龍昭航，陳 美，鄧雪薇，王 海，孫 姣

(貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽(yáng) 550000)

桐梓縣方竹筍被列為貴州省特色優(yōu)質(zhì)綠色農(nóng)產(chǎn)品[1]，是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，方竹筍形態(tài)方正，肉厚鮮美，具有鮮、香、嫩、脆的品質(zhì)，被譽(yù)為“筍中之王”。含有豐富的蛋白質(zhì)，富含多種氨基酸和多種礦物質(zhì)元素，具有較高的食用價(jià)值[2-3]。近幾年來(lái)，對(duì)方竹筍成分的挖掘及產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)技術(shù)的研究普遍受到關(guān)注[4-5]。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，在動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)中起到重要作用。人體所需要的必需氨基酸多數(shù)都由食物所供給，方竹筍中氨基酸含量豐富并且種類(lèi)齊全，目前檢測(cè)到的有17種氨基酸，其中人體必需氨基酸有7種，占氨基酸總量的39.9%[6]。對(duì)氨基酸檢測(cè)的方法有滴定法、分光光度法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀法等[7-8]。滴定法干擾因素較多，結(jié)果準(zhǔn)確度不高；高效液相色譜法、氨基酸分析儀法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但操作較繁瑣、耗時(shí)，費(fèi)用較高；分光度法較簡(jiǎn)便迅速，費(fèi)用較少，應(yīng)用較廣泛。目前對(duì)游離氨基酸的研究比較多，但缺乏對(duì)水解氨基酸總量的直接測(cè)定方法的研究[9-10]，本文以酸水解法獲取方竹筍中的氨基酸，采用茚三酮分光光度法測(cè)定方竹筍中氨基酸總量，建立一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷的方竹筍中氨基酸總量的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(C5H9NO4，CAS號(hào)56-86-0，純度≥99.0%)、17種氨基酸混標(biāo)(100 nmol/mL)；苯酚、氯化亞錫、鹽酸、茚三酮、無(wú)水磷酸氫二鈉(KH2PO4)、十二水磷酸二氫鈉(Na2HPO4·12H2O)、檸檬酸鈉，實(shí)驗(yàn)試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水。

實(shí)驗(yàn)用試樣方竹干筍來(lái)源貴州省桐梓縣、重慶金佛山區(qū)域。取不少于200 g方竹干筍剪成小塊，在80 ℃干燥箱中烘4 h，于干燥器中冷卻至室溫，立即用粉碎機(jī)粉碎。樣品要求全部通過(guò)孔徑為0.5 mm的篩，過(guò)篩后的樣品密封保存，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

723S型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，Agilent；XSE205DU型電子天平，梅特勒-托利多；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋；實(shí)驗(yàn)室用組織粉碎機(jī)；濃縮儀；水解管等實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.3 方法

1.3.1 試劑溶液制備

鹽酸溶液(6 mol/L)：取500 mL鹽酸加水稀釋至1000 mL，混勻；磷酸鹽緩沖液(pH8.0)：稱(chēng)取2.2705 g十二水磷酸二氫鈉、0.0454 g無(wú)水磷酸二氫鉀，加80 mL水溶解，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加水定容至100 mL，搖勻；茚三酮溶液(2%)：稱(chēng)取茚三酮2.0 g、氯化亞錫(SnCl·2H2O)80 mg，加適量水?dāng)嚢枞芙?，置于避光?4 h，過(guò)濾，加水至100 mL，避光保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 mg/mL)：稱(chēng)取0.5 g L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，加適量水溶解，加水定容至50 mL，搖勻備用； L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：移取0.0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。該系列標(biāo)準(zhǔn)工作液中的L-谷氨酸濃度分別為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL。

1.3.3 試樣溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g制備好的試樣(精確至0.0001 g)，置于潔凈干燥的氨基酸水解管底部。沿水解管內(nèi)壁加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，滴加苯酚3滴～4滴，封口，將已封口的水解管置于電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱內(nèi)，在110 ℃下水解24 h，取出，待水解液冷卻至室溫，過(guò)濾，水解管用少量水重復(fù)沖洗，濾液和水洗液并入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻。

1.3.4 試樣的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1.0 mL“1.3.3”試樣溶液移人到25 mL比色管內(nèi)，用濃縮儀在45 ℃減壓干燥至鹽酸揮發(fā)完全，加1 mL水溶解殘留物，加0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH8.0)和0.5 mL茚三酮溶液(2%)，置沸水浴中加熱15 min，冷卻，加水定容至25 mL，放置10 min，用5 mm比色皿，在最大吸收波長(zhǎng)568 nm處，測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確吸取1.00 mL濃度為0.4 mg/mL的L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色操作，以試劑空白溶液作參比，在可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)光區(qū)420～800 nm進(jìn)行掃描，確定反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 L-谷氨酸最大吸收波長(zhǎng)掃描Fig.1 Scanning under maximum absorption wavelength of L-glutamic acid

