孟令莉，張 晗，侯惠靜，張曉燕，雷丹丹，趙 培，何雨薇，吳子健,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津職業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津 300410）

白藜蘆醇是一種廣泛存在于漿果（如葡萄）、堅(jiān)果（如花生）以及塊莖（如虎杖）等中的疏水性非黃酮類多酚化合物，并且反式白藜蘆醇（圖1）結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有更強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)心臟和保護(hù)神經(jīng)等生理活性。然而白藜蘆醇的水溶性低，穩(wěn)定性差（在酸性pH值下或光照條件下極易降解），極大地限制了其在食品以及醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用。目前，有學(xué)者利用多糖等天然或人造大分子包埋改善白藜蘆醇的穩(wěn)定性，如Wang Peng等通過淀粉凝膠顆粒提高白藜蘆醇穩(wěn)定性和緩慢釋放，進(jìn)而提高其利用率；Jo等利用蠟質(zhì)玉米淀粉和殼聚糖封裝白藜蘆醇的Pickering乳劑提高其在腸道保留時(shí)間。

圖1 反式白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of trans-resveratrol

乳液分為水包油（O/W）和油包水（W/O）兩類。乳液中含有納米或微米級(jí)固體顆粒（如蛋白質(zhì)、多糖或磷脂）被稱為Pickering乳液。Pickering乳液可有效提高疏水性物質(zhì)（特別是疏水性功能性成分，如類胡蘿卜素類、多酚類物質(zhì)）的水溶性、穩(wěn)定性以及生物利用度。其中，蛋白質(zhì)是常用的Pickering乳液的乳化劑，蛋白分子中的疏水區(qū)域可吸附于疏水性物質(zhì)的表面，促進(jìn)疏水性物質(zhì)在水中的分散；然而，蛋白質(zhì)易受到熱處理、pH值和離子強(qiáng)度的影響，甚至發(fā)生變性和團(tuán)聚，造成由蛋白質(zhì)穩(wěn)定體系的相分離。而蛋白質(zhì)與多酚或多糖結(jié)合會(huì)提高其穩(wěn)定性：在蛋白質(zhì)-多糖共聚物中，蛋白部分可吸附于油滴表面，而多糖部分不僅具有水溶性，又可產(chǎn)生強(qiáng)烈的空間阻礙防止油滴聚集，更具有對熱、pH值、離子強(qiáng)度較高的穩(wěn)定性，因而常用于疏水性活性物質(zhì)（如姜黃素、葉黃素、-胡蘿卜素等）的包埋；另外，Pickering乳液體系中，油滴的比表面積大，被封裝的疏水性物質(zhì)易與氧分子和自由基發(fā)生氧化，可通過在共聚體系中增加多酚來提高其抗氧化性能，多酚與多糖-蛋白之間可通過共價(jià)或非共價(jià)作用形式進(jìn)行結(jié)合，特別是多酚與多糖-蛋白之間的共價(jià)結(jié)合不僅使所獲得的多酚-多糖-蛋白具有更高的穩(wěn)定性（即pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及對離子強(qiáng)度的穩(wěn)定性等），而且具有更強(qiáng)的抗氧化性，使所包封的疏水性物質(zhì)受到多酚的保護(hù)，目前該三元共聚物可應(yīng)用于穩(wěn)定生物活性物質(zhì)的Pickering乳液中，如：Yan Yong等使用的牛血清白蛋白-葡聚糖（dextran，DEX）-綠原酸三元共聚物顯著提高了負(fù)載葉黃素Pickering乳液的理化穩(wěn)定性以及葉黃素的生物可及性。卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）是源于雞卵清的含糖基的球蛋白，分子質(zhì)量為44.3 kDa，其蛋白部分由385 個(gè)氨基酸殘基組成，一半以上是疏水性氨基酸殘基，具有優(yōu)異的功能特性（如乳化、增稠、膠凝和發(fā)泡），可作為生物活性物質(zhì)的包封載體，可顯著改善姜黃素的水溶性和光穩(wěn)定性，然而，OVA熱穩(wěn)定性差且在等電點(diǎn)附近易產(chǎn)生沉淀，而通過美拉德反應(yīng)對OVA進(jìn)行糖基化改性可有效改善其熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性等加工特性；此外，DEX是一類還原性多糖，可與蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，提高蛋白的乳化、凝膠等功能特性；沒食子酸（gallic acid，GA）是一種小分子植物多酚，具有很強(qiáng)抗氧化作用，其分子中的羥基和羰基基團(tuán)可與蛋白質(zhì)或多糖形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使形成的共聚物或復(fù)合物具有較高的乳化穩(wěn)定性（emulsification stability index，ESI）和抗氧化能力。

