葉仕杰 鄧向飛 江天瑞 楊春蕾

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，杭州 310014)

作為一種天然的瘤胃微生物代謝產(chǎn)物，共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一系列具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的位置和幾何異構(gòu)體的混合物，主要來(lái)源于瘤胃丁酸弧菌對(duì)亞油酸的生物轉(zhuǎn)化作用[1]。飼糧組成、瘤胃pH和微生物群落活力是影響反芻動(dòng)物瘤胃CLA合成的重要因素[2]。在人類等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究中，已充分證明CLA由于與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)配體具有高度的相似性，可以通過(guò)激活PPAR調(diào)控機(jī)體代謝和免疫穩(wěn)態(tài)。PPAR屬于核受體亞家族中的成員，通常表達(dá)于腸道、巨噬細(xì)胞和白色脂肪等組織，在炎癥發(fā)生、脂質(zhì)和碳水化合物代謝、細(xì)胞周期等多種信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。但是，CLA有益作用的發(fā)揮常存在一定的爭(zhēng)議性，且具有物種、組織和細(xì)胞類型特異性[4-6]。瘤胃作為反芻動(dòng)物最重要的消化器官，其免疫穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康和生產(chǎn)力的提高至關(guān)重要。瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒素或組胺等有害物質(zhì)的釋放增加，刺激瘤胃上皮后導(dǎo)致上皮通透性增加，緊密連接破壞，自我修復(fù)能力減弱，屏障功能受損。瘤胃上皮屏障功能損傷后會(huì)導(dǎo)致瘤胃內(nèi)毒素等有害物質(zhì)易位入血，最終引發(fā)全身性病理反應(yīng)[7]。目前，CLA在反芻動(dòng)物上的應(yīng)用主要集中于關(guān)注能量平衡、乳脂合成等方面[8-9]，其在瘤胃上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)維持方面的報(bào)道還較少。因此，本文以反芻動(dòng)物瘤胃上皮屏障功能損傷的危害為切入點(diǎn)，總結(jié)CLA調(diào)控瘤胃上皮屏障功能的可能生物學(xué)機(jī)制，為其在反芻動(dòng)物健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 反芻動(dòng)物瘤胃上皮屏障功能損傷的危害

反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，常使用高谷物飼糧來(lái)滿足高產(chǎn)奶量的能量需求。因此，在奶牛生產(chǎn)實(shí)踐中，瘤胃酸中毒尤其是亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)時(shí)有發(fā)生[10]。SARA會(huì)導(dǎo)致有毒和有害物質(zhì)如乳酸、乙醇、組胺、酪胺、色胺和細(xì)菌內(nèi)毒素[如脂多糖(LPS)]等的釋放增加[11]。LPS可以造成消化道上皮組織的損傷和通透性改變，進(jìn)而易位進(jìn)入血液中。血液循環(huán)中LPS含量的升高會(huì)引起全身性免疫反應(yīng)，包括增加血液中性粒細(xì)胞和急性期蛋白如血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)、觸珠蛋白(haptoglobin，Hp)、LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)的濃度，刺激單核吞噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥細(xì)胞因子等[12]。易位入血的LPS亦會(huì)導(dǎo)致代謝穩(wěn)態(tài)的改變，表現(xiàn)為血糖和非酯化脂肪酸濃度的升高，動(dòng)物采食量的下降[13-14]。細(xì)菌免疫原還會(huì)導(dǎo)致乳合成所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)減少，抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖和功能(脂肪酸的從頭合成和吸收等)，增加活性氧釋放，造成氧化應(yīng)激損傷[15]。研究表明，瘤胃LPS和血漿急性期蛋白濃度的增加與乳脂含量和產(chǎn)量、3.5%脂肪校正乳產(chǎn)量以及乳能量效率的下降密切相關(guān)[16]。

