曹 越 李大彪 孫 梅 母曉佳 郝怡泓 楊 靜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點實驗室，呼和浩特 010018)

乳蛋白是牛乳中的主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，其總量的70%以上是酪蛋白，主要包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白[1]。乳蛋白含量的高低直接影響牛奶品質(zhì)的優(yōu)劣。乳腺是具有合成和分泌功能的特殊器官，約90%的乳蛋白是乳腺組織利用血液中的游離氨基酸(amino acid，AA)在乳腺中從頭合成的[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，某些氨基酸，如精氨酸在乳蛋白中的含量低于乳腺從血液中吸收的量[3]，這是因為吸收入血的精氨酸除了可以作為蛋白質(zhì)合成的底物，還對體內(nèi)一氧化氮、肌酸和多胺等物質(zhì)的合成代謝過程具有功能性調(diào)節(jié)作用[4-5]。精氨酸在乳腺細胞中可以通過精氨酸-鳥氨酸代謝途徑轉(zhuǎn)化生成多胺，其具有促進細胞增殖、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)以及合成的作用[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)精氨酸還可以作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路調(diào)控動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。當(dāng)細胞外精氨酸供應(yīng)發(fā)生改變時，處于活化狀態(tài)的mTOR就會級聯(lián)調(diào)控下游的效應(yīng)蛋白核糖體蛋白S6激酶(S6K)，進而參與細胞生長、分化、增殖及蛋白質(zhì)合成等過程[7]。仔豬飼糧中添加10 g/kg精氨酸可顯著提高肌肉組織mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平，并提高肌蛋白轉(zhuǎn)化效率[8]。飼糧中添加12.8 g/kg的精氨酸可以顯著提高大鼠乳腺細胞的活力及β-酪蛋白的合成量[9]。添加0.3 mmol/L精氨酸顯著增加豬小腸上皮細胞mTOR及其下游信號分子S6K的磷酸化水平，進而促進豬小腸上皮細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞增殖[10-11]。

近年來，從微觀分子生物學(xué)角度探究氨基酸對奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)乳蛋白合成的影響機制已經(jīng)成為泌乳生物學(xué)的研究熱點。目前關(guān)于精氨酸對乳腺氨基酸代謝影響的研究大多以單胃動物為模型開展，而前人對反芻動物尤其是奶牛乳腺組織酪蛋白合成的研究僅停留在基因轉(zhuǎn)錄水平上[12-13]，本研究擬在基因轉(zhuǎn)錄水平的基礎(chǔ)上進一步從蛋白質(zhì)翻譯水平，深入闡述精氨酸對反芻動物乳腺酪蛋白合成的影響。鑒于此，本試驗以BMECs為模型，研究不同濃度精氨酸對BMECs增殖率、精氨酸代謝關(guān)鍵酶活性、酪蛋白基因及蛋白表達量的影響，并從mTOR信號通路初步闡述其作用機制，為調(diào)控奶牛乳成分合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基(12491-015)購自Gbico公司；L-精氨酸(A6969)、氫化可的松(H0135)、表皮生長因子(E4127)和膠原酶Ⅱ(17101-015)購自Sigma公司；胎牛血清(SH30084.03)購自Hyclone公司；RNA iso-plus(SD1410)、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(RR047A)、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(RR820A)和4X SDS-PAGE Loading Buffer(AJE0870A)購自TaKaRa公司；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(MM-5107101；MM-5106901)購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；制膠試劑盒(P1200-1)、細胞裂解液(R0020)和BCA試劑盒(PC0020)購自Solarbio公司；轉(zhuǎn)膜液(P0021B)、電泳液(P0014B)和封閉液(P0228)購自北京碧云天科技有限公司；S6K(2708S)、pS6K(97596S)和β-肌動蛋白(4970S)抗體購自CST公司；酪蛋白抗體(ab166596)、mTOR抗體(ab2732)和P-mTOR抗體(ab84400)購自Abcam公司。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，以0.70 mmol/L精氨酸(DMEM培養(yǎng)基中精氨酸的濃度)為對照組，參照前人研究結(jié)果[14-15]，試驗組精氨酸的濃度分別為1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L，每組6個重復(fù)。采集健康奶牛的乳腺組織，分離培養(yǎng)BMECs，將P3代BMECs接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，當(dāng)細胞生長至80%匯合時，更換饑餓培養(yǎng)基(無血清)培養(yǎng)16 h，再用含不同濃度精氨酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞用于相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 試驗方法

