馮春雷，魯丁強,2,*，龐廣昌,2,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

牛奶及乳制品中包含多種來源的雌激素，例如奶牛產(chǎn)奶過程分泌的雌激素、奶牛飼養(yǎng)過程中人為添加的激素藥物等。當環(huán)境、水體、食品中雌激素超過一定限值時，雌激素可能經(jīng)食物鏈在人體中富集，影響人體健康。雌激素具有親脂性，更易在動物源食品中殘留，可能導(dǎo)致乳制品等食品中的雌激素水平超標。長期攝入這類乳制品或食品會造成大量外源性雌激素進入人體，并在體內(nèi)不斷累積，可能危害人體健康，因此乳制品中雌激素的分析檢測十分重要。目前針對乳制品中雌激素的檢測方法主要有色譜法、光譜法、免疫法和生物檢測法等，其中生物檢測法既能滿足復(fù)雜食品基質(zhì)中雌激素的檢測，又能彌補傳統(tǒng)大型儀器檢測和免疫法檢測的不足，在乳制品雌激素檢測中具有重要作用。

大量實驗發(fā)現(xiàn)，雌激素與G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G-protein coupled estrogen receptor，GPER）互相作用，傳遞快速非基因組學(xué)信號，從而發(fā)揮多種類型的生物學(xué)效應(yīng)，但目前通過膜受體GPER介導(dǎo)的雌激素干擾效應(yīng)鮮有報道。關(guān)于GPER的研究多集中在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，在食品安全檢測領(lǐng)域的報道很少。食品安全檢測領(lǐng)域的GPER研究涉及到雌激素受體（estrogen receptor，ER）、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）的應(yīng)用。本文以GPER在乳制品雌激素檢測中的應(yīng)用潛力為中心，闡述GPER與雌激素以及乳制品中雌激素檢測的關(guān)系，重點介紹基于雌激素信號通路的生物檢測方法的研究進展。

1 乳制品中的雌激素

1.1 乳制品中雌激素的檢測

1.1.1 乳制品中雌激素檢測的意義

隨著人們生活質(zhì)量的提高，含有豐富的鈣、維生素、蛋白質(zhì)的乳制品逐漸成為人們生活中不可缺少的食物，乳制品市場快速發(fā)展。乳制品加工工藝的各階段都可能受到化學(xué)污染物的污染，尤其是類固醇激素的污染，其通過食物鏈被人體攝入并不斷積累后會影響人體健康，例如殘留的雌激素會對人體的生殖器官、肝臟有一定的損害作用，也可能誘發(fā)癌癥。有研究表明牛奶中含有相對較高水平的雌激素和孕酮代謝物，尤其是來自懷孕奶牛的代謝物，這些物質(zhì)可能會增加患乳腺癌的風(fēng)險。此外，存在于牛奶及乳制品中的己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）可能誘發(fā)兒童性早熟、子宮癌以及男性女性化，存在于乳及乳制品外包裝中的雌激素雙酚A（bisphenol A，BPA）會損害人體生育能力，其可能引起女性反復(fù)流產(chǎn)或早產(chǎn)和男性精液質(zhì)量下降、精子DNA損傷。因此，乳制品中雌激素的檢測具有重要的意義。

1.1.2 乳制品中雌激素的來源和種類

乳制品中偶爾出現(xiàn)高含量的天然雌激素，以及在乳制品行業(yè)中濫用或非法使用合成雌激素的情況令人擔(dān)憂。天然雌激素、合成雌激素及其代謝物和其他具有雌激素活性的化合物的攝入與人體許多生殖系統(tǒng)疾病甚至癌癥相關(guān)。有研究表明人類飲食中過量的雌激素會導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，甚至導(dǎo)致激素依賴性器官（如乳房、卵巢、前列腺和睪丸）產(chǎn)生癌變。由于乳制品行業(yè)的商業(yè)化需求，奶牛在懷孕期間仍對其進行擠奶作業(yè)，以提高奶牛產(chǎn)奶量，而這一時期的天然雌激素水平非常高，可達其妊娠前幾周雌激素水平的近20 倍。在這樣的條件下，雌激素可能通過乳腺進入乳汁，而巴氏殺菌也不能消除雌激素活性。先前研究發(fā)現(xiàn)人體對牛奶和奶制品中雌酮（estrone，E1）攝入量占人體總E1攝入量的60%～70%，這表明其余的天然雌激素攝入可能也是如此。全球每年消耗近7 108 t牛奶，并且還不包含其他乳制品（如奶酪、酸奶、奶油等），所有這些乳制品通常具有高含量的脂肪，有利于親脂性天然或合成雌激素的存在，并且這些雌激素通常不能在生產(chǎn)過程中去除。Bárbara等已證明內(nèi)源性雌激素E1、雌二醇（estradiol，E2）或雌三醇（esrtiol，E3）等存在于牛奶及其相關(guān)乳制品中。此外，外源性雌激素也被用于動物育肥，盡管現(xiàn)在這種用途在大多數(shù)國家被禁止，但仍有違規(guī)使用外源性雌激素的食品安全事件發(fā)生，因此外源雌激素殘留物可能存在于牛奶及乳制品中。Meng Mei等發(fā)現(xiàn)大量具有雌激素活性的外源雌激素被用作牛的生長促進劑，如二烯雌酚、己雌酚或DES等。還有研究發(fā)現(xiàn)一種存在于谷類作物的真菌雌激素——玉米赤霉烯酮也屬于外源雌激素，它能提高飼料轉(zhuǎn)化效率和促進牲畜的生長率，這些外源性雌激素極可能殘留在牛奶及乳制品中。其他具有雌激素活性的植物雌激素分為異黃酮類（如大豆苷元、染料木黃酮等）、木脂素類（如腸內(nèi)醇、腸二醇等）、香豆素類（如香豆雌酚等）等。研究表明存在于牛飼料中的植物雌激素在奶牛瘤胃中部分代謝，被腸道吸收后一小部分植物雌激素轉(zhuǎn)移到牛奶中，因此飲用牛奶時也同時攝入了其中的植物雌激素。植物雌激素可以預(yù)防人體某些癌癥或骨質(zhì)疏松癥，但其也可能對人體健康產(chǎn)生負面影響，例如，植物雌激素可能干擾類固醇激素代謝。

