孫 洋，田淑芬，熱汗古麗·艾海提，王超霞，王 榮，劉 丹

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 3003842；2.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，天津 300192）

花色苷作為類黃酮途徑的次級代謝產(chǎn)物，其生物合成由結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控?；ㄉ蘸铣赏緩街械谋奖彼峤獍泵?Phenylala nineammonialyase，PAL)、類 黃 酮-3’-羥 基 化 酶（Flavonoid 3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H）、類黃酮-3’-5’-羥基化酶（Flavonoid 3’-5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H）、無色花色素還原酶（Leucoanthocyanidin Reductase，LAR）、無色花色素雙加氧酶（Leucoanthocyanidin Dioxygenase，LDOX）、類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose Flavonoid Glucosyltransferase，UFGT）等都直接催化花色苷的合成。除此之外，轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因啟動子上的特定元件結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而間接調(diào)控花色苷的合成。

葡萄果實中花色苷的合成，與品種特性有關(guān)，由品種基因型決定，也易受外界光照、土壤、溫度等栽培環(huán)境的影響。天津位于環(huán)渤海產(chǎn)區(qū)的中心，土壤鹽漬化問題嚴(yán)重,研究表明，適度的鹽脅迫處理可以改善葡萄果實品質(zhì)。50 mmol·L的NaCl 濃度提高了果實發(fā)育后期的固酸比和可溶性固形物含量。根系的局部鹽處理提高了果實風(fēng)味及果實中的香氣物質(zhì)的種類和濃度。鹽溶液噴施葉面可以提高‘ 巨峰’葡萄的成熟果實的花色苷及可溶性固形物。對釀酒葡萄‘ 赤霞珠’果粒噴施過高濃度鹽溶液會延緩花色苷的積累。

近幾年來，套袋技術(shù)在葡萄生產(chǎn)栽培中廣泛應(yīng)用。套袋處理能有效地降低果實表面的農(nóng)藥殘留，調(diào)節(jié)果實色澤的形成，不同程度地影響了光照條件、果實著色面積、果面光潔度及果品安全性。套袋可提高葡萄果實的可溶性糖、可滴定酸、VC 等內(nèi)含物質(zhì)的含量。高獻(xiàn)亭等試驗證明，套袋果實第二發(fā)育期時間較長，依據(jù)果實發(fā)育規(guī)律，從肥水、負(fù)載量、病蟲防治幾個方面加強(qiáng)管理，可促進(jìn)果粒增大。倪志婧等研究證明，葡萄果實中花色苷的質(zhì)量比隨著遮光率增加而降低；馬宗桓等研究發(fā)現(xiàn)，與透光率50%，15%，5%，0%對比下，不套袋的對照組花色苷含量最高，隨著‘ 馬瑟蘭’的成熟，差異逐漸顯著。紫外線照射可以促進(jìn)合成花色苷相關(guān)基因UFGT 的表達(dá)，從而使花色苷含量增加。Ubi 等發(fā)現(xiàn)，紫外線可以促進(jìn)基因的表達(dá)，而UFGT 是花色苷合成的主要基因之一；Zhang研究發(fā)現(xiàn)，UV-C 照射葡萄果實可以誘導(dǎo)莽草酸代謝途徑中 VvDAHPS -1 和VvDAHPS-2 基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致花色苷的含量增加。

‘ 摩爾多瓦’葡萄耐寒耐旱，適于在四季分明、干旱多風(fēng)、土壤鹽漬化的天津地區(qū)進(jìn)行種植和栽培。本研究通過澆灌鹽溶液、套袋等措施改變土壤鹽分和光照等栽培環(huán)境，研究鹽溶液、套袋處理對花色苷合成的分子調(diào)控機(jī)制的影響，為培育高含量花色苷葡萄新品種及提高葡萄附加值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究于2020 年7 月5 日—9 月25 日在天津市武清區(qū)金鍋農(nóng)業(yè)生態(tài)園進(jìn)行（E117.13°,N39.38°），該園區(qū)為葡萄種植基地核心示范區(qū)，農(nóng)戶已連續(xù)種植葡萄10 余年，管理經(jīng)驗豐富。所用的‘ 摩爾多瓦’葡萄（Moldova）為多年生自根苗，采用戶外棚架栽培，定植株距1.5 m，棚架高4 m。每株葡萄結(jié)果主蔓1 個，每個結(jié)果枝保留1 個果穗，整株葡萄果穗保持40 穗。