本研究為提高白藜蘆醇穩(wěn)定性和抗氧化性能，采用OVA、GA和DEX結(jié)合的共聚物作為封裝材料，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜法等對共聚物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，采用高壓均質(zhì)法制取包埋白藜蘆醇的Pickering乳液，通過動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)來評(píng)價(jià)乳液的穩(wěn)定性，通過測定貯存期間白藜蘆醇的含量和乳液的抗氧化性能等進(jìn)一步研究OVA-GA-DEX對白藜蘆醇的穩(wěn)定性及抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇（≥98%）、OVA（≥90%）、DEX（≥95%，10 kDa）、GA（≥98%）、中鏈甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT） 上海源葉生物科技有限公司；蛋白Marker 上海麥克林試劑有限公司；SDS、考馬斯亮藍(lán)R250、-巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二甲醛、三羥甲基氨基甲烷、,,’,’-四甲基二乙胺 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水由實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoPhotomerer-N50超微量紫外分光光度計(jì) 德國Implen公司；LGJ-20F真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；LUMOS傅里葉變換顯微紅外光譜儀德國布魯克公司；SE 260型垂直電泳系統(tǒng) 美國Hoefer公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 蘇州島津儀器有限公司；FL970型熒光分光光度計(jì) 香港Techcomp公司；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；AH100B高壓均質(zhì)機(jī) 加拿大ATS工程公司；NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀 馬爾文帕納科公司；Phenom XL掃描電子顯微鏡 美國飛納公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速均質(zhì)分散器 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 OVA樣品前處理

將OVA按照1～2 g/100 mL分散于超純水中，25 ℃磁力攪拌3 h使其充分溶解，得到的蛋白溶液于4 ℃貯存12 h過夜，然后4 ℃、6 000 r/min離心10 min，取上清液，并除去不溶物，采用UV法，將上清液中的蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至約10.00 mg/mL。

1.3.2 共聚物的制備

參考Rawel等采用堿法接枝和Sun Jun等的干熱美拉德反應(yīng)法制備OVA-GA、OVA-DEX和OVA-GA-DEX共聚物：將OVA按照1 g/100 mL分散于超純水中，加入GA（OVA與GA質(zhì)量比5∶1）攪拌至充分溶解，使用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.0，混合物在室溫下攪拌反應(yīng)24 h后使用透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da）透析48 h，凍干獲得OVA-GA共聚物；OVA和DEX質(zhì)量比1∶1混合均勻，使OVA質(zhì)量濃度為10 mg/mL，將混合物凍干后將其置于相對濕度79%，60 ℃條件下反應(yīng)72 h獲得OA-DEX共聚物粉末。將OVA-GA粉末代替OVA重復(fù)上述步驟制備OVA-GADEX共聚物粉末。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參照Yu Yali等的方法進(jìn)行SDS-PAGE測定。

1.3.4 接枝度測定

參照Sun Jun等的方法測定共聚物的接枝度。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Ahmad等的方法，使用配備了DTGS探測器的紅外光譜儀，將樣品通過金門鉆石單反射ATR進(jìn)行掃描，掃描范圍4 000～600 cm，分辨率為4.0 cm。使用OMNIC軟件，對光譜的酰胺I代進(jìn)行傅里葉去卷積，并使用多重高斯曲線擬合和二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算，計(jì)算出二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成。

1.3.6 內(nèi)源性熒光測定

參考Xiao Nanhai等的方法：將樣品粉末溶解于磷酸鹽緩沖溶液（10.0 mmol/L，pH 7.2）至蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，進(jìn)行熒光掃描，操作條件如下：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長范圍300～500 nm，狹縫寬度5.00 nm，掃描速率1 200 nm/min。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Yu Yali等的方法：用磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.2）將各樣品中蛋白質(zhì)量濃度至0.01～0.05 mg/mL，取4 mL樣品與20 μL ANS溶液（8.0 mmol/L）混合，25 ℃孵育2 min后測定其熒光強(qiáng)度。操作條件如下：設(shè)置激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長400～600 nm，掃描速率600 nm/min，將熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)量濃度作圖進(jìn)行擬合，曲線的斜率即表面疏水性（）。