總之，乳制品雌激素的種類大致有兩種：一是奶牛在產(chǎn)奶過程中自身分泌的天然雌激素，天然雌激素是動物和人體內(nèi)天然存在的雌激素，一般指E1、E2和E3，其中以E2作用最強，E2的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有生物難降解性和脂溶性，易在生物體內(nèi)富集，對個體層面的危害主要包括誘發(fā)高血壓、冠心病和致癌作用，臨床基礎(chǔ)研究表明E2可大大提高婦科腫瘤的發(fā)病率，也可通過胎盤對嬰兒產(chǎn)生先天致癌作用，還會對生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用；二是外源性添加的，主要包括人為添加的激素，如對不孕奶牛注射含激素的催奶液，或把外源性雌激素用作動物飼料添加劑，又或者使用含有真菌雌激素的飼料喂養(yǎng)奶牛。外源性添加的雌激素會干擾生物體自身雌激素的合成、分泌、結(jié)合、代謝、消解或產(chǎn)生類似生物體自身雌激素的作用，會對生物正常的雌激素動態(tài)平衡、繁殖、生長產(chǎn)生不利的影響。乳制品中不同雌激素的來源與種類如表1所示。

表1 乳制品中不同雌激素的來源與種類[29]Table 1 Sources and kinds of estrogen in dairy products[29]

1.1.3 乳制品中激素檢測存在的問題

乳制品是人們廣泛消費的一種重要的食品。由于牛奶和乳制品中雌激素類化合物具有雌激素效應(yīng)，人們對乳制品中雌激素的檢測越來越重視，但因為乳制品的復(fù)雜性，相比簡單樣本基質(zhì)（例如水樣），乳制品中雌激素類化合物的分析還未得到廣泛應(yīng)用，盡管少數(shù)研究分析了奶酪樣品中的天然和合成雌激素。

此外，歐洲關(guān)于使用激素作為動物生長促進劑的法規(guī)中，修正指令表示禁止將具有激素活性的物質(zhì)用于家畜育肥，以確保歐盟范圍內(nèi)的居民健康得到保障。盡管有這樣的立法，但對乳制品中的雌激素類化合物未規(guī)定具體的最大殘留限量，激素類物質(zhì)仍有可能被濫用。有研究表明BPA等外源性雌激素會從包裝材料遷移到牛奶或乳制品中，盡管許多研究報告稱人類食用的牛奶中含有BPA，但關(guān)于乳制品中BPA含量和污染途徑的研究數(shù)據(jù)很少。此外，目前乳制品中雌激素的檢測標準也存在較多問題，如雌激素種類涵蓋范圍較窄、檢測方法不新穎、樣品處理方法復(fù)雜、無法針對新的雌激素結(jié)構(gòu)類似物或其代謝物進行檢測等。

1.2 雌激素通過GPER受體傳遞信號

1.2.1 雌激素受體

雌激素通過ER和GPER分別介導(dǎo)的基因組途徑和非基因組途徑來發(fā)揮生理功能（圖1）。雌激素發(fā)揮其生理功能的經(jīng)典基因組學(xué)途徑是與ER結(jié)合，ER隨即形成ER二聚體，之后與靶基因啟動子序列內(nèi)的雌激素應(yīng)答元件（estrogen response element，ERE）結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因表達。非基因組途徑是由GPER介導(dǎo)的快速信號途徑，該途徑包括環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、鈣離子（Ca）途徑等，其中主要途徑為打開或關(guān)閉Ca離子通道來快速控制神經(jīng)、內(nèi)分泌應(yīng)答。隨著在體外和臨床研究中發(fā)現(xiàn)選擇性調(diào)節(jié)GPER功能的配體，以及基因敲除小鼠的應(yīng)用，GPER的更多潛在作用引起研究者的廣泛關(guān)注。