2 CLA調(diào)控瘤胃上皮屏障功能的生物學(xué)機(jī)制

2.1 通過(guò)緩解瘤胃上皮炎癥發(fā)生調(diào)控瘤胃上皮屏障功能

研究證實(shí)瘤胃上皮炎癥發(fā)生與屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞密切相關(guān)[17]。因此，通過(guò)緩解瘤胃上皮炎癥發(fā)生是保護(hù)屏障功能的重要舉措之一。Bayat等[18]和Gnott等[19]發(fā)現(xiàn)CLA的添加可以減少奶牛泌乳早期和晚期血液促炎因子和活性氧代謝物生成，具有降低全身性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激發(fā)生的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用。但目前CLA在緩解瘤胃上皮炎癥發(fā)生中的特異性作用報(bào)道還較少。本研究團(tuán)隊(duì)用cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA混合物(1∶1)預(yù)處理瘤胃上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，瘤胃上皮細(xì)胞可以抵抗LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子基因(如IL-6和TNF-α)的表達(dá)上調(diào)；基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，此CLA混合物抑制了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體(extracellular matrix receptor，ECM-receptor)相互作用途徑等與炎癥發(fā)生相關(guān)的分子信號(hào)通路，而上調(diào)了PPAR信號(hào)通路[20]。通過(guò)分別研究cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA的單獨(dú)作用，發(fā)現(xiàn)trans-10,cis-12-CLA的抗炎效果較cis-9,trans-11-CLA更好，cis-9,trans-11-CLA單獨(dú)作用時(shí)，并沒(méi)有顯著下調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞受LPS刺激時(shí)IL-6和NF-κB的表達(dá)，而trans-10,cis-12-CLA的單獨(dú)處理顯著下調(diào)了IL-6和NF-κB的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步揭示trans-10,cis-12-CLA顯著下調(diào)了NF-κB、趨化因子和NOD樣受體(NOD-like receptor)等炎癥發(fā)生信號(hào)通路[21]。研究發(fā)現(xiàn)trans-10,cis-12-CLA亦可通過(guò)下調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞病原體識(shí)別受體如Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)的表達(dá)來(lái)抑制LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[21]。CLA在抗炎作用中的同分異構(gòu)體特異性亦被諸多試驗(yàn)證明。Jaudszus等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與trans-10,cis-12-CLA相比，cis-9,trans-11-CLA在人支氣管上皮細(xì)胞的炎癥發(fā)生中表現(xiàn)出更好的抗炎效果。而Dipasquale等[23]研究發(fā)現(xiàn)，分別用cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA預(yù)處理牛乳腺上皮細(xì)胞后，trans-10,cis-12-CLA預(yù)處理的牛乳腺上皮細(xì)胞在受到LPS刺激后表現(xiàn)出更好的抗炎效果，對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的下調(diào)作用更加均一化，且顯著上調(diào)了PPARγ的表達(dá)。因此，CLA可以通過(guò)降低有害抗原刺激瘤胃上皮時(shí)炎癥因子的生成來(lái)維持上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 通過(guò)調(diào)控瘤胃上皮損傷修復(fù)維持瘤胃上皮屏障功能

瘤胃上皮屏障功能主要由完整的上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接來(lái)維持[24]。研究發(fā)現(xiàn)諸多細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和細(xì)菌毒素能夠通過(guò)不同的信號(hào)途徑作用于胃腸道上皮細(xì)胞或細(xì)胞間緊密連接，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞間緊密連接的表達(dá)和分布，調(diào)控細(xì)胞骨架重組，使得上皮屏障通透性增加，進(jìn)而引發(fā)胃腸道繼發(fā)性損傷和功能紊亂[25]。上皮屏障損傷后會(huì)啟動(dòng)快速修復(fù)程序，上皮細(xì)胞的增殖、分化和移行在其中發(fā)揮重要作用[26]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，用cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA的混合物(1∶1)預(yù)處理瘤胃上皮細(xì)胞后，可以顯著增加瘤胃上皮細(xì)胞受LPS刺激時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7(fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)、表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin，EREG)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin，AREG)和肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(heparin-binding epidermal growth factor，HBEGF)表達(dá)量，同時(shí)顯著上調(diào)了與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的ErbB信號(hào)通路[20]，因此CLA可能通過(guò)促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞損傷后的增殖和移行緩解瘤胃上皮屏障損傷。Rahbar等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，CLA的添加能夠增加泌乳奶牛血液胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)含量，而IGF-1具有促進(jìn)瘤胃上皮增殖的作用[28]。CLA的這種促細(xì)胞生長(zhǎng)分化作用亦被一些其他研究證明。Della Casa等[29]發(fā)現(xiàn)cis-9,trans-11-CLA可以促進(jìn)小鼠肌肉細(xì)胞分化。Lampen等[30]發(fā)現(xiàn)cis-9,trans-11-CLA能夠誘導(dǎo)人腸道細(xì)胞Caco-2的分化。但是也有研究發(fā)現(xiàn)CLA異構(gòu)體可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖來(lái)緩解癌癥進(jìn)展[31]。因此，CLA調(diào)控瘤胃上皮屏障功能損傷修復(fù)的機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 通過(guò)調(diào)控炎癥性脂質(zhì)介質(zhì)生成緩解瘤胃上皮屏障功能損傷

