閆蓉蓉，李書國

（河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050018）

食物過敏已成為一項(xiàng)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，近年來發(fā)病率在不斷上升[1]。牛乳過敏十分常見， 統(tǒng)計(jì)研究表明，我國嬰幼兒人群中近3%的人對牛乳過敏[2]。牛乳中有30種以上的蛋白質(zhì)存在潛在致敏性，其中乳清蛋白和酪蛋白是牛乳中的主要過敏原。而β-乳球蛋白在乳清蛋白中占50%，牛乳總蛋白中占10%，超過80%的牛乳過敏人群對β-乳球蛋白過敏[3]，所以檢測食品中的牛乳過敏原具有十分重要的意義。

目前，食品過敏原的檢測主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等儀器方法[4,5]，盡管這些方法有著結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但都存在著操作復(fù)雜、價格昂貴、耗時長等不足[6]。作為一種新型生物傳感器技術(shù)，免疫傳感器根據(jù)標(biāo)記與否，又分為標(biāo)記性免疫傳感器與非標(biāo)記性免疫傳感器[7]。標(biāo)記性免疫傳感器即采用某種標(biāo)記物使免疫反應(yīng)產(chǎn)生特定的信號，通過檢測這些信號定量檢測待測物質(zhì)。非標(biāo)記性免疫傳感器是通過換能器將抗原抗體結(jié)合后產(chǎn)生的變化轉(zhuǎn)化成光電信號，記錄、處理得到的光電信號即可檢測待測物質(zhì)。與各類儀器方法相比，免疫傳感器技術(shù)具有檢測速度快、成本低廉、操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類食品基質(zhì)的檢測[8]。

在免疫傳感器技術(shù)中，關(guān)于檢測β-乳球蛋白的文獻(xiàn)并不多，Eissa等[9]研制出的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器用于檢測牛乳過敏原β-乳球蛋白，檢測的線性范圍為1 pg/mL～100 ng/mL，檢出限為0.85 pg/mL；Ruiz-Valdepenas等[10]建立的夾心型電化學(xué)免疫方法，對β-乳球蛋白的線性檢測范圍為2.8～100 ng/mL，檢出限為0.8 ng/mL。本文的創(chuàng)新點(diǎn)在于用一種操作簡單、檢測迅速的電化學(xué)免疫傳感器檢測β-乳球蛋白，石墨烯-殼聚糖-納米金復(fù)合材料制備簡便，由于石墨烯-殼聚糖-納米金修飾電極檢測過敏原的文獻(xiàn)較少，因此本文選取了這三種修飾材料。

本文以殼聚糖、石墨烯和納米金為復(fù)合修飾材料固定化β-乳球蛋白抗體制備一種納米免疫傳感器，石墨烯（GS）具有優(yōu)良的性能與特殊的結(jié)構(gòu)，殼聚糖（CS）具有優(yōu)秀的生物相容性與成膜性，因此石墨烯和殼聚糖廣泛應(yīng)用于修飾電極領(lǐng)域，然而由于石墨烯材料易發(fā)生不可逆團(tuán)聚，因此具有較低的分散性，將石墨烯與殼聚糖按照合適的比例混合能夠使石墨烯更均勻地分散在殼聚糖溶液中，增強(qiáng)電子傳遞性能，制備的納米金對探針的氧化還原反應(yīng)具有催化作用，因此對免疫響應(yīng)電流具有放大作用，可提高該免疫傳感器的靈敏度，以該納米免疫傳感器為基礎(chǔ)，建立了一種快速測定乳品中β-乳球蛋白過敏原的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白（β-LG）標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；β-乳球蛋白多克隆抗體（1 mg/mL），美國Abcam公司；氯金酸（48%），上海麥克林生化科技有限公司；殼聚糖，北京索萊寶科技技術(shù)有限公司；99%石墨烯，北京德科島金科技有限公司；牛血清白蛋白，上海翊圣生物科技有限公司；對氨基苯甲酸、冰乙酸、檸檬酸三鈉，AR，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乳清蛋白粉，美國Leprino；水解乳清蛋白粉，TATUA；乳粉，新西蘭安佳全脂奶粉。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98BⅡ型微機(jī)電化學(xué)分析系統(tǒng)，天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；FRESCO21型冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾公司；RHD-S025型恒溫磁力攪拌器，德國IKA公司；GZX-9070 MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 CS/GS/AuNPs免疫傳感器的制備