圖1 非基因組學(xué)和基因組學(xué)雌激素信號通路Fig. 1 Non-genomic and genomic estrogen signaling pathways

基因組學(xué)途徑和非基因組學(xué)途徑被雌激素激活，通過細胞核內(nèi)控制眾多基因轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯、加工和轉(zhuǎn)運或通過控制離子通道開關(guān)來產(chǎn)生一系列與代謝調(diào)節(jié)組織相關(guān)的生理影響。例如：染料木素通過調(diào)節(jié)ERβ的表達來發(fā)揮抗癌作用，它可以減少ERβ基因的啟動子甲基化，從而增加ERβ整體表達。香豆雌酚可以上調(diào)ERβ的表達，激活腸內(nèi)ERβ信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡，Williams等已發(fā)現(xiàn)香豆雌酚可減少小鼠的小腸黏膜腫瘤數(shù)量和結(jié)腸腫瘤數(shù)量。雌激素可通過經(jīng)典基因組學(xué)途徑（即結(jié)合ERα或ERβ）或通過非基因組學(xué)途徑來激活MAPK或絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）信號通路促進局部異位組織的生長，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。

1.2.2 與GPER作用的雌激素分類

GPER的配體種類分布廣泛，目前仍處于研究階段。許多作用于ERα或ERβ的配體也可以作用于GPER。目前最廣泛使用的GPER特異性激動劑是G-1。常見的GPER非特異性激動劑包含天然配體E2，據(jù)報道，E2在3～6 nmol/L范圍內(nèi)對GPER有結(jié)合親和力，此外，合成（工業(yè)、農(nóng)業(yè)和藥理學(xué)）和天然（植物和真菌雌激素）的一系列外源雌激素也能作為GPER激動劑發(fā)揮作用，如植物雌激素黃豆苷元、白藜蘆醇、染料木黃酮以及環(huán)境雌激素如塑料制品中常見的BPA及化工原料壬基酚（nonyl phenol，NP）等，值得注意的是，他莫昔芬和雷洛昔芬也是GPER激動劑。GPER的特異性拮抗劑包括G-15和G-36，非特異性拮抗劑包括體內(nèi)雌激素的中間代謝產(chǎn)物2-羥基-17-E2。

2 乳制品中雌激素的檢測方法

過去幾十年以來，相關(guān)研究人員一直致力于開發(fā)更靈敏、更準確的乳制品中雌激素檢測方法。目前乳制品中雌激素檢測的主要手段有色譜法、光譜法和免疫法等，但只適于檢測已知結(jié)構(gòu)的雌激素，而雌激素濃度極低以及雌激素的結(jié)構(gòu)相似性限制了這些方法的應(yīng)用。此外，色譜法需要對樣品進行預(yù)處理，耗費時間較長，同時方法的準確性也會下降，并且色譜法所需儀器價格高，占地面積大，需要專業(yè)人員操作，通常需進行復(fù)雜的洗脫程序，該過程需要大量的有機溶劑和很高的檢測成本。而光譜法，如拉曼光譜分析，雖然是一種強有力的痕量檢測和識別技術(shù)，但其信號穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，耗時長。免疫法根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合對樣品中的雌激素物質(zhì)進行檢測，該方法靈敏度高，成本低，操作簡單，但可檢測物質(zhì)種類有限，并且可能發(fā)生交叉反應(yīng)造成檢測結(jié)果不準確。而以雌激素信號通路為基礎(chǔ)的生物檢測方法可以滿足對乳制品中雌激素及雌激素類化合物的特異性篩選，同時還可以彌補上述方法的不足。

2.1 體內(nèi)實驗和細胞增殖實驗

最早的雌激素生物檢測方法為體內(nèi)實驗，其中子宮營養(yǎng)實驗和肝細胞卵黃蛋白原（vitellogenin，VTG）生成實驗是我國環(huán)境中篩選雌激素及雌激素類似物的常規(guī)方法，后來為了提高對雌激素及雌激素類似物的檢測效率，建立了一種基于雌激素及雌激素類似物對靶細胞增殖影響的細胞增殖實驗（estrogen screen assay，簡稱E-Screen方法）。

