周春紅，盧子濱

南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中藥藥理實驗室，廣州 510515

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類廣泛表達于真核生物中，且高度保守的小分子RNA[1]。circRNA可通過不同方式參與調控親本基因的表達，或充當miRNA和RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)“海綿”調節(jié)下游靶基因蛋白的表達等，在各種生物學過程中都發(fā)揮著重要的調控作用[2- 4]。

模式生物斑馬魚作為一種小型水生動物，與人類之間大約有70%的基因是直系同源的[5]。斑馬魚特有的透明胚胎可用于實時監(jiān)測胚胎發(fā)育的過程，展開各種病理生理現象的研究。斑馬魚還具有繁殖周期短、養(yǎng)殖費用相對較低、可用于高通量藥物篩選的獨特優(yōu)勢，在醫(yī)藥研究領域應用日益廣泛[6]。因此人們試圖從斑馬魚的組織中鑒定并表征circRNA[7]，發(fā)掘斑馬魚體內與人類基因同源的circRNA，以利用斑馬魚自身優(yōu)勢，開展與circRNA相關的更高效、深入的疾病研究。

circRNA的分類和特征

circRNA的分類circRNA為閉合環(huán)狀結構，可由前體RNA(pre-mRNA)通過反向剪接形成[8]。根據circRNA形成過程中pre-mRNA的剪接方式，可將circRNA分為3類：(1)內含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)；(2)外顯子circRNA(exonic circRNA，EciRNA)；(3)內含子、外顯子共同組成的circRNA(exonic-intronic circRNA，EIciRNA)[9-10]。circRNA形成的機制十分復雜，目前研究較多的假說有：套索驅動的循環(huán)化假說、RBP驅動的環(huán)化假說和配對環(huán)狀內含子RNA驅動的環(huán)化假說等[11-13]。

circRNA的特征(1)與線性RNA不同，circRNA為閉合的環(huán)狀結構。不具備5’- 3’極性及聚腺苷酸化尾巴，故而不易被RNA核酸外切酶或核糖核酸酶R(RNase R)降解，比線性RNA更為穩(wěn)定[14]。(2)circRNA主要存在于細胞質中，且以EciRNA為主，還可能具有miRNA反應元件(miRNA response element，MRE)[15]。(3)circRNA在真核細胞中廣泛表達，且種類眾多。(4)EIciRNA主要位于細胞核內，參與基因的表達，其內含子一般位于兩個外顯子之間[16]。(5)circRNA的分布具有組織特異性[17]。

circRNA的生物學作用隨著生物技術的快速發(fā)展，人們在多種生物體內均檢測到大量circRNA的存在，并發(fā)現其廣泛參與了多種生理病理過程，具有重要的生物學作用[18]?，F已明確的circRNA的生物學功能有：(1)參與調控親本基因的表達過程。如EIciRNA通常位于細胞核內，通過順式作用方式與U1小核糖核蛋白相互作用，進而增強其親本基因的轉錄活性[19]。此外，circRNA也可與磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA PolⅡ)相互作用來調控基因的表達[20]。不僅如此，主要定位于細胞核內的ciRNA，也能參與基因轉錄的調控[21]。(2)與miRNA或RBPs相互作用，發(fā)揮“海綿”作用。circRNA具有MRE，能與miRNA競爭性地與其下游靶基因mRNA上的3’非翻譯區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)結合，從而參與調節(jié)miRNA對下游靶基因轉錄后的負調控過程，抑制靶標基因mRNA的降解。故circRNA又稱為競爭性內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)[22]。circRNA還可與RBPs結合，發(fā)揮RBPs海綿作用，從而參與生命活動的各個過程[23- 24]。后者與維持RNA結構的穩(wěn)定性、RNA的轉運及翻譯和選擇性剪接等多種生物學過程密切相關，在轉錄后基因表達調控中發(fā)揮重要作用[25](圖1)。

