陳麗瓊，關鑫,2，黃壯霖，曾淑嫻，張文鑫，梁一*

（1.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院檢驗醫(yī)學研究所臨床免疫學教研室，廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808）（2.天津市濱海新區(qū)疾病預防控制中心，天津 300450）

乳腺癌（Breast cancer，BC）是全球女性高發(fā)且死亡率高的惡性腫瘤之一，早期診斷對降低死亡率意義重大。目前臨床診斷手段主要是乳腺造影、超聲、病理組化等，檢測到的依然是晚期階段。因此，尋找早期更高效的分子標志物是臨床診斷及疾病監(jiān)控亟需解決的重要問題[1]。

糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，糖基化蛋白水平的檢測被認為是一種新型腫瘤標志物，可提高單純檢測蛋白水平的臨床診斷效能[2,3]。乳腺癌中被報道存在異常唾液酸化sialylation、巖藻糖修飾fucosylation、O-Glycosylation、末端β-N-acetylglucosamine（GlcNAc）修飾（包括O-GlcNAcylation）[4-8]。多項研究發(fā)現，末端GlcNAc的修飾出現在睪丸細胞表面[9,10]、人白血病細胞[11]、結腸癌相關抗原[12]、及前列腺癌患者血清中[13]，且這種修飾在多種惡性腫瘤（包括乳腺癌）患者血清中出現，被認為是一種腫瘤相關糖基抗原[8]。然而，由于缺少特異性的抗體，這種糖基結構目前研究甚少。

凝集素可與不同糖基結構有高親和力的作用，被廣泛用于糖生物學的研究[14,15]。檢測GlcNAc常用的凝集素主要有麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）[16]、加納籽凝集素（Griffonia simplicifolialectin-II，GSL-II）[17]和楊樹菇凝集素（Agrocybe aegeritalectin 2，AAL2）[18]，其中，AAL2被認為是結合末端GlcNAc糖修飾親和力和特異性最高的凝集素[18,19]。因此，本文將檢測健康人（Healthy volunteers, HE）和乳腺癌患者（BC）血漿中三種候選腫瘤標志物血漿蛋白酶C1抑制劑（plasma protease C1 inhibitor，C1Inh）、Serpin B4和血清轉鐵蛋白（serotransferrin，TF）的蛋白表達水平，并用反向凝集素（AAL2）ELISA法檢測三種候選標志物的GlcNAc修飾的糖蛋白表達水平，探討其蛋白表達和糖蛋白表達水平的診斷效能差別，為糖蛋白在疾病診斷中的意義及凝集素的應用提供數據。

1 材料與方法

1.1 臨床血漿樣本采集

53例血漿標本來自廣東省中山市小欖醫(yī)院乳腺癌患者，所有患者均經術后病理檢查確診，根據美國癌癥劃分聯(lián)合委員會（American Joint Commission for Cancer Staging，AJCC）的第七版乳腺癌臨床分期標準，分為Stage0：TisN0M0；StageⅠ：T1N0M0；StageⅡA：T0N1M0，T1N1M0，T2N0M0；StageⅡB：T2N1M0，T3N0M0；StageⅢA：T0N2M0，T1N2M0，T2N2M0，T3N1-2M0；StageⅢB：T4N0-2M0；StageⅢC：任何TN3M0；StageⅣ：任何T任何NM1。其中Tis是原位癌，T代表原發(fā)性腫瘤，N即為區(qū)域淋巴結，M表示遠處轉移。分組為Breast cancer 1（BC1）組：26例Stage I和Stage IIa；BC2組：9例Stage IIb；BC3組：14例Stage IIIa和Stage IIIb；BC4組：4例Stage IV。同期在東莞市第六人民醫(yī)院體檢科收集21例健康女性體檢者血漿為對照。所有參與者均通過書面知情同意并通過廣東醫(yī)科大學和樣本來源醫(yī)院倫理委員會論證。患者標本信息列于表1。

表1 乳腺癌患者和健康者臨床統(tǒng)計信息 Table 1 Clinical and demographic characteristics of breast cancer patients and healthy volunteers

標本收集真空抗凝管中，4 ℃，400 g，離心10 min，離心后血漿分裝于冷凍管中，保存在-80 ℃低溫冰箱中，每支凍存管內的血漿標本不得反復凍融超過3次。

1.2 凝集素的制備

楊樹菇凝集素的制備參考之前的方法[18-20]。楊樹菇干粉通過浸泡、過濾和離心方式收集濾液。在濾液中加入硫酸銨至飽和度為40%，攪拌20 min，離心收集上清。在上清中加入硫酸銨至80%飽和度，沉淀60 min后離心收集沉淀。用PBS重懸沉淀，透析除鹽得到總蛋白。用0.45 μm的濾膜過濾總蛋白，安裝GlcNAc-Sepharose 6B親和層析柱，用TBS（20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.4，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MnCl2）平衡柱子30 min，調節(jié)流速為1 mL/min。將總蛋白溶液上樣到親和層析柱，TBS溶液洗脫雜蛋白，用200 mmol/L GlcNAc的TBS緩沖液洗脫，收集目的蛋白AAL2，透析真空干燥后于-20 ℃保存。