子宮營養(yǎng)實驗是一項較為經(jīng)典的用于檢測雌激素活性的體內(nèi)實驗，2001年就出現(xiàn)了以子宮營養(yǎng)實驗作為檢測具有類雌激素功能的內(nèi)分泌干擾物的方法。由于子宮含有豐富的ER并且其功能由女性類固醇激素調(diào)節(jié)，故被用作檢測雌激素的經(jīng)典靶器官。子宮營養(yǎng)實驗通過觀察雌激素和雌激素類化合物對嚙齒類去勢成年雌鼠或幼雌鼠子宮的作用，以兩個指標（子宮濕質(zhì)量和子宮與體質(zhì)量的比率）來衡量。該方法操作簡易方便，但存在耗時長、費用高、重現(xiàn)性較差等缺點。子宮營養(yǎng)實驗被認為是用于評價內(nèi)分泌干擾物的雌激素活性的黃金標準，至今仍被廣泛應(yīng)用，Russo等通過該方法評價乳制品、食品包裝和嬰兒奶瓶等食品或食品器皿中的雌激素，并證實了多種具有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)。黃毅娜等采用該方法證實了BPA具有弱雌激素效應(yīng)。Nielsen等等采用了該方法首次研究了雌馬酚含量高或低的牛奶（分別來自食用紅三葉或苜蓿的奶牛的牛奶）的雌激素活性。Yamasaki等采用該方法測定了NP等23 種化學(xué)物質(zhì)的雌激素效應(yīng)，從中發(fā)現(xiàn)BPA、染料木黃酮等多種化學(xué)物具有弱雌激素活性。

肝細胞VTG生成實驗以VTG作為篩選雌激素和雌激素類似物的標記物，VTG是由卵生脊椎動物鳥類、兩棲類、魚類或爬行類的肝細胞合成的一種蛋白質(zhì)。VTG通常由雌性動物產(chǎn)生，雄性動物體內(nèi)VTG的含量往往很低，但當雄性動物或幼年動物在接觸到低劑量的雌激素和雌激素類似物后會誘導(dǎo)體內(nèi)VTG的生成，故該實驗以VTG作為篩選雌激素和雌激素類似物的標記物。Li Xiaoqi等使用未被環(huán)境雌激素污染的雄性鯽魚中分離的原代肝細胞作為培養(yǎng)模型，以雄性鯽魚原代肝細胞產(chǎn)生的VTG濃度為驗證指標，發(fā)現(xiàn)E2和對苯二甲酸二甲酯均可誘導(dǎo)雄性鯽魚原代肝細胞產(chǎn)生高濃度的VTG。BPA可通過ER介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)雄性魚肝臟中VTG的表達。此外，王宏元等的研究證實NP通過上調(diào)ER而誘導(dǎo)雄性中國林蛙肝細胞合成VTG，并且說明了NP雖然存在明顯的雌激素效應(yīng)但其雌激素活性遠低于E2。

早在1995年，Soto等用源于人乳腺癌的MCF7細胞進行細胞增殖實驗來評價受試物的雌激素活性。用于細胞增殖實驗的細胞株包括大鼠子宮原代細胞，大鼠垂體原代細胞和來源于人乳腺癌的MCF7、T47D細胞等，由于MCF7細胞株對外源性雌激素比較敏感，故用到的也最多。許多研究表明，雌激素和雌激素類化合物與ER互作后可介導(dǎo)乳腺癌細胞的增殖。常艷等分別以增殖力、相對增殖力和相對增殖效應(yīng)3 個指標來評價雌激素化合物活性的強弱，成功地建立了E-Screen方法，并通過該方法可以檢測到1×10mol/L的E2。此外，E-Screen方法可以檢測存在于泥土、水、食物中的具有雌激素活性的外來化合物。董力等通過E-Screen方法發(fā)現(xiàn)多氯聯(lián)苯和E2有明顯刺激MCF-7細胞增殖的類雌激素活性，證實了多氯聯(lián)苯有類雌激素樣活性。Molina-Molina等在MCF-7細胞中使用E-Screen方法證實了玉米赤霉烯酮及其代謝物是ERα的激動劑并評估了它們的雌激素作用。

用于雌激素檢測的體內(nèi)實驗和E-Screen方法各具優(yōu)勢和不足，子宮營養(yǎng)實驗雖然具有高可靠性、操作簡易的優(yōu)點，但其所需時間較長，不適宜大量篩選，并且重現(xiàn)性較差。此外，肝細胞VTG生成實驗具有靈敏度高、操作方便等優(yōu)點，但其應(yīng)用會因為雌性動物體內(nèi)存在天然卵黃而受到一定限制。與上述方法相比，E-Screen方法更為靈敏，通常結(jié)合體內(nèi)實驗確保結(jié)果的可靠性，用MCF7細胞進行細胞增殖實驗所得的檢測結(jié)果可信度較高，因為MCF7細胞來源于人，排除了動物實驗的不確定性，但該方法所需實驗條件、培養(yǎng)基和血清都有特殊要求，因此實驗條件和成本較高。

