，15-H，18-H)，3.81(s，1H，2′-H)，3.67(s，1H，5′-H)，3.59(s，2H，6′-H)，3.46(s，1H，3′-H)，3.42(s，1H，4′-H)，3.04(s，4H，13-H，16-H)，2.51(s，1H，4H，OHGlu-H)

13C NMR(151 MHz，DMSO)δ：174.38(C2)，173.69(C8)，132.96(2C，C14，C17)，130.52(C11)，129.32(C12)，128.40(C7)，98.24(2C，C15，C18)，97.26(C9)，96.80(C3)，92.46(C1′)，75.56(C5′)，72.42(C2′)，71.23(C3′)，70.53(C4′)，61.58(C6′)，39.81(2C，C13，C16)

(2)化合物3的合成

稱量100 mg(0.38 mmol)mag和280 mg(0.57 mmol)化合物β，加入50 mL反應瓶內，加入100 mg活化過的4?MS和一個攪拌子，真空泵抽真空干燥0.5 h，通入惰性氣體N2保護反應體系。加入約15 mLDCM作為溶劑溶解底物，在0 ℃的冰水混合浴中平衡反應10 min，然后加入5 μL(0.026 mmol)催化劑TMSOTf。反應TLC跟蹤點板，展開劑Cy∶EtOAc=3∶2。約1 h后，監(jiān)測到反應完成，Rf值為0.53。加入飽和碳酸氫鈉溶液中和體系中的三氟甲磺酸至pH中性，萃取過濾.濃縮得粗產物，過硅膠柱純化粗產物，過柱用洗脫劑為Cy和EtOAc混合配置(體積比3∶1)。得到白色粉末狀固體物質96 mg，即化合物b，產率為42.37%。

稱量500 mg金屬Na，用Cy洗去表面煤油，快速加入裝有50 mL甲醇的燒杯中，制得NaOMe溶液。稱量60 mg(0.10 mmol)化合物b，加入25 mL反應瓶內，放入攪拌子，加5 mL甲醇作溶劑溶解底物，然后緩慢倒入剛剛制備的NaOMe溶液，直至反應體系pH值到達11～13之間。在r.t.條件下攪拌進行反應，TLC監(jiān)測跟蹤反應進程，展開劑Cy∶EtOAc=2∶3。約1 h后，監(jiān)測到反應物消耗完畢，反應完成，Rf值為0。反應體系中加入強酸型陽離子交換樹脂中和甲醇鈉，使得體系pH中性，用MeOH作為溶劑，過濾除去樹脂，減壓旋蒸濃縮溶劑，粗產物用交聯右旋葡聚糖HL-20凝膠柱純化，得到淡黃色固體物質36.69 mg，即化合物3，產率85.69%，m.p.133～139 ℃。

波譜解析：ESI-MSm/z：451.2{[M+Na]+}；

1H NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.39(s，2H，6-H，12-H)，7.38(s，1H，10-H)，7.35(s，1H，4-H)，7.34(s，1H，9-H)，7.21(s，1H，3-H)，7.08-7.11(d，J=29.2Hz，2H，14-H，17-H)，5.43(s，1H，1′-H)，4.79(s，1H，OH)，4.53(s，4H，15-H，18-H)，3.82(s，1H，5′-H)，3.73(s，1H，2′-H)，3.23(s，2H，CH2Gal-H)，2.97(s，1H，3′-H)，2.73(s，1H，4′-H)，2.57(s，2H，13-H)，2.50(s，2H，16-H)，2.10-2.15(m，4H，OHGal-H)

13C NMR(151 MHz，DMSO)δ：174.24(C2)，173.49(C8)，138.17(2C，C14，C17)，134.26(C11)，129.68(C12)，129.35(C10)，127.91(2C，C4，C6)，126.80(C7)，123.32(C1)，102.44(2C，C15，C18)，98.89(C9)，97.85(C3)，92.84(C1′)，75.18(C2′)，70.28(C3′)，69.90(C5′)，68.49(C4′)，61.03(C6′)，39.80(2C，C13，C16)

(3)化合物4的合成

稱量100 mg(0.38 mmol)mag和462 mg(0.57 mmol)化合物γ，加入50 mL反應瓶內，加入100 mg活化過的4?MS和一個攪拌子，真空泵抽真空干燥0.5 h，通入惰性氣體N2保護反應體系。加入約15 mLDCM作為溶劑溶解底物，在0 ℃的冰水混合浴中平衡反應10 min，然后加入5 μL(0.026 mmol)催化劑TMSOTf。反應TLC跟蹤點板，展開劑Cy∶EtOAc=3∶2。約1 h后，監(jiān)測到反應完成，Rf值為0.57。加入飽和碳酸氫鈉溶液中和反應體系中的三氟甲磺酸至pH中性，萃取過濾濃縮得粗產物，過硅膠柱純化粗產物，過柱用洗脫劑為Cy和EtOAc混合配置(體積比3∶1)。得到白色粉末狀固體物質127 mg，即化合物c，產率為37.79%。

