曾志君，楊 敏，郭明天，盧 贊，董桂瓊，陳會(huì)超，孫鵬艷，陳 敏，楊 莉

（1.云南省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；3.昆明市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650011；4.昆明市官渡區(qū)人民醫(yī)院，云南 昆明 650220）

淋病是由淋病奈瑟球菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)淋球菌）感染引起的一種性傳播疾病。2020 年我國(guó)淋病報(bào)告的發(fā)病數(shù)為105160 例，位居法定報(bào)告乙類(lèi)傳染病的第4 位，發(fā)病率為7.4909 例/10 萬(wàn)人［1］。云南省近年來(lái)淋病發(fā)病率持續(xù)上升［2］，2020 年的發(fā)病率達(dá)14.0274/10 萬(wàn)，遠(yuǎn)高于全國(guó)水平。目前抗菌藥物治療是控制淋病最直接和有效的手段，然而抗生素的濫用導(dǎo)致了耐藥淋球菌不斷出現(xiàn)并流行傳播［3］，對(duì)有效控制淋病的流行造成了嚴(yán)重的威脅。我國(guó)早在1987 年就建立了以實(shí)驗(yàn)室為基礎(chǔ)的淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，而云南省淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)工作起步較晚，2018 年才開(kāi)始在昆明市試點(diǎn)開(kāi)展該項(xiàng)工作。本文對(duì)2018 ～2020 年昆明市淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)工作中收集的臨床分離株進(jìn)行了藥物敏感性檢測(cè)，對(duì)耐藥情況進(jìn)行了分析，為本地淋病臨床治療用藥及淋病的防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2018～2020 年在云南省昆明市6 家淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)收集的422 株淋球菌。所有菌株經(jīng)鑒定后挑取單菌落，傳代一次，洗脫于10%脫脂牛奶中，-70℃保存。標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心性病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑和設(shè)備 抗生素：青霉素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、大觀霉素、四環(huán)素，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心性病參比實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基制備原料：GC 基礎(chǔ)粉培養(yǎng)基、血紅蛋白、生長(zhǎng)添加劑Vitox（均來(lái)自英國(guó)OXOID 公司），無(wú)菌脫纖維綿羊血（來(lái)自南京便診公司）。菌懸液濃度測(cè)定儀器：分光光度計(jì)（Bio Rad）。

1.2 方法

1.2.1 MIC 的測(cè)定 采用世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［4］，以WHO P、G、J、L、P 和ATCC49226標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株。各抗菌藥物的工作濃度分別為：青霉素和環(huán)丙沙星0.015 ～8 mg/L，大觀霉素1 ～128 mg/L，阿奇霉素0.03 ～8 mg/L，頭孢曲松和頭孢克肟0.008 ～1 mg/L，四環(huán)素0.5 ～16 mg/L。

1.2.2 結(jié)果的判定 參考WHO 西太區(qū)淋球菌抗菌藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)： 青霉素MIC ≤0.06 mg/L 為敏感，0.12 ≤MIC ≤1 mg/L 為中介，MIC ≥2 mg/L 為耐藥；環(huán)丙沙星MIC ≤0.06 mg/L 為敏感，0.12 ≤MIC ≤0.5 mg/L 為中介，MIC ≥1 mg/L 為耐藥；阿奇霉素 MIC ≤0.25 mg/L 為敏感，MIC=0.5 mg/L 為中介，MIC ≥1 mg/L 為耐藥；頭孢曲松MIC ＜0.125 mg/L 為敏感，MIC ≥0.125 mg/L 為低敏；頭孢克肟MIC ＜0.25 mg/L 為敏感，MIC ≥0.25 mg/L 為低敏；大觀霉素MIC ≤32 mg/L 為敏感，MIC =64 mg/L 為中介，MIC ≥128 mg/L 為耐藥；四環(huán)素MIC ≤0.05 mg/L 為敏感，MIC ≥1 mg/L 為耐藥，MIC ≥16 mg/L 判定為質(zhì)粒介導(dǎo)的高度耐四環(huán)素淋球菌（Plasmidmediated Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae ，TRNG）。

