楊宗政，張?zhí)煊?，孫 煒，李文軒，馬 建，武莉婭，3

（1.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457；3.天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；4.天津津港基礎(chǔ)設(shè)施養(yǎng)護(hù)運(yùn)營工程管理有限公司，天津 300456）

漁業(yè)、食品加工、紡織、皮革和石油等行業(yè)產(chǎn)生的廢水含有一定量的總?cè)芙庑怨腆w（TDS）〔1〕，其中TDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)<1%的廢水被稱為含鹽廢水〔2〕。含鹽廢水的水量占全球廢水總量的5%左右〔3〕，如未經(jīng)處理直接排放，可能導(dǎo)致地表水、地下水及土壤受到污染〔4〕。因此，開發(fā)高效穩(wěn)定的含鹽廢水處理工藝成為研究重點(diǎn)。

生物法是處理含鹽廢水最常用的方法〔5〕。上流式厭氧污泥床反應(yīng)器（UASB）、膜生物反應(yīng)器（MBR）、序批式反應(yīng)器（SBR）、活性污泥法（ASP）、人工濕地（CWs）等基于微生物附著和懸浮生長的生物處理工藝，可用于含鹽廢水的處理〔6?7〕。但在處理過程中，高TDS 會抑制活性污泥微生物的生長，進(jìn)而影響污水處理效率〔8〕。因此，基于穩(wěn)定的污水處理反應(yīng)器，通過TDS 梯度馴化提高活性污泥對含鹽環(huán)境的的適應(yīng)能力，是實(shí)觀含鹽廢水生化處理的重要前提〔9〕。據(jù)報(bào)道，采用逐步提高系統(tǒng)鹽濃度的方式進(jìn)行污泥耐鹽馴化，馴化后的污泥可很好地降解含鹽廢水中的有機(jī)物〔10?11〕。

近年來，高通量測序技術(shù)被廣泛用于微生物群落的分析〔12〕，特別是含鹽廢水處理過程中活性污泥微生物的種群變化〔13?15〕。但現(xiàn)有研究大多只涉及鹽度對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，耐鹽活性污泥馴化的相關(guān)研究較少，且在提升鹽度的同時(shí)沒有考慮出水是否達(dá)標(biāo)。因此，在出水能夠穩(wěn)定達(dá)標(biāo)的耐鹽工藝基礎(chǔ)上，分析活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，對于優(yōu)化污水處理工藝有重要的指導(dǎo)意義。筆者采用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的A2O-MBR 反應(yīng)裝置，研究了進(jìn)水TDS 從2 000 mg/L 逐步增至7 000 mg/L 的過程中活性污泥系統(tǒng)連續(xù)處理廢水的性能，以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，以出水COD、NH4+?N、TN 達(dá)標(biāo)作為階段馴化的要求，進(jìn)行耐鹽活性污泥的馴化?；诟咄繙y序的方法，闡述了活性污泥耐鹽馴化過程中微生物的演替過程及優(yōu)勢菌種豐度的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及裝置

實(shí)驗(yàn)接種污泥取自天津市某污水處理廠厭氧池、缺氧池、好氧池，污泥質(zhì)量濃度為3 200 mg/L。實(shí)驗(yàn)用水為模擬含鹽廢水，組分包括：281.4 mg/L 葡萄 糖、25 mg/L MgSO4·7H2O、0.1 mg/L FeCl3·6H2O、95.5 mg/L NH4Cl、13.2 mg/L KH2PO4、0.1 mg/L Co（NO3）2·6H2O、0.1 mg/L Na2MoO4·6H2O、0.1 mg/L CuSO4·5H2O、0.1 mg/L MnSO4·5H2O、0.1 mg/L ZnSO4·7H2O、2 000~7 000 mg/L NaCl。廢 水COD、TN、TP 分別為243~325、22.5~27.6、2.5~3.5 mg/L。

實(shí)驗(yàn)采用A2/O-MBR 組合工藝裝置連續(xù)運(yùn)行，如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of experimental device