研究證明動(dòng)物機(jī)體脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)在多層面互相協(xié)調(diào)[32]。Kalucka等[33]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脂肪酸氧化作用的缺失會(huì)通過(guò)增加氧化應(yīng)激發(fā)生，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)皮屏障功能損傷。CLA通過(guò)調(diào)控反芻動(dòng)物脂質(zhì)代謝和能量分配進(jìn)而影響機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的作用已被證實(shí)[18-19]。Masur等[34]研究發(fā)現(xiàn)，CLA的添加可以增加瘤胃上皮細(xì)胞脂肪酸代謝通路關(guān)鍵調(diào)控因子PPARα的表達(dá)，而PPAR信號(hào)通路的激活能夠抑制炎癥因子表達(dá)。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA的單獨(dú)或共同添加均能顯著上調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞中脂肪酸氧化功能關(guān)鍵基因肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1A(carnitine acyl transferase 1A，CPT1A)的表達(dá)，并且基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction，PPI)分析發(fā)現(xiàn)瘤胃上皮細(xì)胞中CPT1A的表達(dá)量與促炎細(xì)胞因子的生成緊密相關(guān)[20-21]。Jung等[35]亦發(fā)現(xiàn)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine acyl transferase 1，CPT1)表達(dá)的上調(diào)可以緩解脂質(zhì)介質(zhì)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。此外，CLA異構(gòu)體還能影響其他一些炎癥性脂質(zhì)介質(zhì)代謝通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)。例如，cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA(1∶1)的混合添加可以增加瘤胃上皮細(xì)胞中脂解活化因子自水解酶結(jié)構(gòu)域5(abhydrolase domain containing 5，ABHD5)和血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)的表達(dá)[20]。Lord等[36]發(fā)現(xiàn)ABHD5在緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，ABHD5的缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)多積累，激活巨噬細(xì)胞NOD樣受體家族pyrin域3(NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體分泌白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，上調(diào)IL-1β-細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)-叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)-IL-1β反饋回路，促進(jìn)慢性炎癥發(fā)生[37]。Phua等[38]發(fā)現(xiàn)ANGPTL4能夠通過(guò)調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞趨化因子信號(hào)通路降低結(jié)腸炎癥發(fā)生。但是，當(dāng)cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA單獨(dú)作用于瘤胃上皮細(xì)胞時(shí)，對(duì)于脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用亦會(huì)表現(xiàn)出一定的同分異構(gòu)體特異性。例如，Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，trans-10,cis-12-CLA降低了瘤胃上皮細(xì)胞受LPS刺激時(shí)脂質(zhì)合成基因硬脂酰CoA去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)和脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2，F(xiàn)ADS2)的表達(dá)，而cis-9,trans-11-CLA呈現(xiàn)出相反的作用，這可能與合成的脂肪酸類型(飽和或不飽和)有關(guān)。Masur等[34]研究卻發(fā)現(xiàn)cis-9,trans-11-CLA或trans-10,cis-12-CLA的單獨(dú)作用均下調(diào)了正常瘤胃上皮細(xì)胞SCD的表達(dá)。這種CLA對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控作用的同分異構(gòu)體特異性在其他物種的研究中也有體現(xiàn)。Della Casa等[29]發(fā)現(xiàn)trans-10,cis-12-CLA有效減少了小鼠脂肪組織中的脂肪量，而cis-9,trans-11-CLA沒(méi)有此作用。Evans等[39]等亦報(bào)道了CLA調(diào)控肥胖與脂質(zhì)代謝的同分異構(gòu)體特異性。