斑馬魚中的circRNA

斑馬魚中circRNA的鑒定與表征Shen等[26]對斑馬魚中的3868個circRNA進行了鑒定和表征，發(fā)現大多數斑馬魚circRNA有一個或兩個作用于同一靶標miRNA的位點，多個circRNA共同作用于同一miRNA，例如circRNA000207、circRNA000348、circRNA000423等29個circRNA均可充當dre-miR- 2193海綿，進而通過相互作用形成復雜的調控網絡圖。此外，斑馬魚29%的circRNA與人類、小鼠和豚鼠都具有同源性，包括一些高度保守的circRNA，如：circRNA000348、circRNA000207和circRNA000423等。另有研究也表明這些circRNA在人類和小鼠中是保守的，它們可能在脊椎動物中也發(fā)揮著相似的功能[27]。與哺乳動物中circRNA的生物發(fā)生機制不同，斑馬魚中只有2.64%外顯子circRNA符合內含子對驅動環(huán)化模型的條件，表明斑馬魚的circRNA可能通過不同的機制環(huán)化形成。在此基礎之上，劉麗麗[28]又進一步對斑馬魚胚胎中的32 949個circRNA的表達特征進行分析，在一定程度上豐富了斑馬魚circRNA數據庫。研究發(fā)現斑馬魚circRNA主要分布于8號、9號、15和19號染色體，且其中69%來源于外顯子，6%來源于內含子，其余的則是來源于基因間序列。同時斑馬魚circRNA多數長度在3200 nt以內，且長度越長則數量越少。通過對成年斑馬魚中的3428個circRNA進行鑒定分析發(fā)現，circRNA分布在斑馬魚所有染色體上，且主要位于3號染色體。對斑馬魚染色體進行歸一化處理后，發(fā)現22號染色體上的circRNA密度最大。斑馬魚中大多數circRNA均來自蛋白質編碼基因位點，僅有3.06%來自長期的非編碼RNA基因位點。在成年斑馬魚體內，circRNA分布具有組織特異性，僅有1.31%在血液、心臟、肌肉、腦和鰓中共表達。如circ ttnb1，來源于與編碼肌肉蛋白相關的ttnb1基因，除在肌肉中高表達外，而在血液、腦和心臟中表達量較低[29]。Liu等[30]發(fā)現多數前體線性RNA只能產生單個circRNA，少數可以產生多達4或5種亞型，如circRNAece2b、circRNAcamk2b1和circRNAnbas等。該結果與先前報道的研究結果相吻合，即單個基因可以通過剪接產生多種執(zhí)行不同功能的circRNA[31- 32]。此外，Liu等[33]進一步在成年雄性斑馬魚線粒體鑒定得到139個線粒體基因組編碼的circRNA，并將由線粒體基因編碼的circRN稱之為“mecciRNAs”。進一步研究表明mecciRNA和核基因編碼的circRNA有著相似的 AG/GT 連接基序，這對于斑馬魚circRNA的研究具有重要的意義。

圖1 circRNA的分類及生物學功能

發(fā)育過程中的circRNA斑馬魚中的circRNA能通過影響各種生物學過程，進而參與到斑馬魚發(fā)育有關的不同途徑中。Liu等[30]以junction reads≥5、倍數變化≥2、目標circRNA分子在任意兩個樣品中共表達、P<0.05為篩選標準，對斑馬魚卵受精后4.5 h(4.5 hours post fertilization，4.5 hpf)、8 hpf、24 hpf、48 hpf和72 hpf 5個不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎中差異化表達的circRNA進行測序分析，得到1029個差異化表達的circRNA。研究發(fā)現，8 hpf是斑馬魚早期胚胎形成和器官分化最活躍的時期，也是circRNA的最豐富時期。通過GO數據庫對斑馬魚發(fā)育不同時期差異化表達的circRNA生物學功能進行預測分析，發(fā)現大量的功能富集與RNA聚合酶Ⅱ相關，它們可能是通過參與生物轉錄和翻譯過程來調節(jié)斑馬魚的生長發(fā)育。在斑馬魚發(fā)育4.5～8 hpf過程中，circRNA 4、circRNA19、circRNA20、CX43等表達量上調，而circRNA 14、circRNA 15、circRNA 17、MEF2C等表達量下調。功能富集分析發(fā)現差異化表達的circRNA主要與細胞形態(tài)發(fā)生、遷移和分化，碳水化合物衍生物代謝過程以及早期器官發(fā)育相關途徑。而斑馬魚發(fā)育4.5～24 hpf過程中，circRNA7、circRNA19、circRNA20、GATA4、MEF2C等表達量上調，而circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA6、circRNA14等表達量下調，功能富集主要與碳水化合物的生物合成過程、DNA的代謝過程、血管和神經節(jié)細胞軸突的發(fā)育以及RNA聚合酶Ⅱ參與的轉錄調控有關。在48 hpf和72 hpf，circRNA7、circRNA8、circRNA9、circRNA20、VMHC、CX43等表達上調，circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA13、circRNA15等表達下調，功能富集主要與器官的發(fā)育調控有關。其中circRNA 20是來源于plastin 3基因，pls3在多個物種間同源，與神經和運動系統發(fā)育有關，是運動神經元保持活性的重要因子[34]。在斑馬魚卵受精后的不同發(fā)育過程中，circRNA 20表達持續(xù)上調，其可能對斑馬魚胚胎運動系統的發(fā)育具有重要的調節(jié)作用。