1.2.3 紙片酸度法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶 采用紙片酸度法測(cè)定菌株是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。取pH 8.0 的0.05 mol/L 的磷酸緩沖液100 mL，加入0.2 g 溴甲酚紫，充分溶解混勻后，取10 mL 溴甲酚紫磷酸緩沖液，加入注射用青霉素鈉80 萬(wàn)單位。將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在滴有上述青霉素溶液的濾紙上，涂膜直徑約5mm，室溫孵育10min 觀察顏色變化。結(jié)果判讀：變成黃色即為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，可判定該菌株為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶淋球菌（Penicillinase Producing Neisseria gonorrhoea ，PPNG）；顏色無(wú)變化則為陰性，可判定該菌株非產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶淋珠菌。每次試驗(yàn)以WHO J 標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性對(duì)照，WHO L 標(biāo)準(zhǔn)株作為陰性對(duì)照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用Excel 2016 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄和匯總，用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一藥物3 年間的耐藥率、低敏率等計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPNG 和TRNG 的檢出情況 422 株淋球菌中檢出PPNG 282 株（66.82%），TRNG 181 株（42.89%）。2018、2019、2020 年P(guān)PNG 檢 出 率 分 別 為66.67%（50/75）、68.63%（105/153）、65.46%（127/194），3 年間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.387，P ＞0.05）。TRNG 檢 出 率 分 別 為44.00%（33/75）、46.41%（71/153）、38.46%（80/194），3 年間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.620，P ＞0.05）。

2.2 淋球菌對(duì)7 種藥物的敏感性及MIC 分布 2018 ～2020 年分別收集淋球菌75、153 和194 株，合計(jì)422株。422 株淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素和阿奇霉素的耐藥率分別為99.76%（421/422）、89.81%（379/422）、73.70%（311/422）、10.09%（46/422）。雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但阿奇霉素耐藥率有上升的趨勢(shì)，由2018 年的4%（3/75）上升到2020 年的13.92%（27/194）。對(duì)頭孢曲松和頭孢克肟低敏的菌株分別占5.21%（22/422）和6.64%（28/422），未發(fā)現(xiàn)對(duì)大觀霉素耐藥的菌株。422 株淋球菌的耐藥率及MIC 值分布情況分別見(jiàn)表1、表2。

表1 422 株淋球菌對(duì)7 種藥物的敏感情況［n（%）］

表2 422 株淋球菌對(duì)7 種抗菌藥物的MIC 分布情況（單位：株）

2.3 多重耐藥情況 422 株淋球菌中發(fā)現(xiàn)了多重耐藥情況（同時(shí)對(duì)2 種及以上抗生素耐藥），由于有421株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，1 株對(duì)環(huán)丙沙星敏感，且該菌株對(duì)其他6 種抗生素也均敏感，因此在分析多重耐藥情況時(shí)采用了3 種及以上的藥物組合，分析得到4 種組合模式（表3）。2018 ～2020 年間4 種多重耐藥組合模式的耐藥率均有所上升，其中環(huán)丙沙星+阿奇霉素+四環(huán)素這一組合3 年間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.047，P ＜0.05），2018 ～2020 年這一組合的耐藥率有上升趨勢(shì)（趨勢(shì)χ2=6.312，P=0.012）。此外，發(fā)現(xiàn)6 株（1.42%）對(duì)阿奇霉素耐藥，同時(shí)對(duì)頭孢曲松低敏的菌株，2018、2019 年各1 株，2020年4 株，其中2019 和2020 年的5 株還同時(shí)對(duì)頭孢克肟低敏。

表3 422 株淋球菌的多重耐藥情況 ［n（%）］

3 討論

淋球菌對(duì)抗菌藥物敏感性的降低為淋病的防治工作帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，而持續(xù)的耐藥監(jiān)測(cè)對(duì)未來(lái)淋球菌治療用藥的選擇具有重要參考意義。

本研究發(fā)現(xiàn)2018 ～2020 昆明市淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率已高達(dá)99.76%，與國(guó)內(nèi)多地耐藥情況相似［5-9］。昆明市淋球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為89.81%，且3 年間耐藥率較為穩(wěn)定，維持在89.54%～90.67%之間，相比江蘇?。?00%）和東莞市（95%）要稍低，但TRNG（42.89%）檢出率比這兩地要高［5，6］，與2018 年浙江省的情況較接近［7］。昆明市淋球菌對(duì)青霉素的3 年總耐藥率為73.70%，敏感率僅為0.71%，耐藥率與江蘇省及廣東省東莞市的報(bào)道接近［5，6］。PPNG 的檢出率為66.82%，高于國(guó)內(nèi)多地［5-11］。在云南省昆明市，淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素高度耐藥，因此，這些藥物已不適用于本地淋病的臨床治療。