1.3.1 原代BMECs分離培養(yǎng)

從屠宰場采集健康奶牛的乳腺組織，分離培養(yǎng)BMECs。用手術(shù)刀將最外層的乳腺組織剝離干凈，避開乳導(dǎo)管、血管及結(jié)締組織等部位，從內(nèi)部剪取適宜大小的組織塊放入3×雙抗磷酸緩沖溶液中，轉(zhuǎn)入超凈臺，先用3×雙抗磷酸緩沖溶液清洗2次，再用酒精浸泡約60 s，最后用1×雙抗磷酸緩沖溶液清洗3次。用已滅菌的眼科剪選取無導(dǎo)管且富含腺泡的乳腺樣品放入小瓶中，在小瓶中將組織塊反復(fù)剪碎，直至看不到明顯塊狀為宜，再加3 mL的膠原酶Ⅱ，確?；旌贤耆蠓诺脚囵B(yǎng)箱中進行消化，計時80 min，每隔20 min取出離心管上下顛倒。待消化結(jié)束后，將樣品用無菌濾網(wǎng)過濾、離心(1 280×g)8 min后，將細胞懸浮于生長培養(yǎng)基進行37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)。

1.3.2 BMECs活力的測定

將細胞接種于96孔板，加入200 μL生長培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)至20和24 h分別加入MTT溶液20 μL和二甲基亞砜100 μL，置于搖床振蕩10 min。用全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm的吸光度(OD)值。細胞相對增殖率(RGR)計算公式如下：

細胞相對增殖率(%)=100×試驗組OD490 nm/對照組OD490 nm。

1.3.3 精氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，棄去6孔板中的細胞培養(yǎng)液，收集細胞沉淀于1.5 mL EP管中。加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)調(diào)整細胞濃度為106個/mL左右。反復(fù)凍融破壞細胞后離心20 min，取上清液。采用雙抗體夾心ELISA測定，根據(jù)試劑盒提供的方法對精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活性進行測定，全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm樣品OD值，將其代入標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)OD值擬合出的線性方程，從而得到精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶的活性。

1.3.4 精氨酸代謝相關(guān)酶、酪蛋白和mTOR信號通路基因相對表達量的測定

培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞于1.5 mL EP管中加入400 μL RNA裂解液，提取總RNA并測定其濃度及OD260 nm/OD280 nm，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-肌動蛋白、磷酸甘油醛脫氫酶和泛素表達轉(zhuǎn)錄因子為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR技術(shù)檢測精氨酸代謝相關(guān)酶、酪蛋白以及mTOR信號通路基因的相對表達量。引物序列及參數(shù)見表1。目的基因相對表達量采用2-△△Ct法計算分析。

表1 引物序列及參數(shù)

1.3.5 酪蛋白表達量及mTOR信號通路蛋白磷酸化水平的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，在細胞沉淀中加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射性免疫沉淀緩沖液(RIPA裂解液)于冰上裂解30 min，然后離心5 min，取上清測定蛋白濃度。蛋白樣品稀釋、變性后采用Western Blot技術(shù)[16]測定α-酪蛋白表達量以及mTOR和S6K蛋白磷酸化水平。結(jié)果使用Image StudioVer 5.2軟件進行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2016對數(shù)據(jù)計算整理，利用SAS 9.0軟件的one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同濃度的精氨酸對BMECs增殖率的影響