2.2 生物傳感器

近年來，生物傳感器在環(huán)境和食品中的雌激素檢測方面發(fā)揮著巨大的作用，這主要由于生物傳感器具有高靈敏、分析快、低成本和高度自動化等優(yōu)點。但目前生物傳感器主要用于環(huán)境水樣中的雌激素檢測，很少用于牛奶、蜂蜜等食品基質(zhì)中雌激素的檢測，并且若將檢測雌激素的生物傳感器商業(yè)化，還面臨著從實驗室走向市場后的諸多問題。目前用于檢測乳制品中雌激素的生物傳感器有很多種：電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器、光電化學(xué)（photoelectrochemistry，PEC）生物傳感器、熒光細胞生物傳感器以及其他生物傳感器等。

2.2.1 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器以生物活性物質(zhì)為生物識別元件，加入待測物質(zhì)后，修飾在電極上的生物識別元件會和待測物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致生物識別元件的結(jié)構(gòu)或活性發(fā)生改變，進而通過信號轉(zhuǎn)換器將生物學(xué)變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼W(xué)信號實現(xiàn)對待測物的定量檢測。該方法具有檢測速度快、抗干擾能力強、響應(yīng)好和靈敏度高的特點，被廣泛應(yīng)用。

電化學(xué)生物傳感器根據(jù)生物識別元件的不同又可以分為抗體電化學(xué)生物傳感器、適體電化學(xué)生物傳感器、酶電化學(xué)生物傳感器等。近年來，抗體電化學(xué)生物傳感器被大量開發(fā)用于外源性雌激素的快速檢測。由于免疫反應(yīng)的高特異性和電化學(xué)分析技術(shù)的高靈敏度，基于抗原-抗體特異性結(jié)合的抗體電化學(xué)生物傳感器具有一些優(yōu)點，例如快速和簡單，通常具有良好的靈敏度和選擇性，但存在穩(wěn)定性差等缺點。Pan Guangpin等采用納米效應(yīng)、層間自組裝和抗原-抗體特異性免疫技術(shù)相結(jié)合的設(shè)計策略，成功將己雌酚固定在玻碳電極的表面構(gòu)建了抗體電化學(xué)生物傳感器，該傳感器可同時用于檢測4 種酚類雌激素：己雌酚、DES、二烯雌酚和BPA，檢測限分別為0.25、0.25、0.15、0.2 ng/mL（信噪比為3），并且在對奶粉等實際樣品中的二烯雌酚進行檢測時，該生物傳感器具有實際可行性，結(jié)果良好。此外，由于適體相對穩(wěn)定且易于合成，適體電化學(xué)生物傳感器正日益取代傳統(tǒng)的抗體電化學(xué)生物傳感系統(tǒng)，Ma Yibo等制作了一種基于DNA的電化學(xué)生物傳感器，該生物傳感器對BPA檢測的線性范圍和檢測限分別為1.0×10～1.0×10mol/L和7.2×10mol/L，并且該傳感器能檢測到牛奶中微量的BPA（10～10mol/L），回收率為92%～108%。與抗體生物傳感器和適體生物傳感器相比，酶電化學(xué)生物傳感器在復(fù)雜的食品基質(zhì)或水樣中具有更好的穩(wěn)定性，然而，基于酶作為識別元件的傳感系統(tǒng)具有相對較差的特異性，并且更適合檢測具有雌激素特性的物質(zhì)。Kochana等采用酪氨酸酶被包埋的技術(shù)制作了一種酶電化學(xué)生物傳感器，該生物傳感器可在奶瓶中檢測到BPA，檢測限為6.6 nmol/L。

2.2.2 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器是生物傳感器的一個分支，其原理是利用光（電磁輻射/波）與目標分析物的相互作用來測定目標分析物的濃度，光（電磁輻射/波）與目標分析物相互作用通過吸附、散射（吸收和再發(fā)射光）、折射率變化和熒光來實現(xiàn)對目標分析物的定性以及定量分析。根據(jù)光（電磁輻射/波）與目標分析物相互作用過程中光學(xué)信號的不同，光學(xué)生物傳感器可以分為不同類型：熒光光譜型、化學(xué)發(fā)光光譜型、表面等離子共振光譜（surface plasmon resonance，SPR）型等。

