康文亭 周立偉 鐘梅玲 朱勇軍 李麗花 歐陽翔英

（1. 深圳蘭度生物材料有限公司，廣東省醫(yī)用高分子植入材料工程技術研究中心，深圳 518107；2. 香港大學深圳醫(yī)院口腔科，深圳 518053；3. 北京大學口腔醫(yī)院牙周科，北京 100081）

引導骨組織再生術（guided bone regeneration，GBR）是臨床上牙種植時骨量不足而進行骨增量的重要技術，其原理是將膜材料放置于骨缺損區(qū)與軟組織之間形成物理屏障，阻止遷移速度較快的成纖維細胞長入骨缺損區(qū)干擾骨形成，允許遷移速度較慢的成骨細胞優(yōu)先進入骨缺損區(qū)，為骨組織再生創(chuàng)造相對封閉的空間[1，2]。屏障膜是GBR技術成敗的關鍵因素之一，臨床上早期應用的聚四氟乙烯膜、鈦膜等不能降解，必須在后期行單獨的移除手術，且使用此類膜后手術切口易開裂，致使感染風險增加[1，3，4]。后興起的可吸收膠原膜由于能夠逐漸被人體吸收，所以無需二次手術取出，極大減輕了患者的痛苦。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，膠原膜具有良好的生物相容性、低免疫原、可操作性和牙齦成纖維細胞的趨化性等優(yōu)點[5，6，7]，在臨床受到越來越多的關注，并已被廣泛應用。

屏障膜在GBR 中發(fā)揮著不可替代的作用。理想的屏障膜不僅要具有防止成纖維細胞進入骨缺損部位的屏障作用，同時要能夠促進成骨細胞的黏附、增殖和骨組織的再生[8]。由豬膜組織經(jīng)脫細胞工藝制成的膠原膜，具有雙面結(jié)構，即一面致密光滑，一面疏松粗糙。光滑面起屏障作用，使用時朝向軟組織，可阻止軟組織進入骨缺損區(qū)；粗糙面使用時朝向骨缺損區(qū)，有利于成骨細胞黏附，穩(wěn)定血凝塊，促進骨組織生成。本研究旨在根據(jù)此種膠原膜的預期功能，觀察其光滑面對成纖維細胞的屏障作用，以及粗糙面對成骨細胞的黏附增殖作用，為其臨床應用提供基礎研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備

L929 小鼠成纖維細胞和MC3T3 小鼠成骨細胞由深圳市藥檢所提供。培養(yǎng)細胞所使用的MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，細胞染色處理時所用的鬼筆環(huán)肽-羅丹明和DAPI 試劑均購自Sigma 公司，甲醛為分析純級別，購自國藥集團。實驗主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 公司），倒置熒光共聚焦顯微鏡（德國 LEICA DMIL LED），掃描電鏡（日立TM3030 TESCAN MIRA3）。

1.2 材料制備

選取經(jīng)過防疫檢驗合格的健康豬膜組織，剔除粘連的脂肪后，先用胰酶和7% NaCl 溶液交替處理3 次，再用1% NaOH 溶液浸泡12 h，然后用PBS 多次浸泡清洗，最后用乙醇脫水，真空干燥。此工藝制備的膠原膜無化學交聯(lián)，成分主要為Ⅰ型膠原。

1.3 材料與細胞共培養(yǎng)

膠原膜一面是光滑面，另一面是粗糙面。無菌環(huán)境下，將膠原膜裁切成直徑為8 mm 的圓片，再經(jīng)紫外照射30 min，備用。

膠原膜與L929 成纖維細胞共培養(yǎng)：將膜圓片平鋪于48 孔板中，取100 μL 濃度為1×105個/mL 的細胞懸液分別滴加于膜片的光滑面或粗糙面表面，待完全濕潤后，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，之后再加入約0.5 mL 不含細胞的培養(yǎng)基，再繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況2 ～ 3 d 更換一次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d、7 d、14 d 后，用PBS 輕輕洗去沒有貼附在材料表面的細胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，備用。