自7 月5 日果實轉(zhuǎn)色前1 周開始處理，試驗設(shè)置3 個處理組，具體處理方法見表1。每個處理10株樹，每3 株作為1 個重復(fù)，共3 個重復(fù)。每10 d 處理1 次，共處理5 次。在第3 次處理后，于轉(zhuǎn)色后期（8 月5 日）、第2 次膨大期（8 月25 日）及成熟期（9月25 日）采樣，共采樣3 次。采樣時隨機(jī)挑選同一結(jié)果部位、無病蟲害及機(jī)械損傷的果穗，從果穗上、中、下采集果實混合。其中用于花色苷及其相關(guān)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平檢測的樣品葡萄剝皮后，將果皮用錫箔紙包裹好放入液氮速凍，并帶回實驗室保存在-80 ℃冰箱備用。

表1 處理方法

1.2 檢測指標(biāo)及測定方法

1.2.1 可溶性固形物的測定 按照不同處理不同采樣時間隨機(jī)取出30 個完整果粒用于可溶性固形物的檢測。用數(shù)顯折光儀（陸恒生物）測定可溶性固形物的含量。

1.2.2 總酚含量的測定‘摩爾多瓦’葡萄果皮中總酚含量的測定采用可見光分光光度計（Mapada，p6）來測定：將存儲在-80 ℃冰箱里的葡萄果皮用總酚提取試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）進(jìn)行測定。每個處理重復(fù)3 次。

1.2.3 總花色苷的測定 葡萄果皮中的總花色苷含量的測定采用pH 示差法來測定：將存儲在-80 ℃冰箱里的葡萄果皮用花色苷提取試劑盒（購于北京盒子生工科技有限公司）進(jìn)行測定。每個處理重復(fù)3 次。1.2.4 總RNA 的提取及定量方法 選取葡萄花色苷合成代謝途徑中6 個相關(guān)酶基因：PAL、F3’H、F3’5’H、LAR、LDOX、UFGT。根據(jù)NCBI 查找的參考基因序列，采用Primer5 軟件設(shè)計試驗中的基因引物序列（表2）。

用RNAprep Pure Plant Plus Kit 試劑盒（DP441，天根）提取葡萄果皮總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）的操作指導(dǎo)，在Illumina-Eco 熒光定量PCR 儀（美國ABI）上測定基因的表達(dá)量。

以延伸因子EF-1α 為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，采用Primer5 軟件設(shè)計相關(guān)引物(表2)。10 μL反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物 混 合 物（10 mM）0.3 μL、cDNA 模 板0.4 μL 和RNase-free 水4.3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃15 min；然后，95 ℃10 s，56 ℃20 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)；最后，進(jìn)行溶解曲線測定。熒光定量結(jié)果通過相對定量法（2）進(jìn)行分析，結(jié)果以3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 軟件繪圖。

表2 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)整理

數(shù)據(jù)方差和差異顯著性（P＜0.05）分析利用Excel 和SPSS 軟件。繪圖采用Excel 和Origin 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對‘摩爾多瓦’葡萄果實品質(zhì)的影響

2.1.1 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄可溶性固形物的影響 葡萄從轉(zhuǎn)色期到成熟期間，B 處理和C處理對摩爾多瓦葡萄可溶性固形物含量變化情況如圖1 所示。由圖1 可見，與采樣初期相比，隨著‘ 摩爾多瓦’葡萄的成熟，A、B、C 3 個處理組果實的可溶性固形物含量呈上升趨勢，9 月25 日最后1 次采樣的果實可溶性固形物含量顯著高于8 月5 日采樣初期。尤其是從8 月25 日開始，各組可溶性固形物含量迅速上升，成熟期B 處理和C 處理的可溶性固形物含量均顯著高于A 處理（對照），B 處理可溶性固形物含量最高。結(jié)果表明，B 處理和C 處理有利于‘ 摩爾多瓦’葡萄可溶性固形物的積累。

圖1 鹽和套袋處理在不同時期對‘摩爾多瓦’葡萄可溶性固形物的影響

2.1.2 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄可滴定酸的影響 隨著‘ 摩爾多瓦’葡萄果實的成熟，不同處理果實可滴定酸含量變化情況如圖2 所示。從轉(zhuǎn)色期到成熟期，A、B、C 處理的果實可滴定酸含量整體呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。結(jié)合葡萄物候期分析，8 月25日之后，葡萄進(jìn)入成熟期，開始增糖降酸，B 處理組果實可滴定酸含量下降速度高于A 處理組，到果實成熟后期，B 處理組可滴定酸含量顯著低于A、C 處理組。結(jié)果表明，套袋處理及鹽處理有利于可滴定酸含量的降低。