在人、小鼠和斑馬魚等不同動物物種之間高度保守的circRNA也得到了一定的研究[35- 36]。如：CDR1as是一種與小腦變性相關蛋白1轉錄本反義的circRNA[37]，可與神經組織中的miRNA- 7結合。研究表明過表達CDR1as可表現出類似于敲除miRNA- 7的生物學效應，抑制斑馬魚腦部的發(fā)育。且CDR1as與miRNA的結合能力比其他已知轉錄本強10倍，此類小分子可以作為miRNA的拮抗劑，參與基因的轉錄后調節(jié)過程[38- 39]，也表明circRNA可能通過復雜的機制參與器官的形成和發(fā)展(圖2)。

炎癥中的circRNA

由于circRNA的功能與其親本基因功能相似[40]，故可以通過現有的一些數據庫如KEGG、GO，對研究中發(fā)現的一些差異化表達的circRNA進行下游的靶標分析和功能富集分析等。此外，歸功于內毒素斑馬魚炎癥模型的成功建立與成熟應用，炎癥中的斑馬魚circRNA也有研究[41- 42]。劉東依[43]對內毒素引起的斑馬魚炎癥模型組、PBS空白對照組和配伍組分干預組中差異化表達的circRNA進行分析發(fā)現，斑馬魚炎癥模型組和PBS空白對照組之間差異化表達的circRNA有43個，其中dre_circ chr12：4631537- 46375145、dre_circ chr8：53519204- 53520037等18個circRNA表達量上調，dre_circ chr22：9417319- 9440114、dre_circ chr10：29431529- 29435905等表達量下調。而斑馬魚炎癥模型組和配伍組分干預組之間差異化表達的circRNA有27個，其中dre_circ chr24：37741203- 37767103、和dre_circ chr6：8813630- 8832610等17個circRNA表達量上調，dre_circ chr19：31644209- 31655263、dre_circ chr18：17827911- 17848482等表達量下調，功能富集分析結果顯示它們可能參與了細胞凋亡、MAPK等多種信號通路的調控作用，主要涉及碳水化合物跨膜轉運、蛋白質-DNA復合物的組裝等眾多生物學過程進而對內毒素引起的斑馬魚炎癥發(fā)生的過程產生影響。由此可見斑馬魚中的circRNA是通過極其復雜的機制參與到斑馬魚的炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，配伍組分可減少內毒素引起的斑馬魚炎癥模型中差異化表達的circRNA數，從多種途徑發(fā)揮抗炎作用(圖2)。

總 結

circRNA具有多種生物學功能，與各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關。目前研究顯示，斑馬魚中的circRNA的數量十分龐大，但斑馬魚的circRNA研究主要集中在發(fā)育過程當中，可能是因為斑馬魚生長速度快、幼體時通體透明方便觀察等因素利于發(fā)育的研究。其次，歸功于斑馬魚炎癥模型的成功建立及炎癥相關轉基因斑馬魚品系的產生，炎癥反應中的斑馬魚circRNA也得到了初步的研究[44- 45]。但其他疾病中的斑馬魚circRNA仍未得到研究，其一大原因可能是眾多疾病并未能在斑馬魚身上建立成熟的模型，這可能是未來斑馬魚及其circRNA的一大研究方向。

圖2 斑馬魚中的circRNA