1.3.8 乳化性和ESI

參考Li Xueqi等的方法：將樣品用超純水配成蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL的樣品溶液，以體積比3∶1將蛋白溶液與大豆油混合，采用高速均質(zhì)分散器在10 000 r/min攪打2 min，分別于第0和30分鐘從底部吸取溶液50 μL，將其加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中混合均勻，測定OD，乳化性（emulsifying activity index，EAI）和ESI按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：為第0分鐘吸光度；為第30分鐘吸光度；為稀釋倍數(shù)；為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；為油相體積分?jǐn)?shù)0.25；為光經(jīng)1 cm。

1.3.9 Pickering乳液的制備

參考Wang Chaonan和Wang Peng等的方法進(jìn)行：白藜蘆醇加入到含有90% MCT和10%（/）乙醇溶液中使其質(zhì)量濃度為5 mg/mL，避光攪拌1 h使白藜蘆醇充分溶解。將含有白藜蘆醇的MCT溶液和共聚物水溶液（以10 mg/mL蛋白質(zhì)量濃度計(jì)）以5∶95（/）混合，10 000 r/min攪拌2 min，后采用高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（600 bar，4 ℃）7 次得到封裝白藜蘆醇的乳液。

1.3.10 白藜蘆醇含量的測定

將75%乙醇溶液與乳液19∶1（/）比例混合，使白藜蘆醇充分溶出后適當(dāng)稀釋，測定波長306 nm的吸光度，采用白藜蘆醇制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（3）計(jì)算乳液中白藜蘆醇的保留率：

式中：為包埋時(shí)白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，其原始質(zhì)量濃度為250 μg/mL；為所得乳液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.11 Pickering乳液粒徑的測定

用超純水將樣品乳液稀釋400 倍，采用納米顆粒跟蹤分析儀檢測Pickering乳液的平均粒徑和粒徑分布。對于所有的實(shí)驗(yàn)，測定均重復(fù)3 次，每次5 組，時(shí)間為1 min，測定時(shí)平衡2 min，溫度設(shè)為25 ℃。

1.3.12 抗氧化活性測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率按Feng Jilu等的方法適當(dāng)修改：使用去離子水將乳液稀釋10 倍，使用乙醇配制1.2 mmol/L DPPH溶液，2 mL DPPH-乙醇溶液加入1 mL樣品溶液，混合置于暗處室溫下反應(yīng)30 min。測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（4）計(jì)算：

式中：為去離子水和DPPH/ABTS溶液吸光度；為樣品和乙醇吸光度；為樣品和DPPH/ABTS溶液吸光度。

2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）陽離子自由基清除率測定按照Kevij等的方法適當(dāng)修改：將ABTS溶液（7.0 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）以1∶1（/）比例混合，暗處靜置16 h，使用去離子水稀釋，使在波長734 nm處的吸光度為0.7±0.02，取0.2 mL樣品乳液加入3 mL ABTS溶液混合反應(yīng)，測定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，＜0.05，差異顯著；使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE和接枝度分析

SDS-PAGE可有效確定DEX或GA與OVA是否發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，以及接枝后共聚物的分子質(zhì)量。如圖2A所示，OVA樣品顯示其分子質(zhì)量為44 kDa，OVA-GA共聚物樣品條帶高于44 kDa，比OVA分子質(zhì)量大，且條帶的顏色較深，OVA-DEX共聚物樣品條帶從44 kDa開始往上擴(kuò)展，而且越往分子質(zhì)量大的部分條帶顏色越深，說明分子質(zhì)量較OVA增大，OVA-GA-DEX共聚物樣品條帶也是從44 kDa附近開始往上擴(kuò)展，但與泳道4中的OVA-DEX樣品相比，條帶在44～70 kDa顏色更深；SDSPAGE圖譜結(jié)果說明：OVA與DEX、OVA與GA發(fā)生了共價(jià)結(jié)合，這與Kim等和Yan Yong等的研究結(jié)果一致；如圖2B所示，OVA-DEX的接枝度（（12.73±0.74）%）明顯高于OVA-GA-DEX（（8.51±0.35）%），對比OVA-GA-DEX在44 kDa與OVA-DEX比還有較明顯的電泳條帶，這是由于GA與部分游離氨基結(jié)合從而占據(jù)了一部分空間位阻，使DEX更難以和蛋白結(jié)合導(dǎo)致。

