周亞楠， 夏洪澤， 劉書杰， 孫 璐， 崔占鴻*， 周 磊， 周玉青

(1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2. 青海省牦牛工程技術(shù)研究中心， 青海 西寧 810016； 3. 青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810016； 4. 海北藏族自治州高原生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園管委會(huì)，青海 海晏 810016)

牦牛是青藏高原地區(qū)特有的家畜品種，是青藏地區(qū)牧民主要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一[1]。牦牛日糧干物質(zhì)中碳水化合物占比為60%～70%，牦牛生長(zhǎng)及瘤胃微生物所需要的能量主要由碳水化合物提供[2]。目前已知的康奈爾凈碳水化合物-凈蛋白質(zhì)(Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS)體系主要反映飼料中碳水化合物的特性；在其基礎(chǔ)上研究的碳水化合物平衡指數(shù)(Carbohydrate balance index，CBI)是衡量日糧中碳水化合物組成的重要營(yíng)養(yǎng)學(xué)指標(biāo)，碳水化合物平衡指數(shù)的概念是由徐明、姚軍虎等[3]通過(guò)對(duì)大量試驗(yàn)的回歸首先提出的，由物理有效中性洗滌纖維(Physically effective neutral detergent fiber,pe NDF)和瘤胃可降解淀粉(Rumen degradable starch，RDS)兩個(gè)主要因素組成。pe NDF是由Mertens等[4]整合了日糧化學(xué)成分(NDF含量)與結(jié)構(gòu)特征(飼料粒度)提出的。尋找pe NDF與快速降解碳水化合物之間的平衡對(duì)維持瘤胃正常代謝和提高牦牛生產(chǎn)性能具有重要意義，但過(guò)多的日糧纖維會(huì)造成動(dòng)物挑食行為和降低飼料利用效率[4]。RDS是快速降解的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，可充分反映瘤胃內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解和利用情況[6-7]。

近年來(lái)，日糧CBI這一概念逐漸被研究者們所重視，并進(jìn)行了一些相關(guān)研究。Zebili[8]分析了RDS與pe NDF在高產(chǎn)奶牛瘤胃發(fā)酵和生產(chǎn)性能上的交互作用，指出為保證動(dòng)物健康與生產(chǎn)性能，在配置奶牛日糧時(shí)要盡量避免CBI值小于1.45。Li等[8]通過(guò)用小麥代替玉米的方法，提出奶山羊的適宜CBI值為1.43。徐進(jìn)昊等[10]利用CBI對(duì)荷斯坦后備母牛飼糧中碳水化合物結(jié)構(gòu)及其營(yíng)養(yǎng)平衡參數(shù)進(jìn)行探究。所以，采用CBI指標(biāo)優(yōu)化反芻動(dòng)物日糧碳水化合物組成是提高日糧利用率的重要營(yíng)養(yǎng)學(xué)手段[11]。本研究采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)對(duì)日糧消化率、牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定，獲得牦牛日糧碳水化合物組成優(yōu)化的營(yíng)養(yǎng)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，為舍飼條件下牦牛日糧的碳水化合物營(yíng)養(yǎng)高效利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取3頭體重相近(280.0±15.0) kg的2.5歲并帶有瘤胃瘺管的牦牛。試驗(yàn)牦牛飼養(yǎng)于青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)代謝基地，采用3×3拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示，飼喂3個(gè)處理組的日糧，各處理組的試驗(yàn)牦牛采食量相等，每日兩次飼喂(早上8：00和晚上5：00)，自由飲水，試驗(yàn)共進(jìn)行3期，每期試驗(yàn)包括3周預(yù)飼期和1周試驗(yàn)期，試驗(yàn)期第1天為牦牛適應(yīng)期，觀察適應(yīng)情況，從第2天開(kāi)始為期5天的正式消化試驗(yàn)。

表1 拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 3×3 Latin square design

1.2 試驗(yàn)日糧

CBI參考徐明[3]推薦的計(jì)算方法，各試驗(yàn)日糧的碳水化合物平衡指數(shù)見(jiàn)表2，日糧組成及其營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表3，具體計(jì)算方法如下所示。(1)peNDF的測(cè)定：peNDF=NDF×pef；pef=pefL×pefF；pefL=1.4a+1.1b+0.7c；pefF=NDF/50；(2)RDS的測(cè)定：RDS=飼料中淀粉含量×淀粉的瘤胃降解率(Rd)；(3)CBI的計(jì)算：CBI=peNDF/RDS。