1.3.1.1 玻碳電極預(yù)處理

將玻碳電極（GCE）用超純水沖洗一遍，采用粒徑0.05 μm的氧化鋁拋光粉打磨拋光至電極表面光滑，超純水沖洗電極，再將其依次放置于硝酸溶液（體積分?jǐn)?shù)50%）、丙酮和超純水中分別超聲2 min，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.3.1.2 免疫傳感器的復(fù)合修飾材料制備

分別配制1 mg/mL的殼聚糖溶液和1 mg/mL的石墨烯溶液；制備納米金顆粒（AuNPs）的方法，即把所有玻璃器皿均用王水浸泡過夜，取100 mL 0.01%氯金酸溶液于錐形瓶中，封口膜封口，100 ℃下攪拌加熱至沸騰，快速穿破封口膜并加入3 mL 1%的檸檬酸三鈉，較短時間內(nèi)溶液顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色，持續(xù)攪拌10 min不變色，移去加熱源，待降至室溫存于玻璃容器，4 ℃避光保存。

分別移取殼聚糖溶液、石墨烯溶液各1.5 mL，混勻超聲10 min。隨后加入納米金溶液3 mL，超聲分散處理15 min，制取殼聚糖-石墨烯-納米金（CS/GS/ AuNPs）懸浮液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?1.3.1.3β-乳球蛋白免疫傳感器制備

關(guān)于檢測β-乳球蛋白的免疫傳感器制備流程如圖1所示。利用三電極系統(tǒng)，以預(yù)處理的玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl電極為參比電極、鉑絲電極為輔助電極。首先進(jìn)行電聚合處理，在-1.5～0.8 V區(qū)間內(nèi)，以50 mV/s的掃速，在新鮮配制的1 mmol/L對氨基苯甲酸溶液中循環(huán)伏安（CV）掃描15圈。沖洗電極晾干，在表面滴加5 μL的1-乙基(二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合溶液活化處理1 h，其中EDC為400 mmol/L，NHS濃度為100 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。沖洗晾干，再在其表面滴加5 μL分散均勻的CS/GS/AuNPs修飾液，CS中氨基與玻碳電極表面活化后的羧基發(fā)生酸胺縮合反應(yīng)，可將修飾液固定在電極表面，室溫晾干后滴加4 μLβ-乳球蛋白抗體（濃度為10 μg/mL），37 ℃下溫育1 h，沖洗后滴加5 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，用于封閉剩余的未反應(yīng)活性位點(diǎn)，4 ℃下封閉30 min，制得anti-β-LG/CS/GS/AuNPs修飾的電化學(xué)免疫傳感器，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 電化學(xué)分析方法

在本文構(gòu)建的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器中，當(dāng)電極表面滴加修飾液、抗原、抗體以及抗原抗體發(fā)生免疫復(fù)合反應(yīng)生成絡(luò)合物時，電極表面的阻抗、電導(dǎo)率等均會產(chǎn)生變化。傳感器會將電極表面發(fā)生的電子轉(zhuǎn)移變化轉(zhuǎn)化成可記錄的電信號，通過檢測這些電信號來標(biāo)識修飾后的電流變化。

在電化學(xué)分析過程中，均采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行，即玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，在1.0 mmol/L的K3[Fe(CN)6]+ 0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.0）中反應(yīng)。針對玻碳電極在修飾以及免疫過程中的電化學(xué)特征，應(yīng)以修飾免疫后的玻碳電極（anti-β- LG/CS/GS/AuNPs/GCE）為工作電極，運(yùn)用CV法（電壓：-0.2～0.6 V，掃描速度：50 mV/s）記錄峰值變化。