圖2 共聚物的SDS-PAGA（A）和接枝度（B）Fig. 2 SDS-PAGE pattern (A) and grafting degree of conjugates (B)

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 OVA及共聚物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of OVA and conjugates

圖4 OVA及共聚物二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Fig. 4 Secondary structure compositions of OVA and conjugates

傅里葉變換紅外光譜是研究分子中基團(tuán)的有效手段，也可分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。如圖3所示，共聚物圖譜在3 300～3 200 cm中峰變寬并向更大的波數(shù)移動(dòng)，而在3 300～3 200 cm范圍代表O—H鍵，因此這是與蛋白共價(jià)結(jié)合的DEX、GA結(jié)構(gòu)中含有—OH引起；蛋白質(zhì)酰胺I帶（1 600～1 700 cm，主要是C＝O拉伸）和酰胺II帶（1 500～1 600 cm，C—N伸縮與N—H彎曲）都與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，在酰胺I帶，接枝DEX的共聚物在1 630～1 650 cm出現(xiàn)條帶變化并且共聚物的峰值藍(lán)移到較高波數(shù)，這是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的特征峰，表明OVA、DEX和GA通過C—N、C＝O共價(jià)相互作用，一般來說，在評(píng)估二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白變化時(shí)，酰胺I帶比酰胺II帶更敏感，因此對酰胺I帶采用傅里葉自反褶積和高斯函數(shù)計(jì)算其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。如圖4所示，與OVA相比，共聚物的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的變化，共聚物的-螺旋減少、無規(guī)卷曲增加，這與Yan Yong等研究結(jié)果一致。1 220～1 010 cm處的吸收帶與C—N的反對稱拉伸有關(guān)，在1 220～1 010 cm處，共價(jià)結(jié)合DEX的共聚物出現(xiàn)了明顯的峰，表明OVA與DEX反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生了更多的C—N鍵，這與Liu Xiangju等的結(jié)果一致，另外，美拉德反應(yīng)消耗了一部分羰基和氨基，生成了Amadori化合物（C＝O）、Schiff堿（C＝N）和吡嗪（C—N），都會(huì)使共聚物的峰強(qiáng)度和位置發(fā)生變化。

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

圖5 OVA及共聚物的內(nèi)源熒光光譜Fig. 5 Intrinsic fluorescence spectra of OVA and conjugates

色氨酸殘基是蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光探針，可用于表征蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基內(nèi)部疏水性環(huán)境的變化以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，OVA蛋白分子中含有3 個(gè)色氨酸殘基（分別為Trp、Trp和Trp）。如圖5所示，各物質(zhì)的熒光強(qiáng)度由高到低依次為OVA＞OVA-DEX＞OVAGA＞OVA-GA-DEX，3 種共聚物的熒光強(qiáng)度明顯比OVA低，其中OVA-GA-DEX和OVA-GA的熒光強(qiáng)度接近，但比OVA-DEX下降更顯著，這表明相比于DEX，GA對OVA蛋白的熒光強(qiáng)度顯示出更強(qiáng)的猝滅效果。原因在于蛋白質(zhì)與GA共價(jià)反應(yīng)是在堿性條件下進(jìn)行的，此時(shí)GA會(huì)首先被氧化成相應(yīng)的醌類物質(zhì)，然后直接與蛋白質(zhì)上的游離氨基、色氨酸殘基、賴氨酸殘基以及半胱氨酸殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，特別是與色氨酸殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度降低，另外，蛋白的熒光淬滅還可能是多酚吸收了一部分熒光信號(hào)，使多酚的單獨(dú)作用較DEX使蛋白本身熒光強(qiáng)度更低。