1.3 免疫印跡

經BCA試劑盒定量，取50 μg～100 μg血漿蛋白，使用12%的SDS-PAGE電泳完成蛋白分離，依據目的蛋白分子量大小以250 mA進行轉膜60 min，用3% BSA在室溫封閉1 h。將一抗anti-serpin B4、anti-serotransferrin、anti-plasma protease C1 inhibitor（ProteinTech，武漢）用封閉液稀釋（1:1000），4 ℃孵育過夜。用TBST室溫洗滌三次，每次10 min。加入HRP-羊抗兔IgG稀釋液（1:2000），室溫孵育2 h，用TBST洗脫三次，每次10 min。蛋白條帶使用化學發(fā)光法ECL系統(tǒng)（Thermo）檢測，用凝膠圖象處理系統(tǒng)（imageJ）分析目標條帶的相對灰度值。

1.4 反向凝集素ELISA

用4 μg/mL的AAL2（溶于15 mmol/L碳酸鈉緩沖溶液，pH 9.6）包被96孔ELISA板，4 ℃過夜，PBST清洗一次，使用5%脫脂奶粉封閉液4 ℃封閉5 h，洗滌五次。每孔加入100 μL的1:20稀釋的血漿標本，室溫孵育1 h，洗滌五次，加入生物素標記的目的糖蛋白抗體（1:1500）室溫孵育1 h，洗滌五次，加入HRP-鏈霉親和素（1:1000）孵育1 h，洗滌五次，加入TMB反應15～30 min，加入終止液，于酶標儀波長450 nm下檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

免疫印跡和反向lectin-ELISA數據使用GraghPad Prism軟件的nonparametric unpaired t-test做統(tǒng)計分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計學差異。使用SPSS統(tǒng)計學軟件（15.0版本）分析ROC曲線下面積，多元方差分析通過邏輯回歸完成。

2 結果與討論

2.1 乳腺癌與健康人群血漿候選腫瘤標志物的蛋白水平比較

在之前的研究當中，我們通過凝集素富集結合質譜鑒定到53種差異表達蛋白，從中選擇C1Inh、Serpin B4和TF這三個蛋白，通過免疫印跡和ROC曲線進一步驗證其表達差異。

如圖1a～1d所示，與HE組相比，C1Inh的蛋白表達水平在BC3、BC4和擴散期疾病組（extensive stage disease，ED）顯著降低（圖1a～1d）。與BC1組相比，C1Inh的蛋白表達水平在BC4組顯著降低（p＜0.05）。與BC2組相比，C1Inh的蛋白表達水平在BC4組也顯著降低（p＜0.01）（圖1a～1d）。由此可見，C1Inh的蛋白表達水平在乳腺癌患者中明顯降低，且隨著病情的加重其表達越低。HE/BC1、HE/局限性疾病組（limited stage disease，LD）、HE/ED分別的ROC線下面積（area under curve，AUC）分別為0.66、0.58和0.80。

Serpin B4也叫鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen 2，SCCA2），被報道在多種腫瘤（包括宮頸癌、肺癌、肝癌等）中高表達[21-23]，我們的結果中也發(fā)現，與HE組相比，serpin B4的蛋白表達水平在BC2組顯著升高（p＜0.05）（圖1e～1h），與BC1組相比，serpin B4的蛋白表達水平在BC2組也顯著升高（p＜0.05）（圖1e～1h），這與在其他腫瘤中的研究是一致的。同時結果表明serpin B4在HE/BC1、HE/LD、HE/ED組的AUC值分別為0.62、0.64和0.68。TF蛋白是血清和腦脊液中通過轉運調控鐵含量的糖蛋白，它還是負向調節(jié)的急性期蛋白，其蛋白表達水平在不同病理狀態(tài)下不同[24]，例如，在胃癌[25]、宮頸癌[26]、卵巢癌[27,28]中降低，在胰腺癌中升高[29]。我們的結果中與HE相比，TF蛋白的表達水平在BC1、BC2、BC4和LD顯著降低（圖1i～1l），這與大多數腫瘤中的表達是一致的。同時，與BC1組相比，TF的蛋白表達水平在BC4組顯著降低（p＜0.05）（圖1i～1l）。另外，TF蛋白在HE/BC1、HE/LD和HE/ED組的AUC值分別為0.73、0.74和0.81。