由表2可知，當(dāng)精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，BMECs的增殖率顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，11.20 mmol/L精氨酸組BMECs的增殖率顯著低于對照組(P<0.05)，1.40和5.60 mmol/L精氨酸組BMECs的增殖率與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表2 添加不同濃度的精氨酸對BMECs增殖率的影響

2.2 添加不同濃度的精氨酸對BMECs中精氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由表3可知，當(dāng)精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，BMECs中精氨酸酶活性顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，1.40、2.80和11.20 mmol/L精氨酸組BMECs中精氨酸酶活性與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，BMECs中鳥氨酸脫羧酶活性顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，1.40和11.20 mmol/L精氨酸組BMECs中鳥氨酸脫羧酶活性與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 添加不同濃度的精氨酸對BMECs中精氨酸代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.3 添加不同濃度的精氨酸對BMECs精氨酸代謝關(guān)鍵酶基因表達量的影響

由表4可知，當(dāng)精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，BMECs中精氨酸酶基因相對表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，1.40和5.60 mmol/L精氨酸組BMECs中精氨酸酶基因相對表達量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，BMECs中鳥氨酸脫羧酶基因相對表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，1.40和11.20 mmol/L精氨酸組BMECs中鳥氨酸脫羧酶基因相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 添加不同濃度的精氨酸對BMECs精氨酸代謝關(guān)鍵酶基因相對表達量的影響

2.4 添加不同濃度的精氨酸對BMECs酪蛋白基因相對表達量的影響

由表5可知，當(dāng)精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，BMECs中CSN1S1基因相對表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)；11.20 mmol/L精氨酸組BMECs中CSN1S1基因相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)；當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，BMECs中CSN3基因相對表達量顯著高于對照組和11.20 mmol/L精氨酸組(P<0.05)。

表5 添加不同濃度的精氨酸對BMECs酪蛋白基因相對表達量的影響

2.5 添加不同濃度的精氨酸對BMECs中mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達量的影響

由表6可知，當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，BMECs中AKT、S6K1基因相對表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)；2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中mTOR、4EBP1基因相對表達量顯著高于對照組和11.20 mmol/L精氨酸組(P<0.05)，5.60 mmol/L精氨酸組BMECs中mTOR、4EBP1基因相對表達量有高于對照組的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；2.80和5.60 mmol/L精氨酸組BMECs中eIF4E基因相對表達量顯著高于1.40和11.20 mmol/L精氨酸組(P<0.05)；各精氨酸組BMECs中PI3K基因相對表達量差異不顯著(P>0.05)。

表6 添加不同濃度的精氨酸對BMECs中mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達量的影響

2.6 添加不同濃度的精氨酸對BMECs酪蛋白表達量及mTOR信號通路蛋白磷酸化水平的影響

由圖1可知，當(dāng)精氨酸的濃度為1.40和2.80 mmol/L時，BMECs中S6K蛋白磷酸化水平和αs1-酪蛋白表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組(P<0.05)，11.20 mmol/L精氨酸組BMECs中S6K蛋白磷酸化水平和αs1-酪蛋白表達量顯著低于對照組(P<0.05)；當(dāng)精氨酸的濃度為1.40、2.80、5.60和11.20 mmol/L時，BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平顯著高于對照組(P<0.05)，以2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平最高。

mTOR:動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamyein；p-mTOR：磷酸化動物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylation of mammalian target of rapamyein；S6K：核糖體蛋白S6激酶 ribosomal protein S6 kinase；p-S6K：磷酸化核糖體蛋白S6激酶 phosphorylation of ribosomal protein S6 kinase；CSN1S1：αs1-酪蛋白 αs1-casein；β-actin：β-肌動蛋白。