2.4 共聚物表面疏水性分析

圖6 OVA及共聚物的表面疏水性Fig. 6 Surface hydrophobicity of OVA and conjugates

蛋白質(zhì)的外源性熒光強(qiáng)度以及蛋白質(zhì)表面疏水性也是直接表征蛋白構(gòu)象是否發(fā)生變化的一個(gè)重要表征手段。OVA中的385 個(gè)氨基酸殘基，約一半以上為疏水性氨基酸殘基，隱藏在OVA結(jié)構(gòu)內(nèi)部，當(dāng)疏水基團(tuán)暴露在極性環(huán)境中或蛋白的結(jié)構(gòu)展開時(shí)，表面疏水性會(huì)發(fā)生變化。如圖6所示，OVA-GA、OVA-DEX、OVA-GADEX的表面疏水性比OVA顯著低，這表明OVA在與DEX或GA共價(jià)結(jié)合后的共聚物更加親水，降低了蛋白質(zhì)的疏水性，并且DEX和GA的遮蔽作用妨礙了ANS探針更難與蛋白質(zhì)分子表面疏水區(qū)域結(jié)合。加熱會(huì)使OVA結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)暴露，因此DEX與OVA-GA共價(jià)物結(jié)合后，OVA-GA-DEX的表面疏水性比OVA-GA高（＜0.05），這與Cui Yanchun等的研究結(jié)果一致，并且GA與OVA共價(jià)結(jié)合后產(chǎn)生了一定的空間位阻，使親水的DEX更難與OVA-GA結(jié)合，導(dǎo)致OVA-GA-DEX共價(jià)物的表面疏水性較OVA-GA顯著提高。

2.5 共聚物的EAI和ESI分析

圖7 OVA及共聚物的EAI和ESIFig. 7 EAI and ESI of OVA and conjugates

蛋白質(zhì)的EAI是指蛋白質(zhì)形成乳液的能力，而蛋白質(zhì)的ESI則與蛋白在乳化過程中穩(wěn)定液滴的能力有關(guān)，兩者結(jié)合可以分析共聚物是否能形成穩(wěn)定的Pickering乳液。如圖7所示，OVA-DEX的EAI比OVA顯著提高（＜0.05），而OVA-GA-DEX的EAI比OVA-GA也顯著提高（＜0.05），說明在相同分子基礎(chǔ)上，通過結(jié)合DEX可有效提高共聚物的EAI，而OVA-GA的EAI比OVA顯著降低（＜0.05），且OVA-GA-DEX的EAI比OVA-DEX也顯著降低（＜0.05），說明GA的共價(jià)結(jié)合降低了共聚物的EAI；OVA-GA的ESI最大，為（46.9±0.59）min，而OVA-GA-DEX與OVA相比有較為明顯地提高（＜0.05），另外OVA-GA的ESI與OVA的相比顯著提高（＜0.05），說明GA對于OVA的ESI影響較大，而OVA-DEX的ESI與OVA的相比無顯著差異（＞0.05），說明DEX對于OVA的ESI影響不大，另外OVA-GA-DEX與OVA-DEX的ESI差異性也不大（＞0.05），說明先共價(jià)GA的OVA分子再歷經(jīng)DEX的糖基化，ESI沒有明顯的變化。一般來說，蛋白質(zhì)是兩親性分子，在水包油乳狀液中，蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)向油相移動(dòng)，而極性部分向水相移動(dòng)。蛋白質(zhì)作為乳化劑吸附在油滴表面形成界面膜，降低乳化過程中油水界面的界面張力，防止油滴絮凝聚結(jié)，保持乳液的穩(wěn)定性。在OVA-DEX、OVA-GADEX的EAI與OVA、OVA-GA相比均有提高，可見DEX的加入使蛋白質(zhì)在油-水界面上強(qiáng)烈吸附，提高了蛋白的EAI，同時(shí)，DEX提供的空間斥力阻止了油滴的聚集，這與先前的研究報(bào)道：在水包油乳液中，多糖有助于蛋白質(zhì)在油水界面吸附并且使乳液更加穩(wěn)定結(jié)果一致。另外，由于多酚是親水性分子，形成的OVA-GA共聚物具有更高的親水性，因此難以吸附在油滴表面，導(dǎo)致EAI降低，但GA提供的空間斥力可防止油滴的聚集，提高了ESI。因此，從EAI和ESI看，OVA-GA、OVA-DEX、OVA-GADEX都具有形成較為穩(wěn)定Pickering乳液的能力。