阿奇霉素是目前歐美淋病診療指南唯一建議使用的口服藥物，但目前多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)阿奇霉素的藥物敏感性一直在降低［12-16］，而我國(guó)阿奇霉素的耐藥率也由2008 年之前的2.0%上升到2016 年的20.8%［17，18］。本研究中，2018 ～2020 年阿奇霉素的耐藥率分別為4.00%、10.46%、13.92%，有上升的趨勢(shì)，包括阿奇霉素的多重耐藥組合的耐藥率均有上升的趨勢(shì)，特別是“環(huán)丙沙星+阿奇霉素+四環(huán)素”這一組的上升具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)WHO 規(guī)定，當(dāng)某種抗菌藥物的耐藥率＞10%時(shí)，應(yīng)停止使用［7］，因此昆明市已不適合將阿奇霉素單獨(dú)作為淋病的治療藥物使用。

在本研究中的422 株淋球菌中未發(fā)現(xiàn)對(duì)大觀霉素的耐藥菌株。頭孢曲松和頭孢克肟低敏率均已超過(guò)了5%，與廣東東莞接近［5］。此外，我國(guó)已有部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)淋球菌對(duì)頭孢曲松和頭孢克肟的低敏率在升高［19］，長(zhǎng)沙市在2008 之前未發(fā)現(xiàn)頭孢曲松的低敏菌株，到2015 年低敏率增長(zhǎng)到了11.9%［20］，廣州市某機(jī)構(gòu)報(bào)道2019 年廣州市頭孢曲松和頭孢克肟的低敏率已分別達(dá)22%和19%［8］。盡管目前監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，在昆明市大觀霉素、頭孢曲松和頭孢克肟藥物敏感性在90%以上，但在3 年間發(fā)現(xiàn)了10 株對(duì)頭孢曲松MIC ≥0.5mg/L 的菌株，因此要引起重視，并有必要通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)其基因型別及傳播途徑進(jìn)行探究。

淋球菌的多重耐藥性受到了較多的關(guān)注［6，12，21，22］。雖然本研究分析得到的幾種多重耐藥組合中的藥物已經(jīng)不作為一線治療藥物，但令人擔(dān)憂的是發(fā)現(xiàn)了6株（1.42%）同時(shí)對(duì)阿奇霉素耐藥且對(duì)頭孢曲松敏低敏的菌株，其中的5 株還同時(shí)對(duì)頭孢克肟低敏。近年來(lái)在荷蘭、美國(guó)、英國(guó)以及我國(guó)部分地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了對(duì)阿奇霉素耐藥同時(shí)對(duì)頭孢曲松低敏的菌株［19，23-26］，中國(guó)淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)2013 ～2016 年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)阿奇霉素耐藥同時(shí)對(duì)頭孢曲松低敏的淋球菌菌株比例為2.3%，并從2013 年的1.9%上升到2016 年的3.3%［18］，此外，在我國(guó)浙江分離到了同時(shí)對(duì)大觀霉素和其他多種抗生素高度耐藥的菌株［27］。由于目前多個(gè)國(guó)家采用阿奇霉素和頭孢曲松聯(lián)合用藥的治療方案，而大觀霉素和頭孢曲松又是我國(guó)推薦的一線治療藥物［28］，多重耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)給國(guó)內(nèi)外淋病治療方案帶來(lái)了極大的威脅和挑戰(zhàn)。

昆明市2018 ～2020 年淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：422 株淋球菌對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥水平極高，對(duì)阿奇霉素的耐藥率超過(guò)10%，這些藥物已不適用于本地淋病的臨床治療；422 株淋球菌對(duì)大觀霉素、頭孢曲松和頭孢克肟的敏感性較好，這些藥物可作為首選治療藥物；此外，出現(xiàn)了阿奇霉素耐藥同時(shí)對(duì)頭孢曲松及頭孢克肟低敏的菌株，需引起重視。昆明市開(kāi)展淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)工作的時(shí)間較短，還需持續(xù)進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè)，不斷擴(kuò)大耐藥監(jiān)測(cè)范圍，豐富耐藥監(jiān)測(cè)方法，為將來(lái)淋病的臨床治療和防控工作提供更加全面、科學(xué)的依據(jù)。