3 討 論

3.1 精氨酸對BMECs增殖的影響

動物體內(nèi)細胞生長、增殖過程需要多種營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、微量元素和無機鹽。這些營養(yǎng)物質(zhì)同樣對于體外培養(yǎng)的BMECs增殖、分化和乳成分的合成是必不可少的[17]。羅海吉等[18]指出，精氨酸影響B(tài)MECs增殖的機理可能是由于精氨酸作為一種營養(yǎng)素是細胞增殖分化所需的底物。此外，精氨酸還對體內(nèi)一氧化氮、肌酸和多胺等物質(zhì)的合成具有功能性調(diào)節(jié)作用。精氨酸通過一系列酶的作用最終生成多胺，其具有促進細胞增殖、調(diào)控細胞生長和促進蛋白質(zhì)沉積等多重作用[19-21]。本試驗結(jié)果表明，當(dāng)精氨酸濃度為2.80 mmol/L時顯著提高了BMECs的增殖率，同時發(fā)現(xiàn)2.80 mmol/L精氨酸同樣上調(diào)了BMECs中精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶的活性及其酶的基因相對表達量，這可能是由于其激活了精氨酸-鳥氨酸-多胺代謝通路，導(dǎo)致多胺生成，進而促進細胞的增殖。但在達到最適濃度后，隨著精氨酸濃度的增加，BMECs的增殖率呈下降趨勢，其原因可能是精氨酸轉(zhuǎn)化生成大量的一氧化氮，而高濃度的一氧化氮可以抑制細胞增殖[12]。

3.2 精氨酸通過精氨酸代謝途徑對BMECs酪蛋白合成的影響

研究發(fā)現(xiàn)，泌乳動物乳腺產(chǎn)出乳蛋白中的精氨酸含量遠遠低于乳腺對血液中游離的精氨酸的需要量[3]，主要由于精氨酸作為一種功能性氨基酸，其在作為蛋白質(zhì)合成前體物的同時，還可以在動物乳腺組織通過精氨酸代謝途徑對乳蛋白的合成發(fā)揮功能性調(diào)節(jié)作用。精氨酸在動物乳腺組織中可以通過精氨酸-鳥氨酸途徑發(fā)生分解代謝反應(yīng)，其中精氨酸酶是促進精氨酸轉(zhuǎn)化生成鳥氨酸的重要反應(yīng)酶，鳥氨酸脫羧酶是鳥氨酸進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟返闹匾磻?yīng)酶，多胺可以促進細胞的增殖、蛋白質(zhì)合成。丁洛陽[22]試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BMECs中精氨酸-鳥氨酸-多胺代謝通路受到抑制后，BMECs的增殖率、細胞中酪蛋白合成受到顯著抑制，表明精氨酸-鳥氨酸-多胺可能是調(diào)控酪蛋白合成的關(guān)鍵代謝通路。Folley等[23]測定了處于不同泌乳時期大鼠乳腺組織中精氨酸酶活性和乳蛋白含量，分析得出精氨酸酶活性與大鼠乳蛋白合成量存在正相關(guān)，且Yip等[24]在精氨酸對小鼠乳腺蛋白質(zhì)合成的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似規(guī)律。Oka等[25]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛乳腺組織中精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活性在泌乳期階段顯著上升，并導(dǎo)致乳腺組織中多胺類物質(zhì)生成增多，從而促進乳蛋白的合成。本試驗結(jié)果表明，2.80 mmol/L精氨酸顯著上調(diào)了BMECs中精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶的活性及其酶的基因相對表達量。此外，與對照組相比，2.80 mmol/L精氨酸顯著上調(diào)了CSN1S1和CSN3的基因相對表達量，1.40和2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中αs1-酪蛋白表達量顯著高于對照組和其他精氨酸組，且以2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中αs1-酪蛋白表達量最高。這可能一方面是因為此濃度顯著提高了BMECs的增殖率，BMECs數(shù)量在一定程度上代表著泌乳奶牛的乳汁分泌量及合成乳蛋白的能力；另一方面，本試驗發(fā)現(xiàn)2.80 mmoL/L精氨酸顯著上調(diào)了BMECs精氨酸-鳥氨酸-多胺代謝途徑中精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶的活性和相應(yīng)酶的基因相對表達量，從而催化生成多胺類物質(zhì)(亞精胺、腐胺)，而促進蛋白質(zhì)在體內(nèi)合成的前體物——多胺類物質(zhì)[6]。