2.6 平均粒徑及粒徑分布分析

圖8 乳液的粒徑分布Fig. 8 Particle size distribution of emulsions

表1 乳液的平均粒徑Table 1 The average particle size of emulsions nm

平均粒徑代表了Pickering乳液整體的顆粒度大小，粒徑分布范圍越集中表示乳液均勻度越高。如表1所示，初始制得的Pickering乳液的平均粒徑在36～40 nm，差異不大（＞0.05），另外，乳液的粒徑分布在30～50 nm之間（圖8A），表明由OVA、OVA-GA、OVA-DEX、OVA-GA-DEX制成的Pickering乳劑顆粒度分散均勻。4 ℃貯存28 d后，Pickering乳液的平均粒徑和粒徑分布有不同程度的改變，OVA穩(wěn)定的Pickering乳液的平均粒徑增大到（57.5±6.31）nm，OVA-GA、OVA-DEX、OVA-GA-DEX制得的Pickering乳液平均粒徑分別增大到（89.17±14.09）、（103.63±8.71）nm和（106.1±11.83）nm，顯著高于由OVA制得的乳液平均粒徑（＜0.05）；從粒徑分布看，乳液的顆粒大部分粒徑分布小于50 nm，相比OVA制得的Pickering乳液，共聚物乳液在低溫條件下乳液顆粒更容易聚集，這可能是在貯存期間，吸附在油滴表面的蛋白由于與其他吸附蛋白的靜電排斥和未吸附蛋白的疏水相互作用，會(huì)從界面上剝離下來導(dǎo)致，另外，由于蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)物中多酚的氧化和交聯(lián)可能導(dǎo)致顆粒尺寸增大，形成穩(wěn)定的聚集體，這些聚集體能夠通過疏水相互作用或膠束狀結(jié)構(gòu)使親脂性水不溶性藥物溶解形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。結(jié)合表面疏水性和EAI看，DEX或GA的作用使OVA疏水性降低，使得共聚物對油的包裹性較弱，導(dǎo)致油滴的聚集。在25 ℃貯存28 d后，OVA制得的Pickering乳液平均粒徑較?。?26.7±12.83）nm，OVA-GA制得的Pickering乳液具有較大的平均粒徑（157.83±13.39）nm，而OVA-DEX（138.57±11.08）nm，OVA-GA-DEX（141.37±10.04）nm的Pickering乳液的平均粒徑與OVA，OVA-GA差異不大（＞0.05），從粒徑分布看（圖8C），粒徑大小主要分布在200 nm以內(nèi)，在200～600 nm只有少量分布，不足以改變?nèi)橐旱钠骄?。值得注意的是，OVA制得的Pickering乳液粒徑在600～800 nm有少量分布，這說明由OVA制得的Pickering乳液中的顆粒向更大粒徑凝聚。在50 ℃貯存28 d后，與4 ℃和25 ℃貯存比，平均粒徑發(fā)生了相反的變化，OVA制得的乳液比OVA-GA、OVADEX、OVA-GA-DEX制得的Pickering乳液顯示出更大的平均粒徑，從粒徑分布來看（圖8D），共聚物制得的Pickering乳液的粒徑主要分布在200 nm以內(nèi)，以小于100 nm為主，OVA制得的乳液顆粒的粒徑在400～800 nm有明顯的分布，這表示在溫度較高的情況下，蛋白受熱發(fā)生凝聚導(dǎo)致乳液顆粒逐漸變大，而在共價(jià)物制得的Pickering乳液中，由于多糖或多酚的作用，以及未接枝到蛋白上的游離多糖繼續(xù)在濕熱環(huán)境中與蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)，增大了乳液中顆粒的斥力，進(jìn)而形成一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，阻止了顆粒過大的凝聚，結(jié)果表明，OVA及其共聚物制得的Pickering乳液顆粒分布均勻，經(jīng)過不同條件下28 d貯存后，OVA制得的Pickering乳液更適合在低溫條件下貯存，在常溫和高溫條件下粒徑向更大的趨勢凝聚，共聚物尤其是OVA-GA-DEX更能使Pickering乳液在高溫下保持穩(wěn)定。