稱量500 mg金屬Na，用Cy洗去表面煤油，快速加入裝有50 mL甲醇的燒杯中，制得NaOMe溶液。稱量120 mg(0.14 mmol)化合物c，加入50 mL反應瓶內，放入攪拌子，加10 mL甲醇作溶劑溶解底物，然后緩慢倒入剛剛制備的NaOMe溶液，直至反應體系pH值到達11～13之間。在r.t.條件下攪拌進行反應，TLC監(jiān)測跟蹤反應進程，展開劑Cy∶EtOAc=2∶3。約0.5 h后，監(jiān)測到反應物消耗完畢，反應完成，Rf值為0。反應體系中加入強酸型陽離子交換樹脂中和甲醇鈉，使得體系pH中性，用MeOH作為溶劑，過濾除去樹脂，減壓旋蒸濃縮溶劑，粗產物用交聯右旋葡聚糖HL-20凝膠柱純化，得到淡黃色固體物質73.38 mg，即化合物4，產率91.62%，m.p.103～107 ℃。

波譜解析：ESI-MSm/z：613.2 {[M+Na]+}；

1H NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.40(s，2H，6-H，12-H)，7.20(s，1H，4-H)，7.07(s，1H，10-H)，6.68-6.70(d，J18.1Hz，2H，3-H，9-H)，6.35(s，2H，14-H，17-H)，5.46(s，1H，1′-H)，5.31(s，1H，1″-H)，5.01(s，1H，OH)，4.92-4.95(dd，J=35.4，6.9Hz，4H，15-H，18-H)，4.53(s，1H，5′-H)，4.39(s，1H，2′-H)，3.68(s，1H，5″-H)，3.61(s，1H，2″-H)，3.48(s，1H，3′-H)，3.37(s，4H，6″-H，6′-H)，3.35(s，1H，3″-H)，3.32(s，1H，4″-H)，3.29(s，2H，13-H)，3.21-3.25(dd，J=17.7，10.6Hz，2H，16-H)，3.07(s，1H，4′-H)，2.51-2.58(d，J=1.7Hz，7H，7OHMal-H)

13C NMR(151 MHz，DMSO)δ：150.57(C2)，150.14(C8)，135.84(2C，C14，C17)，133.74(C11)，132.89(C5)，131.59(C12)，131.06(C10)，130.06(2C，C4，C6)，129.49(C7)，129.37(C1)，128.64(2C，C15，C18)，127.32(C9)，127.16(C3)，102.03(C1′)，101.60(C1″)，97.48(C2″)，92.70(C5′)，75.41(C2′)，74.69(C5″)，73.87(C3′)，73.31(C3″)，72.86(C4″)，72.00(C4′)，61.68(C6′)，60.68(C6″)，40.53(2C，C13，C16)

2 網絡藥理學預測厚樸酚衍生物抗中樞神經損傷的作用機制

2.1 厚樸酚衍生物作用靶點的預測

使用TargetNet平臺，通過導入化合物的結構，對厚樸酚糖苷化衍生物(化合物2，3，4)進行靶點預測，取prob>0.5，得到潛在靶點。

2.2 中樞神經損傷靶點的建立

通過Genecardds在線數據庫和OMIM數據庫，搜索關鍵詞“中樞神經損傷”，得到人類中樞神經損傷相關靶點基因，取Relevance>1，兩者結果合并并刪除重復數據。

2.3 疾病-藥物網絡構建

使用R軟件進行“疾病-藥物”靶點分析，進行交集操作，得到相同靶點，做出韋恩圖，將靶點輸入Uniprot數據庫，得到交集靶標的gene symbol，以用于后續(xù)分析。

2.4 核心靶基因的篩選與PPI網絡的構建

用String平臺處理交集靶點，選擇物種為“智人”，設置最小闕值為0.7，得到蛋白交叉作用，并構建靶標的PPI網絡。接著用R軟件篩選節(jié)點數最大(即交互關系最多)的幾種靶標，并構建柱形圖。

2.5 GO富集分析與KEGG信號通路富集分析

利用R軟件將交集gene symbol轉換為entrezID。使用DAVID數據庫對得到的entrezID進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析，用R軟件對其可視化處理。

3 結果與討論

3.1 化學合成

本實驗共合成厚樸酚糖苷衍生物3種，均未有文獻記載，均通過1H-NMR、13C-NMR和MS確定結構，在酚類的糖基化反應中，與其他糖基供體相比，三氯乙?；鶃啺匪猁}供體的合成更困難，但通常收率更高，尤其是使用更復雜的酚進行糖基化反應時，三氯乙酰基亞胺酸鹽供體明顯優(yōu)于其他供體。因此酚類糖基化反應優(yōu)先三氯乙酰亞胺酸鹽方法進行糖苷化反應。

使用三氯乙酰亞氨基進行的糖基化反應，可能發(fā)生亞氨酸酯的酸催化重排，如葡萄糖與mag反應時可能出現N-三氯乙?；拎咸烟前犯碑a物。在實驗過程中，我們嘗試了改變溶劑，反應溫度或促進劑等手段來避免這種副產物。最后發(fā)現，在使用三氯乙酰胺基吡喃葡萄糖供體的情況下，僅使用β-糖苷，不使用α-糖苷，可以明顯減少副產物的量，TLC檢識表明幾乎無副產物產生。