實(shí)驗(yàn)裝置由聚氯乙烯（PVC）制成，有效容積為132 L。裝置內(nèi)部由隔板分為5 部分，包括沉淀池（12 L）、厭 氧 池（27 L）、缺 氧 池（27 L）、好 氧 池（37 L）、膜池（29 L）。除沉淀池外各反應(yīng)池均配置曝氣系統(tǒng)，其中厭氧池、缺氧池用時(shí)間繼電器控制曝氣系統(tǒng)的啟停時(shí)間以實(shí)現(xiàn)間歇曝氣?？刂茀捬醭厝芙庋酰―O）在0.2 mg/L 以內(nèi)，缺氧池DO 在0.2~0.5 mg/L，好氧池、膜池持續(xù)曝氣，保持池內(nèi)DO 在3~5 mg/L。膜池采用中空纖維膜（天津膜天膜科技股份有限公司）進(jìn)行過濾，膜面積為0.25 m2、孔徑為0.22 μm、膜通量為10~20 L/（m2·h）。原水進(jìn)入?yún)捬醭貫榫哿拙尼屃走^程提供有機(jī)碳源，厭氧池混合液通過溢流依次進(jìn)入缺氧池、好氧池和膜池，膜池底部污泥通過回流泵回流至厭氧池，膜依靠負(fù)壓間歇出水。

系統(tǒng)水力停留時(shí)間（HRT）為32 h，硝化液回流比控制在250%，采用逐步增加TDS 的方式進(jìn)行耐鹽活性污泥的馴化。馴化過程共3 個(gè)階段（TDS 分別為2 000、4 500、7 000 mg/L），以出水COD、NH4+?N、TN 達(dá)標(biāo)且穩(wěn)定作為每個(gè)階段的馴化終點(diǎn)，考察TDS 對裝置出水水質(zhì)及活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)過程分3 個(gè)階段，各階段TDS 依次為2 000、4 500、7 000 mg/L；整個(gè)過程持續(xù)運(yùn)行38 d，平均各階段持續(xù)12~13 d。取各階段末期的活性污泥樣品，命名為H0、H1、H2、Q2（H 代表膜池樣品，Q 代表缺氧池樣品，樣品TDS 依次為2 000、4 500、7 000、7000 mg/L），樣品采集至無菌離心管后迅速置于?20 ℃冰箱中保藏。

1.3 DNA 提取/QC

用DNA 提取試劑盒從樣品中提取DNA，用Equalbit dsDNA HS Assay Kit 檢 測DNA 濃 度。

1.4 PCR 擴(kuò)增及高通量測序

以20~30 ng DNA 為模板，用金唯智設(shè)計(jì)的一系列PCR 引物擴(kuò)增原核生物16S rDNA 上包括V3 及V4 的2 個(gè)高度可變區(qū)。再通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭，以便進(jìn)行NGS 測序，用磁珠進(jìn)行文庫純化后通過酶標(biāo)儀檢測濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，用酶標(biāo)儀檢測文庫濃度。將文庫定量到10 nmol/L，按Illumina MiSeq/Novaseq（Illumina，San Diego，CA，USA）儀器使用說明書進(jìn)行PE250/FE300 雙 端 測 序，由MiSeq/Novaseq 自 帶 的MiSeq Control Software（MCS）/Novaseq Control Software（NCS）讀取序列信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

雙端測序得到的正反向reads 首先進(jìn)行兩兩拼接，過濾拼接結(jié)果中含有N 的序列，保留序列長度>200 bp 的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于OTU 聚類。使用VSEARCH（1.9.6）進(jìn)行序列聚類（序列相似性設(shè)為97%），比對的16S rRNA 參考數(shù)據(jù)庫為Silva 138。 用RDP classifier（Ribosomal Database Program）貝葉斯算法對OTU 的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。

基于OTU 得到分析結(jié)果，采用對樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽平的方法，分別計(jì)算Shannon、Chao1 等α多樣性指數(shù)以反映群落的物種豐度和多樣性，作Rarefaction 曲 線 和Rank?Abundance 曲 線 圖 反 映 物種豐富度和均勻度。

通過（un）weighted unifrac 分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異。PCoA 為展示β多樣性可視化圖，基于Brary?Curtis 樣本間距離矩陣。通過層次聚類中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA 聚類樹。