表2 各試驗(yàn)日糧的碳水化合物平衡指數(shù)Table 2 Carbohydrate balance index of each test diet

表3 日糧組成及其營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis)

pef為物理有效因子，pefL和pefF分別為長(zhǎng)度有效因子和韌度有效因子；a，b和c分別為賓夕法尼亞粗飼料分級(jí)篩 19 mm，8 mm和 1.18 mm篩上存留物占總樣品重的百分比；Rd計(jì)算公式為:Rd(%)=71.142-1.987SI(n=40，R2=0.093，P=0.056)；其中SI為淀粉采食量(kg·d-1)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與測(cè)定方法

1.3.1瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 瘤胃液采集：每個(gè)試驗(yàn)期最后一天于晨飼2 h后，采集瘤胃液樣品。使用日本產(chǎn)的外套不銹鋼彈簧內(nèi)部為乳膠管的采樣管清洗干凈從瘺管放入，使用150 mL大型注射器抽取瘤胃液，前兩管均舍棄，使用瘤胃液潤(rùn)洗管壁，避免管壁內(nèi)殘留的水對(duì)樣品產(chǎn)生干擾，保證樣品的無(wú)誤性。采集完畢后，緩慢將采樣管抽出，并放入蒸餾水中再次清洗備用。隨后立刻將注射器中的瘤胃液轉(zhuǎn)移編好號(hào)的15 mL離心管中，分裝10管，采集的瘤胃液應(yīng)當(dāng)立即測(cè)定pH值，帶回實(shí)驗(yàn)室后—20℃條件下保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定瘤胃液發(fā)酵參數(shù)。

pH值測(cè)定：采用HANNA HI221型臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)定瘤胃液pH值。氨態(tài)氮(NH3-N)濃度測(cè)定：采用馮宗慈[12]改進(jìn)的比色法測(cè)定NH3-N含量，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810)，在波長(zhǎng)625 nm處測(cè)定溶液吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品的NH3-N濃度。微生物蛋白(Microbial proteins，MCP)含量測(cè)定：依據(jù)Wang[13]差速離心法，對(duì)微生物進(jìn)行分離，將分離出的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至消化管中，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acids，VFA)濃度的測(cè)定：參考曹慶云等[14]，VFA采用氣相色譜儀(日本島津GC-2014)進(jìn)行測(cè)定，氣相色譜條件為：載氣為N2，分流比 40∶1，進(jìn)樣量 1 μL，進(jìn)樣孔溫度為250℃，輔助箱溫度為250℃，氣化室溫度為250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為250℃，色譜柱型號(hào)為AT-FFAP毛細(xì)管填充柱(30.0 m×0.32 μm)。恒流模式，流量 2.1 mL·min-1，平均線速度 38 cm·sec-1，柱壓 11.3 psi(0.1 Mpa)。

1.3.2血清生化指標(biāo)測(cè)定 每期試驗(yàn)結(jié)束后，使用真空采血管從牦牛頸靜脈采血5 mL，在離心機(jī)中離心10 min(4 000 r·min-1)，取上層血清于凍存管中，將采集的血清保存于超低溫冰箱(—80℃)中待測(cè)。

血清生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutathione aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutathione aminotransferase，AST)、總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、球蛋白(Globulin，GLB)、尿素氮(Urea nitrogen，BUN)、葡萄糖(Glucose，GLU)、甘油三酯(Triglycerides，TG)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)等。

1.3.3養(yǎng)分表觀消化率測(cè)定 正式飼養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，試驗(yàn)期為第22～28天，每天收集各組日糧，一期下來(lái)將各組原料混合均勻于65℃烘干并粉碎過(guò)1 mm篩網(wǎng)，封袋編號(hào)備用。