圖2 鹽和套袋處理在不同時間對‘摩爾多瓦’葡萄可滴定酸的影響

2.1.3 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄總酚含量的影響 圖3 可知，隨著果實成熟處理C 總酚含量升高，處理A、B 總酚含量顯著降低，處理B 下降速度最快，且成熟期總酚含量最低，顯著低于對照。這說明套袋處理及鹽處理有利于葡萄果實中總酚含量的降低，推測與花色苷含量下降有關(guān)。

圖3 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄果皮中總酚的影響

2.2 不同處理對‘摩爾多瓦’葡萄果皮中花色苷合成的影響

2.2.1 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄花色苷含量的影響 由圖4 可以看出，隨著‘ 摩爾多瓦’葡萄的成熟，各組果皮花色苷的含量逐漸升高，成熟期不同處理果實中總花色苷含量差異不顯著。結(jié)果表明，B和C 處理不利于花色苷含量積累。由此可見，光照對花色苷積累的重要性。

圖4 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄果皮中總花色苷的影響

2.2.2 ‘摩爾多瓦’葡萄中花色苷合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量 PAL、F3’H、DFR、F3’5’H、LDOX 和UFGT這6 種結(jié)構(gòu)酶基因是花色苷生物合成過程中的關(guān)鍵基因。圖5 是本試驗B 和C 處理對‘ 摩爾多瓦’葡萄果皮中花色苷相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響研究結(jié)果。

從圖5 可以看出，與第1 次采樣相比，隨著果實的成熟，C 處理組F3’H、DFR 和F3’5’H 基因的相對表達(dá)量上調(diào)，UFGT 基因的相對表達(dá)量下調(diào)，PAL和LDOX 的相對表達(dá)量沒有明顯的變化。B 處理組的PAL、DFR、F3’5’H 和UFGT 基因的相對表達(dá)量均明顯下調(diào)，F(xiàn)3’H 和LDOX 基因的相對表達(dá)量沒有明顯的變化。A 處理組的LDOX 和UFGT 基因的相對表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，PAL、F3’H、DFR 和F3’5’H基因的相對表達(dá)量均下調(diào)。結(jié)果表明，B 處理和C 處理抑制花色苷合成相關(guān)基因LDOX 和UFGT 的表達(dá)，不利于無色花青素向有色花色素的轉(zhuǎn)變以及有色花色素與各種單糖結(jié)合形成花色苷。

圖5 鹽和套袋處理對‘摩爾多瓦’葡萄果皮中花色苷相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響

3 結(jié)論與討論

植物在生長發(fā)育的過程中經(jīng)常會受到一些非生物的脅迫，如：溫度、鹽、紫外線、干旱等，鹽就是其中的一類。鹽不僅影響著植物的生產(chǎn)過程，同時大大影響著產(chǎn)品的豐產(chǎn)與穩(wěn)定。用鹽處理葡萄會影響它的滲透性，使得葡萄體內(nèi)失水，減弱光合作用和呼吸作用的能力，抑制葡萄的正常生長發(fā)育與成熟。研究表明，只有低鹽處理可以使得果樹果實品質(zhì)下降，說明鹽處理對果實品質(zhì)的影響具有濃度效應(yīng)。本研究鹽處理組‘ 摩爾多瓦’葡萄可溶性固形物和總花色苷含量的增長速度緩慢，可滴定酸含量下降不明顯，總酚含量明顯低于對照組，從而證實了3‰鹽處理通過影響葡萄的可滴定酸、可溶性固形物、總酚、花色苷的含量來影響葡萄果實的品質(zhì)，不利于果實品質(zhì)的提高。