2.4 通過(guò)調(diào)節(jié)瘤胃微生態(tài)維持瘤胃上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)

瘤胃微生物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)與宿主互作維持和調(diào)控瘤胃上皮結(jié)構(gòu)完整性和屏障功能的作用已被大量研究證實(shí)[40]。Yusuf等[41]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)CLA含量的增加與纖維分解菌白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黃化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)豐富度的增加存在明顯正相關(guān)。Pitta等[42]研究亦發(fā)現(xiàn)瘤胃trans-10,cis-12-CLA含量與丁酸生成菌丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)豐富度顯著正相關(guān)。乙酸、丁酸等有益微生物代謝產(chǎn)物一方面能夠?yàn)榱鑫干掀ど泶x提供能量來(lái)源，另一方面可以通過(guò)調(diào)節(jié)瘤胃上皮細(xì)胞膜蛋白受體如G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控瘤胃上皮緊密連接蛋白表達(dá)或上皮組織免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)等來(lái)維持上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)[43]。CLA通過(guò)增加益生菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphilia)與丁酸生成菌Butyrivibrio、羅氏菌屬(Roseburia)和乳桿菌屬(Lactobacillus)豐富度，提高短鏈脂肪酸生成，來(lái)維持腸道內(nèi)環(huán)境和屏障功能穩(wěn)態(tài)，緩解腸道炎癥損傷的作用亦在小鼠研究中得到證實(shí)[44-45]。因此，CLA可能通過(guò)改善瘤胃微生態(tài)環(huán)境，增加微生物有益代謝產(chǎn)物生成來(lái)維持上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 小 結(jié)

瘤胃上皮屏障功能穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于反芻動(dòng)物健康至關(guān)重要。研究證實(shí)瘤胃內(nèi)代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致LPS等細(xì)菌內(nèi)毒素或有害物質(zhì)的釋放增加，進(jìn)而引起瘤胃上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接受損，造成上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)素吸收率下降、通透性增加、屏障功能損傷、細(xì)菌毒素易位入血等，最終引起全身性病理反應(yīng)發(fā)生，給動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體健康帶來(lái)危害。CLA作為營(yíng)養(yǎng)源保護(hù)胃腸道免疫，緩解腸道上皮屏障功能損傷的研究已在人類等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大量被研究。作為瘤胃天然代謝產(chǎn)物，CLA對(duì)瘤胃上皮屏障功能的調(diào)控作用尚缺乏強(qiáng)有力證據(jù)，僅有少量報(bào)道證實(shí)其能夠通過(guò)降低炎癥反應(yīng)、促進(jìn)上皮屏障功能損傷修復(fù)、調(diào)控炎癥性脂質(zhì)介質(zhì)代謝和瘤胃微生態(tài)來(lái)保護(hù)瘤胃上皮屏障功能，更深層次的作用機(jī)制尚未明確(圖1)。因此，CLA如何維持瘤胃上皮屏障功能的機(jī)制仍需更深入的研究，為其在反芻動(dòng)物健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

RECs：瘤胃上皮細(xì)胞 rumen epithelial cells；LPS：脂多糖 lipopolysaccharide；CLA：共軛亞油酸conjugated linoleic acid；TLR4：Toll樣受體4 Toll-like receptor 4；NOD-like receptors：NOD樣受體 nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors；PPAR：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 peroxisome proliferator-activated receptor；Rumen microbiota：瘤胃微生物；Metabolite：代謝物；Inflammatory response signaling pathway：炎癥反應(yīng)信號(hào)通路；Inflammation：炎癥；Fatty acid oxidation：脂肪酸氧化；Saturated or unsaturated fatty acid synthesis：飽和或不飽和脂肪酸合成；Hemidesmosome：半橋粒；Desmosome：橋粒；Tight junction：緊密連接；Adherens junction：黏合連接；Gap junction：間隙連接。