糞樣采集：采用全收糞法，準(zhǔn)確記錄每期各日糧組每天總排糞量?；玖鞒虨椋好刻煸缟巷曃骨皩?duì)糞進(jìn)行稱重，隨后進(jìn)行混勻糞樣并取其總鮮重的10%，按照每100 g糞樣加20 mL濃度為10%的H2SO4使其pH降低至3以下，對(duì)糞樣進(jìn)行固氮，封袋編號(hào)。隨后將3組每天糞樣歸攏到1個(gè)大自封袋中貯存在-20℃的冰箱中，在每期全部收集好糞樣后，按照各處理組進(jìn)行混合均勻，分別作為每期各處理組的樣本分析。隨后取出部分混合樣置干燥的托盤中放入65℃烘箱，持續(xù)72 h烘干至恒重測(cè)定其初水分，室溫回潮，粉碎過(guò)1 mm篩網(wǎng)，封袋編號(hào)備用。

按照Van[15]方法去測(cè)定干物質(zhì)消化率(Dry matter digestibility，DMD)、蛋白質(zhì)消化率(Crude protein digestibility，CPD)、脂肪消化率(Ether extract digestibility，EED)、中性洗滌纖維消化率(Neutral detergent fiber digestibility，NDFD)、酸性洗滌纖維消化率(Acid detergent fiber digestibility，ADFD)；淀粉消化率(Starch digestibility，StarchD)的計(jì)算公式：日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)全腸道表觀消化率=(食入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量—糞中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量)/食入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2016初步處理后，再經(jīng)SPSS 20.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析。以P<0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，差異顯著時(shí)，采用Duncan氏SSR法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同CBI日糧對(duì)牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，不同CBI牦牛日糧pH值、NH3-N含量、MCP含量、乙酸含量、丙酸含量、丁酸含量、總揮發(fā)性脂肪酸含量、乙丙比均差異不顯著。但NH3-N、MCP含量隨著CBI的升高有降低的趨勢(shì)；CBI=2.45處理的乙酸、丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸含量以及乙丙比略高于CBI=1.17和CBI=5.67處理。

表4 不同碳水化合物平衡指數(shù)日糧對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 The effect of diets with different CBI on rumen fermentation parameters

2.2 不同CBI日糧對(duì)牦牛血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，不同CBI日糧的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、堿性磷酸酶(ALP)均差異不顯著；CBI=1.17與CBI=5.67牦牛日糧的ALB/GLB差異不顯著，但均顯著高于CBI=2.45的牦牛日糧(P<0.05)。

表5 不同碳水化合物平衡指數(shù)日糧對(duì)牦牛血清生化指標(biāo)的影響Table 5 The effect of diets with different CBI on serum biochemical index of yak

2.3 不同CBI日糧的牦牛養(yǎng)分表觀消化率

由表6可知，牦牛日糧CBI=2.45水平下DMD，CPD顯著高于CBI=1.17和CBI=5.67(P<0.05)，且DMD，CPD隨著CBI的升高有降低的趨勢(shì)；CBI=2.45與CBI=5.67牦牛日糧的NDFD差異不顯著，但均顯著高于CBI=1.17的牦牛日糧(P<0.05)，且隨著CBI升高呈現(xiàn)先升高再穩(wěn)定的趨勢(shì)；不同CBI日糧的EED，ADFD，Starch D差異不顯著。

表6 不同碳水化合物平衡指數(shù)日糧的養(yǎng)分表觀消化率Table 6 Apparent nutrient digestibility of diets with different carbohydrate balance index