膠原膜與MC3T3 成骨細胞共培養(yǎng)：將膜圓片平鋪于48 孔板中，取100 μL 濃度為2×105個/mL 的細胞懸液滴加于膜片的粗糙面表面，待完全濕潤后，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，之后再加入約0.5 mL 不含細胞的培養(yǎng)基，再繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況2 ～ 3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d 后，用PBS 輕輕洗去沒有貼附在材料表面的細胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，備用。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

將上述細胞共培養(yǎng)制備的膠原膜材料用PBS浸泡清洗兩次后，再依次用5 μg /mL 鬼筆環(huán)肽-羅丹明、2 ng/mL DAPI 進行染色處理，避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 掃描電鏡觀察

觀察膠原膜微觀形貌：取上述1.2 制備的膠原膜，裁切成合適尺寸，貼樣噴金120 s，SEM 觀察兩個表面及截面的微觀結(jié)構。

觀察膠原膜表面培養(yǎng)的細胞：將上述1.3 制備的細胞共培養(yǎng)材料用PBS 浸泡清洗兩次后，放置于-60℃冰箱中15 min，再冷凍干燥12 h，貼樣噴金120 s，SEM 觀察細胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 膠原膜的微觀結(jié)構

本研究制備的脫細胞膠原膜具有雙面結(jié)構，即一面較致密的光滑面，一面較疏松的粗糙面，其微觀形貌如圖1 所示。膜片兩面的纖維結(jié)構特征明顯：光滑面纖維結(jié)構排列整齊緊密，纖維之間空隙寬度小于10 μm；粗糙面纖維結(jié)構排列交錯疏松，空隙相對較大。

2.2 膜片光滑面對成纖維細胞的屏障作用

成纖維細胞在膠原膜的光滑面培養(yǎng)3 d、7 d、14 d 后的激光共聚焦熒光圖和掃描電鏡圖（圖2）顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞不斷增殖，胞體間伸出突起連接成片，有明顯的基質(zhì)分泌，3 d時細胞在膜表面能良好附著，細胞偽足清晰可見，7 d 時細胞增殖明顯，且多呈長梭形，胞質(zhì)充足，14 d 時細胞繼續(xù)增殖，細胞間排列緊密，細胞多呈圓形，熒光圖像和掃描電鏡圖像觀察到的細胞增殖趨勢一致，表明成纖維細胞能夠在膠原膜光滑面良好附著并增殖。

從膜片的縱切面觀察成纖維細胞向膜內(nèi)部的生長情況（圖3）。將細胞接種在膜光滑面后，從縱切面觀察到的掃描電鏡圖和激光共聚焦熒光圖（圖3a-f）顯示，成纖維細胞接種在膜片光滑面后，細胞僅沿著膜表面生長，沒有向膜內(nèi)部遷移。培養(yǎng)3 d 時，掃描電鏡圖和熒光圖幾乎都沒有觀察到細胞，培養(yǎng)7 d 時細胞數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)14 d時細胞已連接成片，增殖趨勢與從表面觀察到的增殖趨勢吻合。將細胞接種在粗糙面后，從縱切面觀察到的激光共聚焦熒光圖（圖3g-i）顯示，細胞并沒有聚集成一層，而是表現(xiàn)出向膜內(nèi)部遷移的趨勢。對比表明，膠原膜的光滑面對成纖維細胞起到明顯的屏障作用。

2.3 膜片粗糙面對成骨細胞的黏附作用

將MC3T3 成骨細胞接種于膠原膜的疏松粗糙面并于體外共培養(yǎng)14 d 后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果（圖4a）顯示：成骨細胞骨架充分鋪展，細胞質(zhì)充足，細胞生長狀態(tài)良好；掃描電鏡觀察結(jié)果（圖4b）顯示：成骨細胞黏附于膜粗糙面的膠原纖維上，細胞扁平呈星型，伸出片狀偽足，生長狀態(tài)良好，表明成骨細胞能夠良好黏附在膠原膜的粗糙面。