3.3 精氨酸通過mTOR信號通路對BMECs酪蛋白合成的影響

氨基酸不僅作為乳蛋白合成的原料底物，還可以作為細胞信號物質(zhì)介導(dǎo)胞內(nèi)外信息傳遞、調(diào)控細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及蛋白磷酸化修飾等生物學(xué)過程，而這些過程可以在生物體內(nèi)任何一步發(fā)生[26]。研究表明，mTOR信號通路是影響乳蛋白合成的關(guān)鍵通路[27]。在氨基酸的影響下，mTOR信號通路可以級聯(lián)調(diào)控下游的2個靶蛋白——S6K1和4EBP1，進而調(diào)控乳蛋白合成翻譯過程。S6K1可以被多種外源信號刺激，在哺乳動物細胞中發(fā)生磷酸化，而被mTOR磷酸化的S6K1活性可以上升近百倍。前人研究發(fā)現(xiàn)，mTOR可以直接通過P-S6K(Thr389)位點發(fā)生磷酸化或間接改變磷酸酶活性來完成[28]。趙艷麗等[29]向體外培養(yǎng)的BMECs中添加0.39～0.52 mmol/L的蛋氨酸顯著提高了mTOR信號通路中mTOR和S6K1的蛋白磷酸化水平，并且在0.52 mmol/L水平下，酪蛋白編碼基因CSN1S1、CSN2和CSN3的基因相對表達量也顯著提高。王珊珊[30]研究表明，與對照組相比(不添加組氨酸)，添加組氨酸(0.15～9.60 mmol/L)的BMECs顯著提高了mTOR、4EBP1和S6K1的蛋白磷酸化水平。Zhao等[31]研究表明，將1.8 mmol/L亮氨酸添加到BMECs培養(yǎng)液可以顯著提高mTOR、4EBP1和S6K基因相對表達量及蛋白磷酸化水平，同時促進了酪蛋白的合成。Zhang等[32]給荷斯坦奶牛靜脈注射精氨酸后，發(fā)現(xiàn)其顯著提高了奶牛乳中的酪蛋白含量和乳中酪蛋白基因相對表達量。此外，周剛[33]向奶牛陰外動脈注射了556 mg/L精氨酸，與不添加精氨酸組相比，顯著提高了奶牛乳腺組織中mTOR、4EBP1和S6K1的基因相對表達量，并且顯著提高了奶牛泌乳量及乳蛋白合成率。本試驗結(jié)果表明，2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中AKT、mTOR、S6K1、4EBP1和eIF4E的基因相對表達量最高，且當(dāng)培養(yǎng)基中精氨酸的濃度為1.40和2.80 mmol/L時，BMECs中S6K蛋白磷酸化水平顯著高于對照組和其他精氨酸組；當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平顯著高于對照組和其他精氨酸組，且以2.80 mmol/L精氨酸組BMECs中mTOR蛋白磷酸化水平最高。本試驗發(fā)現(xiàn)，2.80 mmol/L精氨酸顯著上調(diào)了BMECs中CSN1S1、CSN3的基因相對表達量和αs1-酪蛋白表達量，這說明mTOR信號通路是參與酪蛋白調(diào)控的重要通路，且適宜濃度的精氨酸可能通過mTOR信號通路激活其下游信號分子S6K磷酸化進而調(diào)控BMECs酪蛋白的合成。

4 結(jié) 論

當(dāng)精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，顯著促進了BMECs的相對增殖率、酪蛋白基因相對表達量及蛋白表達量、mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達量及蛋白磷酸化水平；當(dāng)精氨酸的濃度為2.80和5.60 mmol/L時，顯著促進了精氨酸酶和鳥氨酸脫羧酶活性及基因相對表達量，以2.80 mmol/L精氨酸組最高。綜上所述，當(dāng)培養(yǎng)基中精氨酸的濃度為2.80 mmol/L時，對BMECs酪蛋白合成的促進效果最佳。