1.6 常規(guī)檢測項(xiàng)目

COD 采用重鉻酸鉀法測定；NH4+?N 采用納氏試劑分光光度法測定；TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定；污泥形態(tài)采用掃描電鏡（JSM?IT300LV）在5 000 倍下進(jìn)行觀察。

2 TDS 對活性污泥系統(tǒng)的影響

2.1 TDS 對活性污泥系統(tǒng)出水水質(zhì)的影響

耐鹽馴化期間裝置的進(jìn)出水水質(zhì)見圖2。

由圖2 可知，隨著進(jìn)水TDS 的增加，出水TN、NH4+?N、COD 均逐漸升高，去除率下降。進(jìn)水TDS為2 000 mg/L 時(shí)，出水COD、NH4+?N、TN 升高，但微生物較易適應(yīng)低濃度的TDS 環(huán)境，因此出水很快恢復(fù)至達(dá)標(biāo)水平；在進(jìn)水TDS 升至4 500 mg/L 的初始馴化階段，出水NH4+?N 與COD 不斷升高且持續(xù)8 d處于惡化狀態(tài)，說明微生物難以快速適應(yīng)此時(shí)的環(huán)境，8 d 后 出 水NH4+?N、COD 恢復(fù)至正常狀態(tài)。由圖2（c）可見出水TN 居高不下，有研究指出亞硝酸鹽氧化菌相較于氨氧化菌對鹽度更加敏感〔16〕，使得反硝化脫氮過程滯后于硝化過程，出水TN 達(dá)標(biāo)晚于NH4+?N 與COD。當(dāng)進(jìn)水TDS 升至7 000 mg/L 時(shí)，出水水質(zhì)雖有一定程度的波動(dòng)，但在馴化階段末期，出水TN、NH4+?N、COD 相比前2 個(gè)階段明顯降低，這可能是由于適當(dāng)提升進(jìn)水TDS 后，鹽離子脅迫刺激生物機(jī)制的應(yīng)激反應(yīng)，提高了系統(tǒng)內(nèi)微生物的耐受程度，優(yōu)化了裝置的運(yùn)行效果〔17〕。

圖2 耐鹽馴化期間裝置出水水質(zhì)變化情況Fig. 2 Changes of effluent quality during salt acclimation

2.2 TDS 對活性污泥形態(tài)的影響

馴化期間膜池活性污泥的微觀結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

由圖3 可見，培養(yǎng)初期污泥顆粒結(jié)構(gòu)松散，顆粒表面空隙較大，難以達(dá)到良好的出水效果。但經(jīng)過不斷的馴化培養(yǎng)及TDS 的提升，污泥最終由胞外聚合物緊緊黏結(jié)在一起，結(jié)構(gòu)緊湊，裝置出水各指標(biāo)均維持在較低的數(shù)值水平。

圖3 膜池活性污泥的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 3 Microstructure of activated sludge in MBR tank

3 細(xì)菌多樣性分析

按照97%相似性對unique 序列（重復(fù)次數(shù)>1）進(jìn)行OTU 聚類，在聚類過程中進(jìn)一步去除嵌合體序列，得到OTU 的代表序列，通過聚類得到2 068 個(gè)OTUs。為直觀展示活性污泥耐鹽性馴化過程中細(xì)菌OTU 的變化與聯(lián)系，對4 個(gè)活性污泥樣品作相似性Venn 分析，結(jié)果見圖4。

由圖4 可見，4 個(gè)樣品間共有OTU 為227 個(gè)，表明4 個(gè)菌群有一定的結(jié)構(gòu)相似性，其中H0 與H1 的重疊程度較高，而H0 與H2 的重疊程度較低，表明TDS 提升初期活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化并不明顯，但當(dāng)TDS 提升至一定程度時(shí)，污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化；H2 與Q2 同樣有著較高的重疊度，這可能是由于在活性污泥回流系統(tǒng)的作用下，Q2 中混入部分H2，導(dǎo)致兩者具有一定相似性。