1.3.2 免疫傳感器檢測條件優(yōu)化

1.3.2.1 復(fù)合修飾液的配比及用量的篩選

將制備的殼聚糖和石墨烯按照體積比為0.5、1.0和1.5均勻混合為2 mL修飾液，修飾電極采用循環(huán)伏安法掃描得到殼聚糖與石墨烯的最佳體積比，隨后將殼聚糖石墨烯混合物與納米金按照0.5、1.0和1.5體積比混合，循環(huán)伏安法掃描可得免疫傳感器修飾液配比。將修飾液CS/GS/AuNPs按照1、3、5、7、9 μL體積分別滴涂在玻碳電極上，CV掃描記錄峰電流響應(yīng)值。

1.3.2.2 底液pH值的選擇

將制備好的免疫傳感器在pH值為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的PBS溶液中進(jìn)行CV掃描測試，記錄電流響應(yīng)值。

1.3.2.3 抗體固定量的篩選

在免疫傳感器制備過程中，將β-LG抗體分別以20、30、40、50、60 ng滴涂在電極表面，隨后與同一濃度β-LG溫育后采用DPV掃描并記錄免疫前后的峰電流變化。

1.3.2.4 孵育溫度與時間的篩選

抗原抗體分別在溫度26、32、37、42 ℃下孵育30 min，運(yùn)用DPV掃描并記錄免疫前后的峰電流值變化?？乖贵w在37 ℃下，分別溫育10、20、30、40、50、60 min，DPV掃描并記錄免疫前后的峰電流值變化。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制為2倍梯度稀釋濃度的溶液，并滴涂在制備好的免疫傳感器上，得到β-LG/ anti-β-LG/CS/GS/AuNPs電極，37 ℃孵育30 min，通過三電極系統(tǒng)，運(yùn)用差分脈沖伏安法（DPV，電位：-0.2～0.6 V）測定并記錄不同濃度下的β-乳球蛋白峰電流值I。通過分析β-LG免疫前后的峰電流差值（ΔI）與對應(yīng)質(zhì)量濃度對數(shù)（logCβ-LG）的關(guān)系，繪制β-LG免疫傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.3.4 實(shí)際樣品的檢測

1.3.4.1 樣品處理

選取市售乳粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉3種樣品進(jìn)行檢測。乳粉預(yù)處理方法：取0.5 g樣品置于5 mL PBS溶液中，劇烈震蕩5 min混勻，在4 ℃冷凍離心機(jī)2500 G轉(zhuǎn)速下離心20 min，棄脂肪層，取上清備用。乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉均用PBS配制為25 mg/mL的溶液，振蕩5 min充分混勻備用。

1.3.4.2 樣品檢測方法

將待測樣品稀釋到最佳檢測范圍，并吸取5 μL滴涂在制備好的電化學(xué)免疫傳感器上，置于37 ℃下孵育30 min，采用DPV掃描記錄峰電流變化，將測得的峰電流值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待測樣品中β-LG濃度。同時用ELISA試劑盒檢測，與免疫傳感器的檢測結(jié)果做對比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)均為3次平行測定并取其平均值，通過SPSS軟件開展數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin Pro v8.0軟件繪制相關(guān)數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫傳感器的表征

2.1.1 CS/GS/AuNPs修飾電極的電化學(xué)表征

通過研究不用修飾材料的玻碳電極在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH=7.0）的測試底液中變化，采用CV法分別對裸GCE（a）、CS/GCE（b）、CS/GS/GCE（c）和CS/GS/AuNPs/GCE（d）進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。[Fe(CN)6]3-在裸玻碳GCE上出現(xiàn)一對較好的氧化還原峰，當(dāng)修飾CS后，可明顯觀察到峰電流減小，表明CS已成功固定在裸GCE表面，并阻礙了電子的轉(zhuǎn)移。當(dāng)修飾了CS/GS后，發(fā)現(xiàn)其氧化還原峰的電流迅速增大，表明通過導(dǎo)電材料修飾后電子更加容易在底液和電極之間轉(zhuǎn)移。利用成膜性較好的殼聚糖溶液分散高比表面積的石墨烯和納米金[11]，較小的石墨烯粒子和球狀形態(tài)的納米金為氧化還原探針提供了更快的電子轉(zhuǎn)移速度和更多的結(jié)合位點(diǎn)，增加β-LG抗體在傳感器表面的固定量。當(dāng)再次修飾CS/GS/AuNPs材料后，由于納米金的大比表面積和高傳導(dǎo)性能特點(diǎn)，進(jìn)一步加快電子傳遞速率，氧化還原峰電流值達(dá)到最大。可依據(jù)Randles-Sevcik方程進(jìn)行計(jì)算[12]，電極的電活性面積由公式求出：