3 討論

脫細胞膠原膜是將動物組織中的細胞去除，而保留細胞外基質(zhì)的一種天然材料，主要成分為膠原。此類材料除無毒、無抗原性外，還具有良好的生物相容性。由于在制備過程中保留了膠原的三維結(jié)構，所以膠原膜還對成纖維細胞和成骨細胞等再生細胞具有趨化作用，利于細胞的遷移增殖以及機體的創(chuàng)傷修復[9]。此類屏障膜的代表為瑞士公司生產(chǎn)的Bio-Gide，此產(chǎn)品也是目前臨床在GBR 手術中應用最多的屏障膜。本研究中制備的膠原膜與Bio-Gide 非常相似，均是由豬膜組織經(jīng)脫細胞等工藝制成，無化學交聯(lián)，且同為雙面結(jié)構，一面致密光滑，一面疏松粗糙，使用時光滑面起屏障作用，朝向軟組織，可阻止軟組織進入骨缺損區(qū)，而粗糙面朝向骨缺損區(qū)，有利于成骨細胞黏附，穩(wěn)定血凝塊，促進骨組織生成。在對Bio-Gide 基礎研究中，馬超[10]等將成骨細胞分別接種在Bio-Gide 粗糙面和光滑面，對比觀察到光滑面可阻擋成骨細胞向膜內(nèi)部遷移，由此初步評價了Bio-Gide 的屏障作用。本研究以此為參照，并根據(jù)產(chǎn)品實際使用情況，選用成纖維細胞初步評價了所制備的脫細胞膠原膜的屏障效果，同時還選用了成骨細胞評估了其在膜粗糙面的黏附行 為。

拔牙窩在沒有外界干預時正常愈合的第3 天，成纖維細胞便會遷移到拔牙窩的血凝塊中形成肉芽組織，2 周時新生的肉芽組織便可充滿整個拔牙窩[11]。軟組織的入侵導致新骨無法生成，因此GBR 屏障膜需要在骨缺損修復早期能夠有效阻擋成纖維細胞進入骨缺損區(qū)，為新骨生成創(chuàng)造相對封閉的環(huán)境。在本研究中，將成纖維細胞接種在膜片的光滑面時，細胞僅沿著光滑面表面生長，未進入膜內(nèi)部，這是由于膜片光滑面纖維排列整齊且致密，纖維之間的空隙尺寸小于細胞尺寸，細胞被阻擋不能進入膜內(nèi)部；而將成纖維細胞接種在粗糙面后，由于纖維間空隙尺寸較大，細胞會沿著交錯疏松的纖維孔隙向膜內(nèi)遷移。此結(jié)果與馬超[10]等的研究結(jié)果一致。對比表明，膠原膜的光滑面對成纖維細胞能夠起到良好的屏障作用，同時，實驗結(jié)果也表明了成纖維細胞能夠在膠原膜光滑面良好附著并增殖。

GBR 的最終目的是促進骨細胞的生長，并最終形成骨質(zhì)，因此屏障膜能夠促進成骨細胞的黏附也很重要。成骨細胞屬于貼壁細胞，黏附后才可遷移、增殖和分化，而細胞形態(tài)可反映細胞黏附的狀況，扁平的細胞可通過胞漿突起和片狀偽足牢固地黏附[10]。本研究清晰地觀察到，成骨細胞在膠原膜的粗糙面表現(xiàn)出良好的生長狀況，細胞質(zhì)充足，細胞骨架充分鋪展，細胞扁平呈星型，伸出片狀偽足，緊密黏附于材料表面，表明成骨細胞能夠在膠原膜的粗糙面進行良好黏附。

4 結(jié)論

豬來源的脫細胞膠原膜具有良好的細胞相容性，膜片的光滑面能夠?qū)Τ衫w維細胞發(fā)揮有效的屏障作用，同時成骨細胞能夠在其粗糙面良好黏 附。