圖4 Venn 圖Fig.4 Venn diagram

初始活性污泥中的特有OTU 共67 個(gè)，當(dāng)TDS 提升至4 500 mg/L 后特有OTU 降至37 個(gè)，當(dāng)TDS 進(jìn)一步提升至7 000 mg/L 后，特有OTU 僅為6 個(gè)，相同TDS 下缺氧池污泥樣品Q2 的特有OTU 也僅為10 個(gè)，說明提升TDS 對微生物菌群多樣性的影響顯著。對每個(gè)OTU選擇一條代表性序列，用RDP classifier 對代表性序列進(jìn)行物種分類注釋，從而得到每個(gè)樣本的群落組成，最終共注釋得到31 個(gè)門、265 個(gè)屬和218 個(gè)種水平的細(xì)菌。

為分析單個(gè)樣品內(nèi)部微生物群落中的物種多樣性，測定了4 個(gè)活性污泥樣品的多樣性指數(shù)，包括Ace 指數(shù)（估計(jì)群落中OTU 數(shù)目的指數(shù)）、Chao1 指數(shù)（評估物種豐度）、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)（反映樣本中微生物多樣性），結(jié)果見表1。

由表1 可以看出，與其他3 個(gè)樣品相比，H1 的物種豐富度和多樣性最為突出，可能是因?yàn)檫m當(dāng)提升鹽度比低鹽條件更利于微生物的繁殖，這與顏培等〔18〕的研究結(jié)果相似；而H2與Q2的各項(xiàng)指數(shù)偏低，也說明高TDS條件對微生物生長狀態(tài)的抑制作用較為明顯。

表1 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Alpha diversity index statistics

對樣本進(jìn)行PCoA 分析，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 PCoA 圖Fig.5 PCoA diagram

由圖5 可知，4 個(gè)污泥樣品之間是離散的，表明各組之間微生物群落結(jié)構(gòu)不同。樣本點(diǎn)之間的距離表示各個(gè)樣本的相似性及差異性，H2 與Q2 樣品在PC2 影響因素上距離相近，可能是由于在活性污泥回流系統(tǒng)的作用下Q2 中混入部分H2，導(dǎo)致兩者具有一定相似性；在兩類影響因素上與H0 和H1 距離較遠(yuǎn)，說明隨著TDS 的提高微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

4 微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性分析

4.1 門水平微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性分析

門水平下物種相對豐度如圖6 所示。

由圖6 可知，活性污泥中主要細(xì)菌門類共有5種，分別為Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bdellovibrionota（蛭弧菌門）、Nitrospirotae（硝化螺旋菌門），其中Pro?teobacteria 和Bacteroidota 為各樣品中的主要優(yōu)勢菌門。Proteobacteria 占比最大，為63.21%~75.98%，這與張?zhí)m河等〔19〕的研究發(fā)現(xiàn)相似，Jinchi YAO 等〔20〕還發(fā)現(xiàn)在高鹽環(huán)境下Proteobacteria 和Bacteroidota 對反硝化及COD 降解起到重要作用；而次優(yōu)勢菌門中Nitrospirotae 占 比 為3.05%~3.26%，Tongdou ZHU等〔21〕發(fā)現(xiàn)其在硝化作用中起關(guān)鍵作用，保證了活性污泥系統(tǒng)的硝化能力；其他2 個(gè)次優(yōu)勢菌門中，F(xiàn)irmicutes 大多可產(chǎn)生芽孢，能夠抵抗脫水和極端環(huán)境〔22〕，Bdellovibrionota 中的BeT/BeTs 基因可從海水或獵物細(xì)菌細(xì)胞中引入甜菜堿，抵抗高TDS 環(huán)境〔23〕，兩 者 的 物 種 豐 度 分 別可 達(dá)1.75%~3.51% 和1.08%~2.71%，能夠促進(jìn)高鹽環(huán)境下活性污泥系統(tǒng)對污染物的去除。

圖6 門水平下物種相對豐度Fig.6 Relative abundance of species at phylum level

隨著TDS 的提升，Proteobacteria、Bacteroidota 的相對豐度變化差異較小，始終占據(jù)優(yōu)勢菌門的地位，而次優(yōu)勢菌門Nitrospirotae、Firmicutes（厚壁菌門）與Bdellovibrionota 的相對豐度有所提高，保證了高TDS環(huán)境下A2/O-MBR 工藝良好的降解有機(jī)物能力與脫氮能力。