式中：

I——陽極峰電流，μA；

D——擴(kuò)散系數(shù)，7.6×10-6cm2/s；

n——參與氧化還原反應(yīng)的電子數(shù)，n=1；

γ——電位變化速率，0.05 V/s；

C——K3Fe(CN)6的濃度，1 mmol/L；

通過計(jì)算可得裸GCE電極、CS/GS電極和CS/GS/ AuNPs電極的有效電極面積分別為0.089 cm2、0.136 cm2和0.170 cm2。表明經(jīng)過石墨烯和納米金修飾后的電極活性表面面積明顯增大，同時也表明納米金對該修飾電極具有電信號放大作用，使電化學(xué)免疫傳感器具有更靈敏的檢測度。

圖3是在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl +0.2 mol/L PBS（pH=7.0）的測試底液中進(jìn)行得到的交流阻抗圖。當(dāng)電極表面滴涂不同的修飾液后，阻抗值會發(fā)生相應(yīng)的變化。與玻碳電極的阻抗圖（曲線a）相比，電極表面滴加CS/GS后（曲線c），阻抗值會變小，說明CS-GS修飾液能夠提高電極的導(dǎo)電率；當(dāng)?shù)渭覥S/GS/AuNPs修飾液后（曲線d），電極表面的阻抗值進(jìn)一步降低，表明CS-GS修飾液與納米金修飾到了電極表面，能夠顯著提高電極表面的導(dǎo)電性，促進(jìn)K3[Fe(CN)6]與電極界面間的電子轉(zhuǎn)移；當(dāng)β-LG抗體與電極表面結(jié)合后（曲線e），由于抗體屬于大分子蛋白，在電極表面作用后使電子轉(zhuǎn)移速度降低，因此阻抗值變大。

2.1.2 免疫反應(yīng)的電化學(xué)表征

中國白酒以醇甜、酯香為主要特點(diǎn)，輔以眾多的酸類、醛酮類及其他物質(zhì)，分析原酒中的微量成分可在很大程度上揭示發(fā)酵過程中微生物的代謝狀況及原酒質(zhì)量狀況[8]。

在制備好的CS/GS/AuNPs/GCE表面滴加8 μLβ-乳球蛋白抗體，孵育一定時間后，通過循環(huán)伏安法掃描可明顯觀察到其氧化還原峰電流相比修飾電極有明顯下降，由于抗體屬大分子蛋白，電阻率相對較大，阻礙了鐵氰化鉀分子在電極表面和底液之間的傳遞，導(dǎo)致電流值下降，同時也表明β-LG抗體固定在了電極表面。隨后在其表面再滴加1% BSA溶液封閉電極上剩余的活性位點(diǎn)，最后滴加一定濃度β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，氧化峰電流值進(jìn)一步下降，表明抗原抗體發(fā)生了特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，會進(jìn)一步增大電子傳遞較高穩(wěn)定性阻力。如圖4所示。

anti-β-LG/CS/GS/AuNPs/GCE 在 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L PBS（pH為7.0）測試底液和-0.2～0.6 V的電位范圍內(nèi)，進(jìn)行不同掃描速度（a～h：20～160 mV/s）的循環(huán)伏安法處理。由圖5可知，免疫傳感器的循環(huán)伏安氧化還原峰電流隨著掃描速率的增大而增大，氧化峰和還原峰的電流值都分別與各自的掃描速度平方根呈現(xiàn)以下線性關(guān)系：氧化峰y1=2.0675x+3.4279，線性相關(guān)系數(shù)R12=0.9960；還原峰y2=2.24104x+1.86741，線性相關(guān)系數(shù)R22=0.9946。由此表明發(fā)生在該電極上的反應(yīng)受擴(kuò)散過程控制。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1 修飾液的配比及用量的確定