3 討論

3.1 不同CBI日糧對(duì)牦牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH值是評(píng)價(jià)瘤胃功能穩(wěn)定的重要指標(biāo)[16]，可綜合反映瘤胃微生物活動(dòng)情況，也可反應(yīng)有機(jī)酸生成狀況[17]。已有研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃液的pH正常變化范圍為6.0～7.5[18-19]，故本試驗(yàn)pH值(6.67～6.72)結(jié)果合理，均在正常范圍內(nèi)。MCP是瘤胃微生物主要的氮源，而NH3-N濃度又是限制MCP合成的重要因素，NH3-N濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)限制微生物生長(zhǎng)[20]。Owens[21]、Schaefer[22]和Petersen[23]等報(bào)道指出，MCP合成所需的NH3-N濃度為0.35～29 mg·dL-1，本試驗(yàn)的NH3-N濃度范圍為11.80～12.97 mg·dL-1，足以滿足瘤胃微生物生長(zhǎng)的需要。VFA是反芻動(dòng)物瘤胃代謝最為關(guān)鍵的一部分，為機(jī)體提供了總能量需要的70%～80%[24-27]，VFA中乙酸、丙酸和丁酸占TVFA含量95%左右[28]。本試驗(yàn)中各處理組的乙酸濃度均高于丙酸濃度，一系列研究表明本試驗(yàn)中pH均處于正常范圍，瘤胃處于正常發(fā)酵狀態(tài)，且這一結(jié)果與Murphy等[29]的研究結(jié)果相一致。CBI=2.45處理的乙酸、丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸含量以及乙丙比略高于CBI=1.17和CBI=5.67處理，且瘤胃pH值在三組間處于適宜水平，說(shuō)明調(diào)整粗飼料CBI至2.45時(shí)，能夠促進(jìn)牦牛反芻咀嚼，維持瘤胃內(nèi)環(huán)境不偏向酸性，穩(wěn)定了乙酸的形成，從而正向調(diào)控瘤胃消化。整體而言，日糧水平為CBI=2.45時(shí)牦牛的瘤胃發(fā)酵效果略好。

3.2 不同CBI日糧對(duì)牦牛血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可以很好的體現(xiàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)攝入狀況[30]。其中GLU和TG是反應(yīng)機(jī)體能量代謝與脂代謝情況的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中飼喂不同水平CBI日糧的牦牛血清中的GLU，TG差異不顯著，這與各日糧脂肪消化率的結(jié)果一致。血清中TP由ALB和GLB組成，其含量能夠反應(yīng)蛋白質(zhì)合成與分解速率，血清中BUN含量是反應(yīng)動(dòng)物體氮代謝平衡的重要指標(biāo)，尿素氮是衡量體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝狀況的指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在日糧CP水平一致的情況下，各CBI處理組血液中TP,BUN,ALB,GLB均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本試驗(yàn)中日糧CBI水平的改變，TP,BUN,ALB,GLB盡管有不同程度的差異，但不足以引起血液中這些指標(biāo)的變化。這一結(jié)果與周明[31]、信富鈺[32]研究結(jié)果基本一致。血液中ALT,AST和ALP在機(jī)體代謝中具有重要作用，在正常范圍內(nèi)，這3種轉(zhuǎn)氨酶對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝加強(qiáng)時(shí)，三種轉(zhuǎn)氨酶的活性會(huì)升高。本試驗(yàn)中ALT,AST和ALP差異不顯著，可能是由于各CBI日糧的纖維消化率變化不明顯，從而導(dǎo)致瘤胃排空速率基本一致，使進(jìn)入小腸中的食糜量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為一致，進(jìn)入血液和肝臟中的氨基酸活性無(wú)差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶活性變化不明顯，這一結(jié)果與任春燕[28]研究結(jié)果相似，低CBI日糧不利于瘤胃微生物對(duì)NDF的利用。

3.3 不同CBI日糧對(duì)牦牛營(yíng)養(yǎng)表觀消化率的影響

在干物質(zhì)采食量相同的條件下，隨著日糧CBI的升高，DMD呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，原因可能與瘤胃微生物缺乏能量，生長(zhǎng)受阻有關(guān)。Zebeli[33]研究得出，隨玉米青貯中pe NDF水平的增加，DMD都出現(xiàn)先上升后下降的2次曲線變化，這與本試驗(yàn)得出結(jié)果相似。有大量研究表明，合理的日糧組成，可提高瘤胃降解淀粉，可降低瘤胃NDFD[14，33-38]；因此，改變FNDF/RDS可影響NDFD。上述試驗(yàn)與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，瘤胃NDFD隨CBI(pe NDF/RDS)的升高呈升高的趨勢(shì)，低CBI日糧不利于瘤胃微生物對(duì)NDF的利用。

4 結(jié)論

綜合日糧的表觀消化率、牦牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)和血清生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：CBI=2.45的日糧優(yōu)于CBI=1.17，5.67的日糧，更有利于其瘤胃發(fā)酵和養(yǎng)分消化利用，為舍飼牦牛日糧營(yíng)養(yǎng)優(yōu)化供給提供了重要參考。