4.2 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性分析

屬水平下物種相對豐度如圖7 所示。

圖7 屬水平下物種相對豐度Fig.7 Species relative abundance at genus level

由圖7 可見，H0 中Arenimonas（砂單胞菌屬）作為需氧細(xì)菌菌屬，可以降解各種糖和氨基酸〔24〕，有個(gè)別菌株含有反硝化作用的關(guān)鍵酶〔25〕，Thiobacillus（硫桿菌屬）能夠進(jìn)行自養(yǎng)反硝化作用〔26〕，這2 種優(yōu)勢菌屬在初期可以保證整個(gè)活性污泥系統(tǒng)的脫氮能力及降解污染物的能力。當(dāng)TDS 提升至4 000 mg/L 時(shí)，2 種菌屬的生長受到抑制，Hydrogenophaga（噬氫菌屬）占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度最高達(dá)到15.6%，在此馴化階段出水TN持續(xù)降低，可能是由于Hydrogenophaga參與了同步硝化-反硝化過程〔27〕。當(dāng)TDS 為7 000 mg/L 時(shí)，原優(yōu)勢菌屬逐漸被Thauera（陶氏菌屬）和Rheinheimera（萊茵海默氏菌屬）取代，Thauera物種豐度由0.12%快速增加至12.08%，Rheinheimera物種豐度由1.28%增加至7.23%。Thauera可降解的污染物廣泛，有利于污水中污染物的去除〔28〕，且有研究發(fā)現(xiàn)Thauera與Rheinheimera在高鹽環(huán)境下仍可保持良好的脫氮及降低COD 的能力〔29?30〕。缺氧池作為整個(gè)工藝的核心脫氮反應(yīng)段，其對應(yīng)樣品Q2中的Thauera相對豐度占比最高（21.03%），這也是污泥馴化末期裝置出水達(dá)標(biāo)的主要原因。具有脫氯能力的次優(yōu)勢菌屬Dechloromonas（脫氯菌屬）在氯離子不斷提高的情況下，相對豐度由1.03%增加至2.54%，促進(jìn)了系統(tǒng)的硝化能力，NS9_marine_group 菌屬因其較高的抗逆性〔31〕，相對豐度由0.73% 增至3.97%。次優(yōu)勢菌屬的演替再次驗(yàn)證了最后階段的良好出水水質(zhì)狀態(tài)；在整個(gè)耐鹽活性污泥馴化及高鹽廢水處理過程中，系統(tǒng)功能菌種類豐度增加，處理能力得以增強(qiáng)。

5 結(jié)論

（1）耐鹽活性污泥馴化期間微生物群落多樣性與裝置處理廢水的性能變化顯著。TDS 為2 000 mg/L 時(shí)A2/O-MBR 裝置運(yùn)行效果良好，出水各項(xiàng)指標(biāo)波動(dòng)較??；隨著進(jìn)水TDS 提升至4 500 mg/L，活性污泥的反硝化作用和COD 降解能力大幅削弱，裝置出水COD、TN居高不下，但Venn 圖、Alpha 多樣性指數(shù)、PCoA 分析顯示此階段末期微生物群落的豐富度與多樣性有所提高，裝置出水最終可恢復(fù)正常；當(dāng)進(jìn)水TDS 提升至7 000 mg/L 后，微生物群落多樣性顯著降低，出水水質(zhì)出現(xiàn)大范圍波動(dòng)，但系統(tǒng)內(nèi)的微生物受鹽離子脅迫刺激對鹽耐受程度提高，裝置的運(yùn)行效果有所提升，最終各階段出水的TN、NH4+?N、COD 均優(yōu)于《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（DB 12/356—2018）要求。

（2）在耐鹽活性污泥馴化期間，初始優(yōu)勢菌屬Arenimonas（砂單胞菌屬）與Thiobacillus（硫桿菌屬）的優(yōu)勢地位逐漸被Dechloromonas（脫氯菌屬）、Thauera（陶氏菌屬）與Rheinheimera（萊茵海默氏菌屬）等菌屬取代，由于三者能夠共同完成硝化、反硝化及降解COD 過程，保證了高TDS 環(huán)境下裝置對污染物的去除能力和脫氮能力，為含鹽廢水處理過程中菌群的優(yōu)化提供了依據(jù)。