將不同配比的修飾液等體積滴涂電極表面，結(jié)果如圖6所示，殼聚糖和石墨烯體積比為1:1時，電流最大，隨后加入納米金，體積比為1.0時峰電流也達(dá)到最大，當(dāng)再增加體積比時，峰電流變化緩慢，因此配制修飾液時，選擇殼聚糖和石墨烯體積比為1.0，隨后納米金再以體積比1.0加入其余兩個的混合液。將制備好的修飾液以不同體積修飾玻碳電極，結(jié)果如圖6所示，峰電流先快速增大后又基本維持不變，當(dāng)CS/GS/AuNPs為5 μL時，達(dá)到最大峰電流值，表明此時修飾材料最大程度地吸附在電極表面，當(dāng)再增大修飾量，電極吸附量已經(jīng)飽和，因此電流值基本保持不變，故選擇5 μL作為電極表面修飾量。

2.2.2 不同反應(yīng)條件對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響

2.2.2.1 底液pH值對免疫傳感器的影響

底液pH值對免疫傳感器檢測精確度密切相關(guān)，pH值可直接影響吸附在電極表面的β-乳球蛋白抗體的活性，導(dǎo)致檢測結(jié)果的變化。如圖7a所示，隨著底液pH值增大，免疫響應(yīng)電流值先增大后減少，當(dāng)pH值為7.0時峰電流值達(dá)到最大。表明pH值過大過小都抑制了β-乳球蛋白抗體的活性，導(dǎo)致電流值下降，因此選擇pH值7.0作為最佳測試底液。

2.2.2.2 抗體固載量對免疫傳感器的影響

抗體固載量影響抗原抗體在免疫傳感器表面的吸附量進(jìn)而影響電流響應(yīng)，β-乳球蛋白抗體分別以20、30、40、50、60 ng質(zhì)量滴涂在電極表面，DPV掃描結(jié)果如圖7b所示。增加抗體滴涂量，免疫響應(yīng)峰電流差值ΔI迅速增大隨后逐漸趨于平緩。當(dāng)固載量較少時，抗原抗體吸附在電極表面的數(shù)量較少，同樣電子傳遞阻力也較小，峰電流值較大；當(dāng)抗體固載量達(dá)到40 ng后，抗原抗體完全結(jié)合達(dá)到飽和，導(dǎo)電能力下降，DPV峰電流差值達(dá)到頂峰，當(dāng)再增加滴涂量其電流響應(yīng)值變化不大，因此選擇40 ng作為β-乳球蛋白最適抗體固載量。

2.2.2.3 孵育溫度對免疫傳感器的影響

抗原抗體的孵育溫度在免疫傳感器檢測中尤為重要，在一定范圍內(nèi)升高孵育溫度可加快抗原抗體充分結(jié)合，但溫度過高亦可破壞抗體蛋白結(jié)構(gòu)影響DPV峰電流響應(yīng)。將β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與免疫傳感器在26～48 ℃溫育，結(jié)果顯示免疫前后峰電流變化值ΔI隨著溫度升高也逐漸增大，這是由于抗原抗體復(fù)合物的不斷增多導(dǎo)致電子傳遞阻力增大，造成免疫前后峰電流變化值也變大。如圖7c所示，當(dāng)溫度為37 ℃時，ΔI達(dá)到最大，隨后溫度升高ΔI隨之減小，這是由于溫度過高致使抗體失活，抗原抗體復(fù)合物減少，因此選擇37 ℃為最佳孵育溫度。

2.2.2.4 孵育時間對免疫傳感器的影響

免疫傳感器的電信號輸出也受抗原抗體孵育時間的影響。如圖7d所示，隨著β-乳球蛋白抗原與抗體免疫反應(yīng)時間的增加，其免疫前后DPV峰電流差值ΔI也逐漸增大，抗原抗體結(jié)合需要一定時間，該過程并沒有形成穩(wěn)定的復(fù)合物固定在電極表面。但當(dāng)孵育時間到達(dá)30 min以后，其免疫前后ΔI趨于平緩，表明此時電極表明的抗原抗體已充分反應(yīng)結(jié)合，因此選擇30 min為最佳孵育時間。