隨著高特異性的分子識別元件與具備優(yōu)異光學(xué)性能的新型納米材料的結(jié)合，熒光生物傳感器在雌激素檢測領(lǐng)域的應(yīng)用潛力備受研究者矚目。Ren Shuyue等開發(fā)了一種熒光生物傳感器用于同時檢測復(fù)雜樣品中的BPA和E2，BPA和E2的檢測限分別為7.8 pg/mL和92 pg/mL，該生物傳感器可用于牛奶樣品中BPA和E2的測定，回收率分別為93.76%～107.12%和87.91%～106.4%，但該方法通常特異性有限，熒光基團易受干擾，在光漂白過程中會失去發(fā)出熒光的能力。此外，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）生物傳感器在雌激素檢測中也具有廣闊的應(yīng)用前景，Zhang Huifang等研制了一種用于檢測飲料樣品中BPA的ECL生物傳感器，待測物中的BPA濃度越高，ECL信號就會越強，該傳感器對BPA檢測的線性范圍為2 pmol/L～50 nmol/L，檢測限為1.5 pmol/L，并且該傳感器可用于牛奶、橙汁和椰汁樣品中BPA的測定，回收率在96%～105%，這表明ECL生物傳感器在檢測實際樣品中BPA方面具有實際應(yīng)用性，結(jié)果良好。雖然ECL生物傳感器具有檢測限較低、應(yīng)用范圍廣、無背景散射光信號等優(yōu)點，但其無法實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測?；赟PR的光學(xué)生物傳感器和新型免疫層析生物傳感器也用于乳制品中雌激素的檢測，Habauzit等基于SPR技術(shù)研制了一種無標記的SPR光學(xué)生物傳感器，以ERα和ERE作為生物識別元件，將其固定在生物芯片的金屬膜上。當受試物中含有雌激素時，雌激素會迅速形成不穩(wěn)定的ER/ERE復(fù)合物，改變ER與ERE之間的相互作用，通過檢測結(jié)合效率和絡(luò)合物穩(wěn)定性的差異來評估雌激素活性。目前，該生物傳感器已應(yīng)用于乳制品等食品包裝中BPA的檢測，檢測限為5.2 pg/mL。Lu Lixia等用光熱材料黑鱗構(gòu)建了一種便攜式的新型免疫層析生物傳感器，該傳感器用黑鱗標記的抗E2的抗體作目標分析物的識別元件，由近紅外光照射黑鱗產(chǎn)生的溫度作輸出信號，在用于牛奶樣品中E2的檢測時該傳感器的檢測限為0.104 ng/mL，該傳感器具有便攜、成本低、操作簡單、測定時間短等優(yōu)點，但穩(wěn)定性有待提高。

2.2.3 光電化學(xué)生物傳感器

PEC生物傳感器被廣泛認為是一種新穎的生物分析技術(shù)，因為與傳統(tǒng)方法相比，生物分子具有更好的固有靈敏度和特定的生物親和性特征。PEC生物傳感器的檢測原理是基于光電活性物質(zhì)的光電轉(zhuǎn)換特性來確定被檢測生物標志物的濃度。在PEC檢測過程中，光被用作激發(fā)信號來激發(fā)光敏物質(zhì)，而電信號被用作檢測信號。因此，PEC分析技術(shù)不僅延續(xù)了電化學(xué)生物傳感器的優(yōu)點，如響應(yīng)速度快、成本低、穩(wěn)定性高等，同時相比各種光學(xué)技術(shù)也具有更高的靈敏度、更簡易的操作等優(yōu)勢，PEC生物傳感器在乳制品等食品中雌激素的檢測中具有巨大的潛在應(yīng)用前景。Du Xiaojiao等把E2適體作為痕量E2分析的識別元件構(gòu)建了一種PEC生物傳感器，在該傳感器的最佳檢測條件下，E2檢測的線性范圍為1×10～1×10mol/L，檢測限為3.3×10mol/L，此外，該生物傳感器對添加不同濃度E2的奶粉樣品進行了測定，回收率為86.96%～102.94%，相對標準偏差為2.3%～7.4%，證明了其在乳制品中雌激素檢測的可行性，然而，PEC生物傳感器仍處于起步階段，其持續(xù)發(fā)展仍面臨諸多挑戰(zhàn)。新型PEC活性材料與生物識別元件結(jié)合建立的新測定體系，將進一步拓展PEC生物傳感方法的應(yīng)用空間。

2.2.4 細胞生物傳感器

基于細胞的生物傳感器是由細胞作為敏感捕捉細胞生理反應(yīng)的傳感元件和傳感器組成的。近年來，隨著熒光分析方法和技術(shù)的進步，眾多報告基因中的熒光素酶和熒光蛋白基因被備受關(guān)注，該技術(shù)結(jié)合迅速發(fā)展的細胞生物傳感器在基于雌激素效應(yīng)途徑的基礎(chǔ)上可實現(xiàn)對乳制品中雌激素的定量測定，該方法具有靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)點。