2.7 共聚物對白藜蘆醇乳液貯存穩(wěn)定性和抗氧化性的影響

圖9 貯存過程中白藜蘆醇含量變化Fig. 9 The contents of RES in emulsions during storage

圖10 Pickering乳液的抗氧化能力Fig. 10 Antioxidant capacity of Pickering emulsion

如圖9A所示，0d，OVA、OVA-DEX、OVAGA以及OVA-GA-DEX對白藜蘆醇的包埋率分別為（77.34±0.88）%、（80.13±0.67）%、（90.31±0.77）%以及（89.09±0.30）%，其中，OVA-GA和OVA-GA-DEX顯示出較高的包埋率（＜0.05），說明GA的共價(jià)結(jié)合有利于OVA能更好地包埋白藜蘆醇。通過每周取樣檢測乳液中白藜蘆醇含量的方式，可以看出在不同貯存條件（4、25、50 ℃、光照4 ℃）下，共聚物對白藜蘆醇的保護(hù)能力。白藜蘆醇對光、熱敏感，尤其是在光照條件下極易發(fā)生降解，如圖9D所示，白藜蘆醇含量在光照貯存下最低，對于不同共聚物的Pickering乳液，白藜蘆醇含量為OVAGA＞OVA-GA-DEX＞OVA-DEX＞OVA，其中OVA-GA或OVA-GA-DEX制得的Pickering乳液白藜蘆醇含量更高，這與GA本身具有較強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān)，而DEX可提高乳液的穩(wěn)定性。因此，OVA-GA、OVA-DEX、OVA-GA-DEX提供了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境并且GA提供了一定的抗氧化能力，阻止了白藜蘆醇氧化降解。結(jié)合乳液粒徑分布看，與OVA制得的Pickering乳液相比，共聚物穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑分布更加集中，這顯示出Pickering乳液乳體系更加穩(wěn)定，形成的致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)減少了包裹白藜蘆醇油溶液的析出，進(jìn)而防止了白藜蘆醇的氧化降解，使白藜蘆醇的保留率更高。如圖10所示，對于剛制備的Pickering乳液，OVA-GA（（82.32±0.17）%、（80.7±3.89）%），OVA-DEXGA（（83.34±0.38）%、（85.69±6.30）%）制得的Pickering乳液具有更高的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除率。這和GA本身具有抗氧化活性有關(guān)。研究表明，具有抗氧化活性的酚類物質(zhì)與蛋白共價(jià)作用可明顯提高蛋白的抗氧化活性。OVA-DEX制得乳液的ABTS陽離子自由基清除能力（（61.21±0.10）%）明顯高于OVA（（53.68±1.24）%）制得的Pickering乳液（＜0.05），另外，OVA-DEX共聚物乳液中白藜蘆醇的含量較高，使乳液的抗氧化能力較強(qiáng)。經(jīng)28 d貯存后，乳液的抗氧化活性發(fā)生了不同的變化，如圖10所示，對于不同貯存條件，抗氧化活性表現(xiàn)較為一致，結(jié)果為4 ℃＞25 ℃＞50 ℃＞光照4 ℃，這和白藜蘆醇的含量變化具有一致性。在貯存28 d后，對比同一物質(zhì)制得的Pickering乳液，光照4 ℃條件下白藜蘆醇的含量最低，4 ℃貯存下白藜蘆醇的含量最高，另外，高溫會(huì)促使蛋白-多糖的美拉德濕熱反應(yīng)，形成更多糖基化產(chǎn)物，并且隨著共聚物的量增多，Pickering乳液穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng)，因此可以看出，共聚物尤其是OVA-GA-DEX更能在長時(shí)間的熱環(huán)境中保持穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

GA或DEX與OVA可共價(jià)結(jié)合形成3 種聚合物（OVAGA、OVA-DEX、OVA-GA-DEX），改變了OVA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，其中OVA-GA-DEX有更好的親水性并提高乳液的ESI。3 種共聚物尤其是OVA-GA-DEX制得的Pickering乳液具有更好的穩(wěn)定性，其乳液顆粒粒徑分布更加均勻且平均粒徑更?。ㄓ绕湓?0 ℃貯存28 d后的平均粒徑為（85.07±10.74）nm），乳液的抗氧化性能測定顯示OVA-GA-DEX更高（如光照貯存后DPPH自由基清除率為（31.32±0.71）%，ABTS陽離子自由基清除率為（22.87±0.58）%），因此，OVA-GA-DEX共聚物可較好地穩(wěn)定白藜蘆醇，并改善其抗氧化性能。