2.3 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用制備好的電化學(xué)免疫傳感器通過差分脈沖伏安法測定在濃度為0、1、2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰電流值。結(jié)果如圖8所示，免疫前后的峰電流差值ΔI與β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的對數(shù)（logCβ-LG）在2.5 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)成正比關(guān)系，線性方程為y=5.998x+2.937，R2=0.99064，檢出限（S/N=3）為0.75 ng/mL。Boitz等[13]建立了一種UPLC用于檢測熱處理牛乳樣品中的β-乳球蛋白，此方法的線性檢測范圍為20 μg/mL～560 μg/mL，檢出限為7 μg/mL，檢測共耗時3 min。Ji等[14]開發(fā)和驗(yàn)證了一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的方法用于檢測食品中的牛奶過敏原，此方法對β-乳球蛋白的線性檢測范圍為0.48～31.25 μg/mL，檢出限為0.20 μg/mL。如表1所示，與其他方法相比，本文制備的免疫傳感器具有更低的檢測限，可用于牛乳過敏原β-乳球蛋白的痕量檢測。

表1 β-乳球蛋白三種檢測方法的對比 Table 1 Comparison of three detection methods of β-lactoglobulin

2.4 免疫傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與特異性

在完全相同的檢測條件下，將制備的anti-β-LG/ CS/GS/AuNPs免疫傳感器分別掃描5圈、10圈、15圈、20圈，結(jié)果如圖9a所示，連續(xù)掃描20圈，電流響應(yīng)值僅下降4.01%，同樣將制備好的免疫傳感器于4 ℃保存，每隔2 d檢測其電流值，結(jié)果如圖9b所示，1周后電流下降率為5.66%，表明制備的免疫傳感器擁有較高穩(wěn)定性。分別制備不同批次的3支免疫傳感器并檢測同一濃度β-乳球蛋白，記錄免疫前后的峰電流變化值ΔI，結(jié)果如圖9c所示，其平均變化率僅為5.40%，表明該傳感器重現(xiàn)性較好。

將免疫傳感器與3種非特異性蛋白BSA、α-LA和Casein孵育，與特異性蛋白β-乳球蛋白對照，其中β-乳球蛋白濃度為100 ng/mL，其余3種為1000 ng/mL，采用差分脈沖伏安法掃描測得免疫前后峰電流差值ΔI，結(jié)果如圖9d，BSA、α-LA和Casein免疫前后的峰電流變化遠(yuǎn)小于β-乳球蛋白，因此表明該免疫傳感器的特異性較好。

2.5 樣品檢測及其加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過1.3.4處理后的3種樣品，在免疫傳感器的最優(yōu)檢測條件下進(jìn)行DPV掃描，記錄對應(yīng)的免疫前后峰電流差值，代入線性回歸方程計(jì)算待測樣品中β-乳球蛋白的濃度。此外再向3種樣品中分別加入不同濃度β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次，按照公式計(jì)算，同時也采用ELISA法測定比對，結(jié)果見表2。

由表2測定結(jié)果和加標(biāo)回收率可知，采用免疫傳感器測定3種樣品的回收率都在88.59%～97.64%之間，相對偏差在2.47%～6.06%范圍內(nèi)，與ELISA法比較，兩者結(jié)果基本一致，表明該方法可以用于實(shí)際樣品檢測。由此可得，相比于其他分析方法，本法建立的電化學(xué)免疫傳感器檢測β-乳球蛋白具有較高的靈敏度。

表2 樣品中β-LG的測定結(jié)果及其加標(biāo)回收率 Table 2 β-LG determination results in the samples and its spike-and-recovery experience

3 結(jié)論

本文制備了一種用于檢測β-乳球蛋白的高靈敏度的無標(biāo)記電流型免疫傳感器，針對構(gòu)建的β-乳球蛋白免疫傳感器進(jìn)行電化學(xué)行為表征，并優(yōu)化了其試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，該納米免疫傳感器在2.5～100 ng/mL范圍內(nèi)，免疫響應(yīng)電流值與β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的對數(shù)成正比關(guān)系，其檢出限為0.75 ng/mL，具有較高的靈敏度和良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和特異性。在實(shí)際乳品樣品檢測中，該法的加標(biāo)回收率位于88.59%～ 97.64%之間，回收率較好，經(jīng)ELISA驗(yàn)證，結(jié)果基本一致，因此該法可用于乳制品中β-乳球蛋白抗原的快速檢測。