近年來被廣泛用于雌激素活性篩選的重組酵母測評系統(tǒng)（recombinant yeast estrogen system，RYES）的原理是將哺乳動物ER、ERE和-半乳糖苷酶（）的基因重組于酵母細胞，當待測物具有雌激素樣作用時，會產(chǎn)生依賴于雌激素濃度的可量化信號。在RYES技術(shù)的基礎(chǔ)上，有研究以熒光素酶基因作為報告基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達ERE的重組HeLa細胞株用于檢測食品中雌激素樣物質(zhì)的含量，E2的加標回收率均在75%以上，相對標準偏差為7.3%～11.6%，具有較高的精密度，但由于對熒光素酶的檢測需要預(yù)先對細胞壁進行破壞，故操作步驟比較復(fù)雜；還有研究基于綠色熒光蛋白表達的酵母對雌激素進行快速生物測定，但該方法與商業(yè)化的生物傳感器相比速度較慢，通常需要幾個小時才能完成。熒光細胞生物傳感器不僅可以作為動物源性食品中雌激素活性的快速篩選方法，而且還可用于對牛奶等乳制品中雌激素的測定。

2.2.5 其他的生物傳感器

除了上述生物傳感器用于乳制品中雌激素檢測外，真菌生物傳感器和受體型生物傳感器也被廣泛應(yīng)用。Christoph等開發(fā)并驗證了一種用于檢測雌激素活性的真菌生物傳感器，該傳感器使用絲狀真菌構(gòu)巢曲霉（）的一種經(jīng)工程改造的遺傳修飾菌株，在奶牛所產(chǎn)生的牛奶、尿液和糞便中的雌激素檢測中得以應(yīng)用，與酶免疫分析所得結(jié)果一致，對于17-E2，該生物傳感器顯示的檢測限為1 ng/L，真菌生物傳感器檢測比基于酵母細胞系統(tǒng)更快，后者需要3～4 d才能獲得讀數(shù)。Im等首次將ERα結(jié)合生物傳感器應(yīng)用于雌激素的檢測，該傳感器是通過將ER固定在金電極修飾表面來實現(xiàn)的，通過逐步的電化學(xué)阻抗譜和X射線光電子能譜的測量，發(fā)現(xiàn)在磷酸鹽緩沖液中，將受體修飾電極暴露于10mol/L的雌激素中可以觀察到阻抗的變化。許冰等采用納米金修飾雙層類脂膜（bilayer lipid membrane，BLM）來固定ERα，制成Pt/BLM/Au/ER電極，利用電化學(xué)阻抗法檢測雌激素，當該電極與雌激素結(jié)合后，交流阻抗法測得的阻抗與17-E2質(zhì)量濃度在5～150 ng/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996，檢出限（信噪比為3）為1 ng/L。

2.3 乳制品中雌激素檢測方法的優(yōu)勢及不足

目前乳制品中雌激素檢測的主要手段有色譜法、光譜法和免疫法等，但由于雌激素在極低濃度下存在以及雌激素的結(jié)構(gòu)相似性，這些方法只能檢測出已知結(jié)構(gòu)的雌激素。色譜法檢測精度比較高，但存在如儀器價格高、操作復(fù)雜等缺點，此外，光譜法雖然是一種很好的痕量檢測技術(shù)，但該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，免疫法雖然有更高的檢測效率，但可檢測物質(zhì)種類有限，并且可能還會發(fā)生交叉反應(yīng)造成污染。而基于雌激素效應(yīng)途徑的生物檢測方法可以檢測復(fù)雜基質(zhì)的雌激素活性，彌補了色譜法、光譜法和免疫法的不足，可評價已知和未知物質(zhì)、單一組分或混合物的雌激素效應(yīng)，具有較高的特異性。但該方法在單組分檢測精度方面不如色譜法和免疫法。各檢測方法在檢測乳制品中雌激素殘留方面的應(yīng)用對比如表2所示。

表2 乳制品中雌激素的檢測方法Table 2 Summary of methods used for estrogen detection in dairy products

3 GPER在乳制品雌激素檢測中的應(yīng)用潛力

GPER介導(dǎo)快速非基因組學(xué)途徑，雌激素與GPER識別、變構(gòu)，將此變構(gòu)作用聯(lián)動到胞內(nèi)與G蛋白偶聯(lián)引起信號級聯(lián)放大來發(fā)揮多種類型的生物學(xué)效應(yīng)。多項研究表明，雌激素及雌激素類化合物進入人體后擾亂了人體內(nèi)的信號通路，但目前通過膜受體GPER介導(dǎo)的雌激素干擾效應(yīng)并未得到廣泛關(guān)注，并且很多用于乳制品中雌激素檢測的方法是基于對其本身濃度的測定，與受-配體識別、細胞信號傳遞或動物神經(jīng)信號傳導(dǎo)無關(guān)，而且動物實驗和細胞實驗也很難代表人體功能，其實驗結(jié)果也很難供人體參考。故基于研究受配體互作、胞外與胞內(nèi)間聯(lián)動變構(gòu)、胞內(nèi)信號級聯(lián)放大及傳遞的全過程并從受體的角度對乳制品中雌激素進行功能評價才是可行的，但到目前為止并未見基于GPER來檢測乳制品中雌激素的相關(guān)報道，也未見有關(guān)GPER生物傳感器的相關(guān)報道，即使有多個研究通過ERα構(gòu)建了生物傳感器來檢測水中的環(huán)境雌激素。根據(jù)筆者所在實驗室近年在受體傳感器方面進行的系統(tǒng)研究，人類GPER分子組裝構(gòu)建電化學(xué)傳感器有望對乳制品中雌激素及雌激素類化合物進行定量化測定及功能評價。