3.2 厚樸酚衍生物抗中樞神經損傷的作用機制

3.2.1 化合物2，3，4的結果

預測得到化合物2靶標74個，化合物3靶標21個，化合物4靶標25個，和“中樞神經損傷”靶點7137個，結果用R軟件交集，化合物2得到62個交叉靶點，化合物3得到13個交叉靶點，化合物4得到17個交叉靶點，用生物信息學方法進行交集，線條表示之間存在關系，白色圓形框表示藥物，黑色圓形框表示疾病，繪制韋恩圖如圖2。

圖2 化合物與中樞神經損傷作用的靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the targets of the compounds and CNS injury

3.2.2 PPI的構建

為了研究靶點之間在人體內的相互作用關系，將藥物(化合物2，3，4)和疾病的交集靶點輸入STRING平臺中，設置闕值大于0.7，然后對潛在靶點進行PPI網絡分析?；衔?共得到60個靶點之間存在相互關系，化合物3共得到12個靶點之間存在相互關系，化合物4共得到15個靶點之間存在相互關系。圖3清晰表明了基因靶點之間的相互關系。

圖3 化合物的PPI網絡圖Fig.3 PPI network diagrams of the compounds

用R軟件處理得到PPI網絡的核心基因，如圖4。

圖4 化合物的PPI網絡核心基因圖Fig.4 PPI network core gene map of the compounds

3.2.3 藥物-疾病靶點的GO富集分析

將交互靶點映射入DAVID數據庫中，進行GO生物過程富集分析，如圖5(以各通路p.adjust大小排序)。

圖5 化合物治療中樞神經損傷作用的主要GO富集分析網絡圖Fig.5 Major GO enrichment analysis network of the treatment of CNS injury by the compounds

結果表現出，化合物2的交互靶點主要生物學功能有：蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、葡萄糖跨膜轉運蛋白活性等?；衔?的交互靶點主要生物學功能有：碳酸鹽脫水酶活性、葡萄糖跨膜轉運蛋白活性、己糖跨膜轉運蛋白活性等?；衔?的交互靶點主要生物學功能有：嘌呤能受體活性、葡萄糖跨膜轉運蛋白質活性等。

3.2.4 藥物-疾病靶點的KEGG分析

將交互靶點映射入DAVID數據庫中，進行KEGG信號通路富集分析，如圖6(以各通路0p.adjust大小排序)。

圖6 化合物治療中樞神經損傷作用的主要 KEGG信號通路網絡Fig.6 Major KEGG signaling pathway network of the treatment of CNS injury by the compounds

結果表現出，化合物2的交互靶點主要信號通路有：孕激素介導的卵母細胞成熟通路、內分泌抵抗通路、松弛素信號通路等。化合物3的交叉靶點信號通路有：孕激素介導的卵母細胞成熟通路、氮代謝通路、四烯酸代謝通路。化合物4的交互靶點信號通路有：5-羥色胺能突觸通路、神經活性配體-受體相互作用通路等。

以化合物4中p.adjust值最小的KEGG信號通路Neuroactive ligand-receptor interaction為例，作化合物4對中樞神經損傷作用的通路圖，如圖7。

圖7 化合物4對中樞神經損傷作用的通路圖Fig.7 Pathway diagram of the effect of compound 4 on CNS injury

3.3 評價分析

3種化合物治療中樞神經損傷疾病的共同潛在靶點有6個，為花生四烯酸-15-脂加氧酶(ALOX15)、碳酸酐酶9(CA9)、熱休克蛋白90α(HSP90AA1)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1/COX-1)、鈉葡萄糖共轉運載體1(SLC2A1)和鈉葡萄糖共轉運載體2(SLC5A2)。

綜合上述的生物信息學GO生物過程分析數據，可以得到治療作用的主要生物過程4條，即腎上腺素能受體活性、碳酸鹽脫水酶活性、鈉轉運體活性和氧化還原酶活性。

根據之前3種糖苷化衍生物模擬出的KEGGPATHWAY數據，可以得出4條主要的信號通路，即氮素代謝、孕酮介導的卵母細胞形成代謝路徑、5-羥色胺能突觸和鞘脂信號通路。

4 結論

本研究合成了3種化合物，均為文獻未報道的糖苷衍生物，已通過1H-NMR、13C-NMR及MS確認結構，通過本方法改善了水溶性差等問題，豐富了厚樸酚衍生物的種類，繼而通過借助生物信息學的大數據方式，確定了mag糖苷化衍生物治療中樞神經損傷的主要潛在靶點6個，主要潛在生物過程4條，主要潛在信號通路4條。為下一步WB和ELISA等藥理學手段驗證提供了依據，進而驗證本研究所預測篩選出來的結果。以期對厚樸酚衍生物進一步進行藥效學研究利用。