鹽當(dāng)中的金屬離子對花色苷有一定的輔色效果。Na的大量積累可以提高果實的著色。Galli 等研究發(fā)現(xiàn)，在草莓果實中，Na含量增加3 倍使得UFGT 等著色相關(guān)基因的大幅度上調(diào)，而當(dāng)Na增加6 倍時對葡萄果實的品質(zhì)和著色相關(guān)基因沒有顯著影響或顯著下調(diào)了UFGT 的表達(dá)，暗示了不同鹽水平對葡萄品質(zhì)形成和基因調(diào)控具有不同的效應(yīng)。孫紅等研究表明，低鹽處理對提高花色苷有顯著影響，而高鹽處理則不利于著色。本研究鹽處理的‘ 摩爾多瓦’ 葡萄從轉(zhuǎn)色期到成熟期花色苷的含量雖然也在不斷上升，但一直低于對照組，且合成速度較慢。這說明3‰鹽濃度還是較低，對花色苷合成的影響不顯著。

光照是決定果實品質(zhì)的主要因素之一，它通過光合作用，影響庫源關(guān)系來實現(xiàn)對葡萄代謝的影響。前人研究紫外線對果實品質(zhì)影響的結(jié)果表明，在葡萄果實的生長發(fā)育過程中，紫外線照射并沒有影響果實的外在品質(zhì)、可溶性總糖和有機(jī)酸，但顯著影響了果實的內(nèi)在品質(zhì)，且在成熟期降低了VC 含量。張珍珍等試驗證明100%轉(zhuǎn)色至完全成熟期間采用50%遮光的遮陽網(wǎng)處理，顯著提高了樣品中甲基化花色苷含量（甲基化花色苷的穩(wěn)定性較強(qiáng)）。本試驗中隨著葡萄的成熟，套袋處理的可溶性糖的含量上升較快，而花色苷含量低于對照組，可滴定酸含量和總酚的含量下降趨勢都比對照組慢。套袋減少了葡萄果實接受光照的強(qiáng)度，減少空氣流通等帶來的水分蒸發(fā)，改變了果穗周圍的溫濕度等微氣候環(huán)境，但不利于花色苷的積累。

花色苷不僅是類黃酮代謝途徑的重要產(chǎn)物，也是葡萄中重要的一類酚類物質(zhì)。它的積累過程中會受到逆境脅迫的影響，光照是其中的影響因素之一。前任研究發(fā)現(xiàn)，紫外線和紅外線對植物生長影響較大。紫外線可根據(jù)波長分為UV-A（315～390 nm）、UV-B（280～315 nm）、UV-C（小于280 nm）。UV 福射對類黃酮合成的調(diào)節(jié)主要是在其基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。Ubi等研究發(fā)現(xiàn)，紫外線能促進(jìn)CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT 基因的表達(dá)，進(jìn)而增加花色苷的積累。Matus 等研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄轉(zhuǎn)色期增加果穗的受光面積能夠影響花色苷的合成。由此可見，光主要誘導(dǎo)原花色素的合成并影響其組成，而紫外線主要誘導(dǎo)黃酮醇的生物合成。本研究結(jié)果表明，套袋處理不利于‘ 摩爾多瓦’葡萄花色苷含量的積累，間接表明紫外線等光照條件對花色苷合成的重要性。

影響花色苷合成的因素除光照和鹽脅迫外還有溫度和水分脅迫。Pastore 等研究表明，低溫處理會在一定程度上促進(jìn)PAL 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花色苷的含量，經(jīng)驗證，低溫條件下的葡萄總花色苷含量是高溫處理的2 倍。Yang 等通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析，表明水分脅迫可以促進(jìn)CHS、F3H、3GT 等一般生物合成基因的表達(dá)，進(jìn)而使花色苷和合成花色苷的物質(zhì)含量升高。

此外，現(xiàn)階段關(guān)于花色苷的研究很多，有著廣泛的應(yīng)用前景?；ㄉ盏姆N類多，穩(wěn)定性差，影響其合成的因子及其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，花色苷合成決定的酶學(xué)與分子機(jī)制還不夠完善?；ㄉ盏纳砘钚怨δ軓V受人們關(guān)注，由于國內(nèi)合成工藝的限制，花色苷的純度較低，無法滿足人們的需求。因此，研究葡萄中花色苷合成調(diào)控機(jī)制，可為培育高含量花色苷新品種提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過對‘ 摩爾多瓦’葡萄果實果皮中花色苷合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平、可滴定酸、可溶性固形物、總花色苷含量以及總酚含量等一系列生理指標(biāo)的檢測結(jié)果表明，套袋處理有利于葡萄果實可溶性固形物含量的增加，不利于果皮花色苷的合成和積累。鹽處理不利于葡萄果實可溶性固形物含量的增加，以及果皮花色苷的合成和積累。