2.2 乳腺癌與健康人群血漿候選腫瘤標志物的GlcNAc修飾蛋白水平比較

研究表明，反向凝集素ELISA可用于檢測糖基化修飾的蛋白[30-32]。因此為了檢測樣本中GlcNAc修飾的C1Inh、serpinB4和TF的表達水平，建立了一種基于AAL2的反向凝集素ELISA技術。用凝集素AAL2包被ELISA板，利用凝集素與相應糖基特異性結合的特點富集樣品中帶有N-乙酰葡萄糖胺的糖蛋白后，再用腫瘤標志物對應的生物素化的抗體檢測，進而評估樣品中糖蛋白水平的差異。如圖2a～2d，與健康對照組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達在BC1、BC2、BC3、BC4、LD和ED組顯著升高，且與LD組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達在ED組顯著升高，與BC1組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達在BC2、BC4組均升高。與健康對照組相比，GlcNAc修飾的serpin B4在BC1、BC3、BC4、LD和ED組均顯著降低，且與LD組相比，GlcNAc修飾的serpin B4的表達在ED組中顯著降低（圖2e～2h），與BC1組相比，GlcNAc修飾的serpin B4的表達在BC4組中顯著降低（圖2e～2h）。與健康對照組相比，GlcNAc修飾的TF表達在BC1、BC2、BC3、BC4、LD和ED組顯著升高。值得注意的是，三個候選腫瘤標志物的糖蛋白表達水平和蛋白表達水平均不一致。大量蛋白質被發(fā)現具有糖基化修飾，研究表明這種糖基化的異常表達與腫瘤的進程有著重要的作用，同時糖基化修飾可以調節(jié)細胞過程，如信號轉導、轉錄、翻譯和蛋白質降解[33,34]。本實驗結果發(fā)現，這三種蛋白的GlcNAc修飾水平在健康組和乳腺癌患者中的表達不同，提示GlcNAc修飾可能通過不同方式影響這三種蛋白的表達以及功能，進而影響其在乳腺癌中發(fā)揮不同的作用，其中的分子機制仍待進一步的探索。

研究表明，異常糖基化修飾的SCCA2會影響免疫檢測反應[35]，提示臨床標本中存在糖基化serpin B4并且具有臨床檢測價值。像許多急性期蛋白[36]，TF糖基化程度很高[24,37]。唾液酸化的TF在胃癌中高表達[38]，而巖藻糖化的TF在肝癌中高表達[39]，但在乳腺癌中低表達[40]。另外，tetrasialotransferrin（糖基化TF）在胰腺癌中高表達[24]，而trisialotransferrin在肝癌中低表達[41]。本研究結果發(fā)現GlcNAc修飾的TF在乳腺癌中高表達，這說明TF上有多種類型糖基修飾，不同疾病模型中不同糖基修飾蛋白表達水平的檢測值得進一步的探討。

ROC曲線用于分析糖基化修飾蛋白在健康人和腫瘤患者之間的診斷價值。在健康組和BC1組，GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.69、0.76和0.83。在健康組和LD組，GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.75、0.74和0.84。在健康組和ED組，修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.82、0.82和0.93（圖2）。從表2中可見，糖基化蛋白表現出比檢測總蛋白水平更好的診斷價值，GlcNAc修飾的TF在對BC1、LD和ED對健康人的診斷中，AUC值最高。

表2 候選蛋白及糖蛋白在乳腺癌中的臨床診斷表現 Table 2 Performance of candidate proteins or glycoproteins in distinguishing breast cancer

大約有75種標志物被食品藥品管理局Food and Drug Administration（FDA）批準，但絕大多數都只是用于輔助疾病的診斷[42]。而越來越多的研究表明，僅基于蛋白水平的生物標志物檢測無法提供足夠的特異性和敏感性[43-45]。一個最著名的例子就是core fucosylated alpha-fetoprotein（AFP-L3），比單獨檢測AFP具有更高的診斷價值[44]，因此被FDA批準為肝細胞癌的診斷標志物。扁豆凝集素Lens culinarisagglutinin（LCA）常作為富集和檢測AFP-L3的工具[46,47]。末端GlcNAc修飾蛋白在許多腫瘤中出現異常表達[8]，而AAL2與末端GlcNAc結合親和力很高，因此，可以用于GlcNAc修飾蛋白的檢測。本研究發(fā)現C1Inh、serpin B4和TF蛋白水平和糖基化水平在乳腺癌患者血漿中的變化不一致，且糖蛋白的臨床診斷價值均高于總蛋白的檢測，這也進一步提示我們檢測糖基修飾蛋白在疾病診斷中的重要意義[48]。

2.3 聯(lián)合檢測糖基化修飾蛋白的診斷價值評估

最后，使用ROC曲線評估聯(lián)合檢測糖基化蛋白的診斷價值（圖3和表2）。HE組和BC1組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.89，特異性和敏感性分別是85%和94%，比單獨檢測GlcNAc修飾的TF的特異性和敏感性都高。HE和LD組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.89，特異性和敏感性分別是85%和91.7%，比單獨檢測GlcNAc修飾的TF的特異性高。HE和ED組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.94，特異性和敏感性分別是90%和91%，比單獨檢測GlcNAc修飾的TF的特異性高。

3 結論

糖基修飾蛋白作為疾病標志物引起越來越多的關注，本文使用楊樹菇凝集素AAL2結合GlcNAc修飾蛋白，通過反向凝集素ELISA檢測末端GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF，發(fā)現糖基化蛋白的水平與總蛋白表達水平在乳腺癌患者和健康人群中的變化不一致，且糖基化蛋白的診斷效能更高。其中GlcNAc修飾的TF和serpin B4可作為潛在的候選標志物，未來需要在大量標本中進一步驗證凝集素在檢測GlcNAc修飾蛋白的診斷應用。