4 利用GPER檢測雌激素（雌激素類化合物）需解決的科學(xué)問題

近年來，雖然關(guān)于GPER的研究已經(jīng)很多，但未發(fā)現(xiàn)有利用GPER檢測雌激素（雌激素類化合物）的相關(guān)研究。假設(shè)基于GPER構(gòu)建一個受體型電化學(xué)生物傳感器來檢測乳制品中雌激素，仍存在一些需要解決的問題。1）生物傳感器修飾過程一般都需要若干個步驟以固定所需的生物活性分子，而且傳感器自身電學(xué)特性也存在差異，這使得同一批次制備的生物傳感器對同一濃度標準品溶液的電化學(xué)響應(yīng)也會存在偏差。這些微小的偏差在傳感器商業(yè)化過程中不可避免地被放大，影響最終檢測結(jié)果，進一步引起用戶對儀器準確度的擔(dān)憂。2）盡管大量研究都已揭示GPER與諸多生理作用相關(guān)，并開發(fā)出一系列藥物如治療乳腺癌的藥物，如氟維司群、他莫昔芬，卻一直未有研究獲得確切的GPER晶體結(jié)構(gòu)，更未獲得雌激素或雌激素類化合物“敲擊”GPER時的互作過程，僅有的報道是基于分子建模模擬破譯GPER激動劑和拮抗劑相互作用的分子識別特性，這為證明雌激素或雌激素類化合物如何作用于GPER的作用機制帶來諸多困難。冷凍電子顯微鏡技術(shù)的興起為解析GPER的精確結(jié)構(gòu)和研究受-配體互作過程提供了新途徑，但雌激素或雌激素類化合物與GPER的作用類似于“敲擊鍵盤”的過程，雌激素或雌激素類化合物“敲擊”GPER的某個結(jié)構(gòu)域后在短時間內(nèi)改變GPER的構(gòu)象從而傳遞信號到胞內(nèi)進而激活胞內(nèi)相關(guān)信號或代謝途徑，那么極低濃度的配體是如何激活受體下游信號的問題很難讓人忽視。3）目前用于乳制品中雌激素檢測相關(guān)的ER型電化學(xué)生物傳感器的研究成果較少，盡管有相關(guān)成功的報道卻少有后續(xù)進展。4）目前大多數(shù)生物傳感器主要用于檢測環(huán)境水樣中的雌激素，很少直接用于牛奶和蜂蜜等食品基質(zhì)中雌激素的檢測，而且當前已開發(fā)的生物傳感器并未廣泛開發(fā)用于商業(yè)用途。

5 結(jié) 語

乳制品是當今世界人們廣泛消費的一種重要的食品。乳制品中包含多種來源的激素，其中最值得關(guān)注的是雌激素。乳制品中的雌激素進入人體通過雌激素信號途徑干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而產(chǎn)生不良的生物學(xué)效應(yīng)。乳制品中雌激素的有效檢測一直是相關(guān)研究的熱點。由于雌激素物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，僅根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)來分析預(yù)測雌激素活性具有一定的局限性，而生物檢測方法將在乳制品雌激素檢測中扮演重要的角色。該方法不僅可以檢測復(fù)雜食品基質(zhì)中的雌激素，還解決了傳統(tǒng)大型儀器檢測和免疫方法的不足，但其在單組分準確測量和檢測精度方面有所欠缺，需在今后得到解決。

當前乳制品中雌激素的檢測方法主要基于對雌激素本身濃度的測定，與受-配體識別、細胞信號傳遞無關(guān)。而動物實驗和細胞實驗很難同步到人體功能，其結(jié)果也較難供人體參考。GPER是介導(dǎo)快速非基因組學(xué)途徑的雌激素膜受體，已有ERα生物傳感器檢測水中雌激素的研究，因此可將GPER應(yīng)用于乳制品中雌激素的檢測，如將人類GPER分子組裝在電極表面，制成電化學(xué)受體傳感器，從而對乳制品中雌激素進行定量化測定和功能評價。此外，未來的乳制品雌激素檢測手段應(yīng)更加便攜化、自動化、數(shù)據(jù)化。例如，生物傳感器的檢測結(jié)果可直接發(fā)送并呈現(xiàn)在移動設(shè)備端。因此設(shè)計一款檢測乳制品中雌激素的理想型生物傳感器需要在多方面投入更多的精力。