由圖1可知，茚三酮分光光度法測(cè)定氨基酸總量反應(yīng)體系在568 nm處有最大吸收，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)為568 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別準(zhǔn)確吸取1.00 mL L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液置于25 mL比色管中，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色操作，以試劑空白溶液作參比，在568 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以L(fǎng)-谷氨酸質(zhì)量濃度(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。結(jié)果如圖2所示。

圖2 L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of L-glutamic acid

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：y=1.4936x+0.0021，R2=0.9998；表明L-谷氨酸在0.1～0.60 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1.00 mL制備好的試樣溶液“1.3.3”，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色操作，于568 nm波長(zhǎng)處，每隔5 min測(cè)定其吸光度，見(jiàn)表1。測(cè)定試樣顯色溶液吸光度在1 h內(nèi)的變化情況，如圖3所示。

圖3 試樣顯色溶液吸光度在1h內(nèi)的變化情況Fig.3 Change of absorbance of sample color solution within 1 h

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Stability test results

由表1、圖3可知，試樣顯色溶液在1 h內(nèi)吸光度RSD為0.60%，表明該方法穩(wěn)定性較好，試樣顯色溶液在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定。吸光度在10 min達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，30 min后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此顯色后應(yīng)在30 min內(nèi)完成測(cè)定，該方法選擇放置10 min，進(jìn)行測(cè)定。

2.4 精密度試驗(yàn)

2.4.1 儀器精密度試驗(yàn)

取濃度為0.4 mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00 mL，按“1.3.4”的方法進(jìn)行顯色操作，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Instrument precision test results

2.4.2 方法精密度試驗(yàn)

取同一份制備好的試樣溶液1.00 mL，共6份，按“1.3.4”的方法進(jìn)行顯色操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Method precision test results

由表2、表3可知，儀器精密度試驗(yàn)RSD值為0.06%，方法精密度試驗(yàn)RSD值為0.30%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備好的方竹筍試樣0.1000 g，共6份，按“1.3.3”制備試樣溶液，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，并計(jì)算氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Repeatability test results

由表4可知，氨基酸總量平均值為29.42%，RSD為0.38%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備好的方竹筍試樣0.1000 g，按“1.3.3”制備試樣溶液，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色，進(jìn)行3個(gè)不同濃度點(diǎn)的三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，9次加標(biāo)回收試驗(yàn)的加標(biāo)回收率在96.86%～102.24%之間，平均回收率為98.73%。表明采用該方法測(cè)定方竹筍氨基酸總量的準(zhǔn)確度良好。

2.7 試樣中氨基酸總量的測(cè)定

2.7.1 茚三酮分光光度法

選取3個(gè)方竹筍樣品，精密稱(chēng)取6份，按“1.3.3”制備試樣溶液，按“1.3.4”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，并計(jì)算氨基酸總量，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，采用茚三酮分光光度法對(duì)3個(gè)方竹筍樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到3個(gè)方竹筍樣品中氨基酸總量分別為35.97%、33.34%、38.19%。

2.7.2 高效液相色譜法

稱(chēng)取“2.7.1”選取的方竹筍樣品，按“1.3.3”制備試樣溶液，采用高效液相色譜儀對(duì)試樣溶液進(jìn)行17種氨基酸含量的測(cè)定，并進(jìn)行加和計(jì)算氨基酸總量。

由圖4、表7可知，采用高效液相色譜法對(duì)3個(gè)方竹筍樣品進(jìn)行17種氨基酸的檢測(cè)，可以檢測(cè)到氨基酸種類(lèi)有16種，進(jìn)行加和計(jì)算得到3個(gè)方竹筍樣品中氨基酸總量分別為32.50%、31.26%、36.06%。

圖4 方竹筍氨基酸色譜圖Fig.4 Chromatogram of amino acids in square bamboo shoots

表7 高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果(單位：%)Tab.7 Determination results by HPLC

綜上，試驗(yàn)結(jié)果表明，茚三酮分光光度法比高效液相色譜加和計(jì)算法測(cè)得的氨基酸總量高出2.0%～3.5%。

3 結(jié)論

本文對(duì)茚三酮分光光度法測(cè)定方竹筍氨基酸總量進(jìn)行了方法學(xué)研究，并與高效液相色譜法結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本方法在濃度0.1～0.60 mg范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.9998，平均加標(biāo)回收率為98.73%，RSD=0.38%(n=6)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果與高效液相色譜法相比高出2.0%～3.5%。該方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用于方竹筍氨基酸總量的測(cè)定，為方竹筍品質(zhì)研究提供有效手段。